פרוצדורה כדי לחקור את ההשפעה של הגבלת מזון ממושכת בהרואין מחפש אצל חולדות מתנזרות
11 בנובמבר 2013
הליך המאפשר הדגמה של הגדלת החזקה של סמים המבקשים בחולדות מוגבלות מזון מתואר. לאחר אימון הרואין מנהל עצמי, חולדות לעבור תקופת התנזרות, בסביבה נקיה מסמים, שבמהלכו הם אסירי מזון מוגבל. מבקשי תרופה נבדקו ולאחר מכן בסביבה הקשורים בסמים.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבחון את ההשפעות של מניפולציות סביבתיות, כגון הגבלה כרונית של מזון, על חזרת נסיגה (relapse) לחיפוש הרואין בחולדות מעבדה תחת תנאי גמילה. מטרה זו מושגת תחילה על ידי השתלה כירורגית של קטטר תו-ורידי בווריד הג'וגולרי של החולדה, כדי לאפשר מתן עצמי של הרואין לאחר תקופת התאוששות. החולדות עוברות אימון למתן עצמי של הרואין בתאי התנייה אופרנטית למשך תקופה של 10 ימים.
השלב הבא של הפרוצדורה הוא שלב ההימנעות, שבו החולדות מועברות למתקן בעלי החיים ונחשפות לתקופה של גישה מוגבלת או בלתי מוגבלת למזון. לבסוף, החולדות מוחזרות לתאי ההתניה האופרנטית כדי לעבור מבחן חיפוש הרואין, שבו תגובות במנוף הפגום מההרואין גורמות להפעלת רמז, אור וצליל, ללא מתן הרואין. בסופו של דבר, חולדות עם הגבלה תזונתית כרונית ובעלות היסטוריה של ניהול עצמי של הרואין יפגינו עלייה משמעותית בחיפוש הרואין בתנאי גמילה, כתוצאה מחשיפה מחודשת לסביבת נטילת הסם ולרמזים הקשורים לסם.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון הליך השחזור (reinstatement procedure), הוא היעדרה של הכחדה תנאילית מפורשת, שאינה נצפית במצב האנושי. יתרה מכך, השימוש במניפולציות כרוניות לעומת חריפות מאפשר תוקף מבנה גבוה יותר ביחס למצב האנושי. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום התמכרויות לסמים, כגון המנגנונים הנוירולוגיים המשותפים העומדים בבסיס התנהגויות חיפוש סמים ומזון.
קטטרים מוכנים בכמויות גדולות ומעוקרים באוטוקלאב לשימוש לאורך תקופה ממושכת. כדי להכין קטטר, ראשית גזרו צינור גמיש לחתיכות באורך 12 סנטימטרים. השתמשו בקיסם או במחט במידה 18 כדי להניח טיפה קטנה של סיליקון מסביב לקטטר, במרחק של שלושה סנטימטרים מהקצה.
הניחו לסיליקון להתייבש במשך 24 שעות לפני העיקור באוטוקלאב; כופפו את הצינור הארוך של קנולת ה-five up, שתשמש כמחבר, לזווית ישרה ביחס למעמד הפלסטיק לפני העיקור באוטוקלאב. כדי להרכיב את הקטטרים ביום הניתוח, דחפו את הצד הארוך של צינור ה-scholastic מעל הצינור המתכתי הכפוף של קנולת ה-five up, עד למחצית הדרך למעמד הפלסטיק. חברו את צינור ה-five up באמצעות צינור tigon ומחט 22 gauge למזרק של 1 mL מלא בתמיסת סליין סטרילית.
שטפו תמיסת סליין דרך הקטטר כדי להבטיח זרימה ללא חסמים. לתחילת התהליך, הרדימו את בעל החיים לפני גילוח וניקוי של אזור הכתף הימנית והראש באמצעות אלכוהול וסבון כירורגי. לאחר מריחת ג'ל על העיניים למניעת התייבשות, מזריקים פניצילין וסליין כדי להגן מפני זיהום והתייבשות.
השתמשו בטכניקות סטנדרטיות כדי לחשוף את הווריד הג'וגולרי החיצוני לאחר בידודו מהרקמה שמסביב. הכניסו פינצטה מעוקלת מתחת לווריד כדי להחזיקו מורם ומתוח מעט. בצעו חתך קטן בצורת V בווריד והחזיקו את החתך פתוח.
באמצעות מרחיב כלי דם, התקדם עם הקצה הקצר של הקטטר (שאורכו שלושה סנטימטרים) אל תוך הווריד לכיוון הלב, עד שטיפת הסיליקון תגיע לנקודת החתך. קשור את הקטטר לווריד באמצעות שלוש תפרים: אחד ככל הניתן קודאלית, אחד מיד רוסטרלית לטיפת הסיליקון, והשלישי ככל הניתן רוסטרלית.
העבירו תמיסת סלין דרך הקטטר כדי לוודא שאינו חסום ושהתפרים אינם הדוקים מדי. לאחר מכן, הניחו את החולדה כאשר צדה הבטני פונה כלפי מטה. בצעו חתך באזור הראש והחדירו המוסטט כדי להפריד את העור מהרקמה שמתחתיו וליצור כיס תת-עורי.
הנח את התפס הכירורגי (hemostat) מתחת לעור לכיוון הפתח בכתפיים שדרכו הוכנס הקטטר. פנה את רקמת החיבור ותפס בחוזקה את הקטטר בנקודה הרוסטרלית ביותר מתחת לבסיס ה-five up. נתק את ה-five up והעבר את הקצה הארוך של הקטטר מתחת לעור והוצא אותו דרך החתך שנמצא בחלקו העליון של הראש.
השתמשו במספריים כדי לחתוך את הקטטר מתחת למקום שבו נקבע ההמוסטט, וחברו מחדש את הקצה הארוך ל-five up. משכו את הקטטר לאורך המוט המתכתי של ה-five up עד לבסיס הפלסטיקה, והעבירו סליין כדי לוודא זרימה חופשית. לאחר סגירת הפצעים באמצעות תפרים, הניחו את החולדה במכשיר סטריאוטקסי.
לאחר שגולגולת החשיפה נקייה ויבשה, השתמש במקדח ידני כדי לקדוח ארבעה עד חמישה חורים לפני השטח. לאחר מכן, הכנס ברגים מכניים לחורים שישמשו כפיגום עבור מכסה הראש. מקם את מחבר ה-five up בין הברגים והכנס את שארית אורכו של הקטטר לתוך הכיס התת-עורי שנוצר קודם לכן.
לבסוף, השתמשו במלט שיניים כדי להצמיד את החמישה לראש הגולגולת. הסירו את החולדה מהמכשיר הסטריאוטקסי לאחר שהמלט התייבש לחלוטין, ועקבו אחריה עד להחלמה מלאה. החולדות שוהות באופן פרטני בתאי התנייה אופרנטית.
סגור בתאי בידוד אקוסטי המצוידים במאוורר. שני ידיות נסוגות מותקנות בגובה תשעה סנטימטרים מעל רצפת הדופן הימנית, כאשר מעל כל ידית נמצאת נורת סימן. מודול צליל ממוקם מעל הידית הפעילה ונורת בית אדומה ממוקמת במרכז החלק העליון של הדופן השמאלית.
מזון ומים זמינים ad libitum. משאבת התרופה מחוברת לקטטר באמצעות מפרק סיבוב לנוזלים (liquid swivel) וצינור tigon המוגן על ידי קפיץ מתכת. מתן עצמי של הרואין מתחיל לאחר ההחלמה מהניתוח ותקופת הסתגלות של 24 שעות.
כדי להתחיל, שטפו את הקטטר בתמיסת heparin gentamycin. לאחר מכן, חברו את המחבר העליון החמישי לצינור ה-Tigon וחברו את הקפיץ המתכתי. התחילו כל סשן בתחילת שלב החשיכה עם פריסת המנופים הפעילים והלא-פעילים, כמו גם עם הדלקת תאורת הבית והפעלת קומפלקס צלילי נורית ה-Q.
במשך 30 שניות, החולדות רשאיות להחדיר לעצמן הרואין למשך 10 ימים, במהלך שלושה מפגשים של שלוש שעות each, המופרדים במרווחים של שלוש שעות. תגובות על המנוף הפעיל גורמות להפעלת משאבת התרופה ולהתחלת תקופת המתנה של 22 שניות, שבמהלכה אור הבית נכבה ומתהפעל מכלול טון ואור Q מעל המנוף הפעיל. תגובות למנוף הלא פעיל נרשמות, אך אין להן השלכות ניתנות לתכנות.
לאחר אימון ההגשה העצמית, הוצא את החולדות מתאי ההתניה האופרנטית ושכן אותן באופן פרטני במתקן בעלי החיים עם גישה ללא הגבלה למזון ומים. למשך יום אחד של שטיפת תרופה (washout) ביום למחרת, הפחת את כמות המזון עבור הקבוצה המוגבלת במזון כדי להתחיל את תקופת ההיגמול, תוך שמירה על גישה ללא הגבלה למזון בקבוצה השבעה. בצע את מבחן החיפוש אחר התרופה בבוקר של תקופת ההיגמול.
ביום 14, החזירו את החולדות לתאי ההתניה האופרנטית וחברו אותן לקפיץ המתכת. אפשרו מפגש של שעה אחת או שלוש שעות, שבו לתגובות למנוף הפעיל ולמנוף הבלתי פעיל יהיו אותן השלכות כפי שהיו באימון להגשה עצמית, למעט זמינות הסם. תוצאות אלו מדגימות כי משקלי הגוף נשארים יציבים לאורך תקופת הטיפול בהרואין.
אימון בהגשה עצמית במהלך תקופת ההיגמלות, חולדות עם גישה ללא הגבלה למזון מגבירות את משקל גופן, בעוד שחולדות המוגבלות במזון מפחיתות את משקל גופן בערך ב-10% עד 15%. כפי שניתן לראות כאן, מספר ההזרקות והתגובות למנוף הפעיל עלו במהלך ימי האימון, בעוד שהתגובות למנוף הלא-פעיל לא עלו. לאחר תקופת ההיגמלות, התגובה למנוף הפעיל בקרב החולדות המוגבלות במזון עלתה באופן משמעותי בהשוואה לחולדות השבעות. זאת בעוד שהתגובה למנוף הלא-פעיל היא מינימלית ודומה בין הקבוצות לאחר הליך זה.
ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון הזרקות תוך-גולגולתיות, מיקרודיאליזה, Western blotting וטכניקות אימונוהיסטוכימיות, כדי להתמקד במערכות נוירוכימיות ופרמקולוגיות ספציפיות. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה ברורה של אופן השתלתה הכירורגית של קטטר תוך-ורידי לווריד התמיג (jugular vein) של החולדה, וכן של אופן ביצוע הליך של ניהול עצמי של הרואין בתאי התנייה אופרנטית סטנדרטיים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתאר פרוצדורה לבחינת ההשפעה של הגבלת מזון על התנהגות של חיפוש הרואין בחולדות. לאחר תקופה של הזרקה עצמית של הרואין, החולדות עוברות תקופת גמילה בסביבה נטולת סמים עם גישה מוגבלת למזון, ולאחריהן מוערכת התנהגות חיפוש הסמים שלהן.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- פסיכולוגיה התנהגותית
- פרמקולוגיה
רקע
- הבנת מנגנוני ההישנות בהתמכרויות היא חיונית לפיתוח טיפולים יעילים.
- גורמים סביבתיים, כגון זמינות מזון, עשויים להשפיע על התנהגות של חיפוש תרופות.
- חולדות משמשות באופן נפוץ כמודל לחקר התמכרויות ונסיגה (relapse).
- מתן עצמי של הרואין מספק תובנות לגבי הבסיס הנוירוביולוגי של התמכרות.
מטרת המחקר
- לבחון כיצד הגבלה תזונתית כרונית משפיעה על התנהגות של חיפוש הרואין בעכברים.
- להעריך את תפקידם של רמזים סביבתיים בחזרה לשימוש בסמים (relapse).
- לספק מודל להבנת מנגנוני התמכרות בתנאי גמילה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- החדרה כירורגית של קטטר תוורידי למטרת ניהול עצמי של הרואין.
- תאי התניה אופרנטית המשמשים לאימון חולדות לניהול עצמי של הרואין.
- יישום של שלב הימנעות עם גישה מבוקרת למזון.
- בדיקת התנהגות של חיפוש סמים בתגובה לרמזים סביבתיים.
תוצאות עיקריות
- חולדות עם הגבלה תזונתית הפגינו עלייה בחיפוש אחר הרואין בהשוואה לחולדות ללא הגבלה תזונתית.
- רמזים סביבתיים עוררו באופן משמעותי התנהגות של חיפוש סמים בחולדות בשלב של הימנעות.
- התוצאות מדגישות את ההשפעה של הגבלה תזונתית על חזרות של התמכרות.
- הממצאים תורמים להבנת יחסי הגומלין בין רעב לבין התנהגות של חיפוש סמים.
מסקנות
- הגבלה תזונתית כרונית מגבירה את החיפוש אחר הרואין בחולדות בתקופת גמילה.
- גורמים סביבתיים ממלאים תפקיד קריטי בהתנהגות של נסיגה (relapse).
- ניתן להשתמש במודל זה כדי לחקור לעומק מנגנוני התמכרות והתערבויות פוטנציאליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הליך זה מדמה כיצד גורמי עקה סביבתיים, כגון הגבלת מזון, יכולים להגביר התנהגות דמוית נסיגה (relapse) אצל נבדקים בתקופת הינזרות, ובכך מספק תובנה תרגומית (translational) לגבי מנגנוני תחלואה נלווית בהפרעות של שימוש בחומרים. על ידי בידוד ההשפעה של מחסור קלורי על חיפוש סמים המופעל על ידי רמזים, המודל תומך במאמצים לתיקוף מטרות (target validation) בנקודות המפגש בין מסלולי ההזנה למסלולי התגמול. המודל מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של היפותזות הקושרות בין מצב מטבולי לבין פגיעות לנסיגה בשלבי גילוי פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות בנוגע למנגנונים נוירוביולוגיים משותפים בין התנהגויות של חיפוש מזון לחיפוש סמים.
- ערך תפעולי: מספק מערכת רלוונטית למחלה לצורך תיקוף של מטרות המעורבות בהישנות מושרית-סטרס ללא צורך באימון הכחדה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מאפשר הכנה של מערכות ביולוגיות מתוקפות להערכת השפעות של תרכובות על תגובה המופעלת על ידי רמז תחת אתגר מטבולי.
- ערך תפעולי: תומך בסטנדרטיזציה של בדיקה באמצעות פלטי לחיצה על מנוף הניתנים לכימות במהלך מבחני חיפוש תרופות המבוססים על הכחדה.
מחקר תרגומי ופקליני
- ערך מדעי: תואם למערכות רלוונטיות למחלה על ידי מידול של אתגר סביבתי רלוונטי מבחינה קלינית (הגבלה תזונתית כרונית) במקום מחסור אקוטי.
- ערך תפעולי: מקל על חקירת סמנים ביולוגיים (biomarkers) תרגומיים על ידי קישור תוצאות התנהגותיות לבדיקות נוירוכימיות לאחר הבדיקה.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזת המטרה, דרך פיתוח בדיקות התנהגותיות, ועד לתיקוף פרה-קליני של סיכון להישנות תחת סטרס סביבתי.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי האופן שבו מצב מטבולי מווסת את הפעילות של נתיבי התגמול ואת התגובתיות לרמזים.
- סריקה: מספק מדידות כמותיות וניתנות לשחזור של חיפוש תרופות (לחיצות על מנוף) תחת הכחדה, מה שמאפשר סריקה של תרכובות לצורך הפחתת נסיגות.
- אנליטיקה: מייצר מדידות ברורות של משתנים תלויים (תגובות למנוף פעיל) המאפשרות השוואה בין תנאים של שובע להגבלה תזונתית.
- מחקר טרנסלציונלי: מתחבר לרצף הפרה-קליני על ידי מידול של מצב גמילה שמוחמר על ידי תחלואה נלווית אנושית נפוצה (חוסר ביטחון תזונתי/הגבלה תזונתית).
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה פלטפורמה רב-פעמית להערכת הסיכון לנסיגה על פני מחלקות של חומרים ואופנויות של מטרות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי על ידי מידול של גורם מרכזי להשחלת נסיגה (אתגר סביבתי), שאינו קיים בפרוצדורות פשוטות יותר של השחלה מחדש.
- ערך תפעולי: מקדם סטנדרטיזציה באמצעות שלבי הימנעות ובדיקה מוגדרים היטב עם נקודות קצה התנהגותיות מדידות.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של go/no-go על ידי חשיפת מטרות שייתכן והמודולציה שלהן אינה תהיה גנרליזבילית בין מצבים מטבוליים שונים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מועמדים המותאם לסיכון, בהתבסס על יעילות תחת תנאי בסיס וכן תחת תנאי עקה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בניתוחי מכרסמים, קטטריזציה תוורידית והתנייה אופרנטית.
- תלוי בגישה יציבה לתאי בידוד בעלי בידוד אקוסטי, מערכות מנופים, נורות סימן, מודולי צליל ומשאבות להגשת תרופות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית בין תחום הפארמקולוגיה ההתנהגותית לטיפול וטרינרי לצורך פרוטוקולים עקביים של הגבלת מזון.
- התאמה לחומרים או למודלים אחרים דורשת תיקוף מחדש של פרמטרי ההגשה העצמית ומשך תקופת ההינזרות.
- מגבלות מעשיות כוללות שונות בפתוחות הקטטר ואת הצורך בדיור בודד כדי להבטיח ניטור מדויק של צריכת המזון.
