פרופיל תוכן Triacylglyceride בשומני הכסות בת על ידי כרומטוגרפיה Preparative שכבה דקה וMALDI-TOF המוני ספקטרומטריית

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד ולזהות את תכולת הטריגליצרידים הקיימת בהפרשות החלב של העטלפים. ראשית, חלץ את שבר השומנים על פני השטח מרקמות שלמות בתנאים כדי למזער זיהום וחמצון. הפרד את השומנים על ידי כרומטוגרפיה של שכבה דקה כדי לקבל את שבר הטריגליצרידים.

כעת עבד את הנתונים הספקטרליים באמצעות תוכנת מכשירים ונתח באמצעות מסדי נתונים כימיים מקוונים. בסופו של דבר, כרומטוגרפיה של שכבה דקה וזמן יינון לייזר בסיוע מטריצה של ספקטרומטריית מסת טיסה משמשים לקביעת הבדלים בפרופילי הרכב הטריגליצרידים בין קבוצות ניסוי ומבוקרות. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לסייע בזיהוי שומנים מופרשים שעשויים לתפקד כאותות כימיים באינטראקציות של פתוגנים מארחים.

בעוד שאנו משתמשים בשיטה זו כדי לחקור את הסימנים הקליניים של תסמונת האף הלבן, ניתן ליישם שיטה זו על מערכות יונקים אחרות, כולל הסתכלות על איתות מיני או אולי הבדלים בין-ספציפיים בהרכב החלב. נקה את כל המכשירים עם מתנול לפני ובין איסוף רקמות מאנשים שונים. חתוך כגרם אחד של שיער מהעור והניח בבקבוק ארלנמאייר בנפח 125 מיליליטר.

לדגום את החלב ממשטחי הכנף. כדורי צמר גפן רטובים עם ממס מתנול כלורופורם. שפשפו את העור והניחו אותם בבקבוק נפרד.

כעת חלץ את הרקמה עם 10 מיליליטר מתנול כלורופורם המכיל 0.5% BHT למניעת חמצון לאחר שעתיים בכ-0.5 גרם אנהידרו נתרן סולפט והעביר דרך נייר סינון כדי לאסוף את הממס. חזור על המיצוי ברצף עם מתנול אחד עד אחד ואחד עד שניים כלורופורם. לאחר מכן אסוף את המסננים, אידוי הסינון המאוגד מתחת לזרם חנקן.

קבע את המשקל היבש והמיס את שאריות השומנים לריכוז של 10 מיליגרם למיליליטר. אחסן את הדגימה בבקבוקוני זכוכית בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך עד חודש כדי להסיר חומרי פלסטיק שעלולים להפריע לניתוח ספקטרומטריית מסה מאוחר יותר. מלאו צינורות מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר בשלושה עד שניים מתנול כלורופורם.

לאחר מכן שטפו עם אצטון וייבשו באוויר את צינורות הדגימה בכלי נטול אבק וטפלו בצינורות אלה רק עם כפפות. למניעת זיהום משמני עור. הפעל את לוחית ה-TLC על ידי פיתוחה מראש עם שלושה עד שניים מתנול כלורופורם.

הוסף ממס לתא TLC לעומק של סנטימטר אחד. לאחר מכן הנח את הצלחת בתא ואפשר לממס לרוץ לחלוטין לחלק העליון של הצלחת. הסר את הצלחת וייבש אותה במכסה אדים עד שהממס יתאדה.

לאחר מכן מחממים את הצלחת לפחות 10 דקות בחום של 120 מעלות צלזיוס. כעת סמן את הצלחת בסימן עיפרון בחלקו העליון. הנח קו עיפרון ישר 1.5 סנטימטרים מהקצה התחתון של הצלחת כדי לסמן את קו הבסיס שבו יוצבו המדגם והתקנים.

לאחר מכן, חותכים פיסת נייר סינון גדולה מספיק כדי לרפד את שני הקירות הקצרים וקיר אחד ארוך של תא TLC. הכנס את תוחם נייר הסינון לתוך החדר. שופכים 100 מיליליטר של ממס פאזה נייד טרי שהוכן לתא לעומק של כסנטימטר אחד.

מרחו חותם שומן סיליקון לאורך הקצה העליון של החדר. מכסים במכסה הזכוכית ומאזן למשך הלילה. החל את הדגימה באופן ידני או עם מוליך דגימה אוטומטי היוצר רצף רציף.

השתמש בנתיבים החיצוניים של לוחית ה-TLC כדי לזהות כ-20 מיקרוליטר תערובת של תקנים. הנח את לוחית ה-TLC הטעונה בתא המאוזן. סגור את המכסה ופתח את הצלחת עד שהממס יגיע לקצה העליון.

לאחר כ-45 דקות, הסר את הצלחת ואפשר לעודף הממס להתאדות במכסה אדים ריסוס עם 0.05% רודין שש גרם באתנול 95%. לאחר מכן דמיין את רצועות השומנים מתחת למנורה אולטרה סגולה באורך גל ארוך בעזרת עיפרון. סמן את מיקום ה-RF עבור רצועות הפלואורסצנט שנפתרו במדגם ובתקנים.

צלם תיעוד צילום. לאחר מכן, זהה את הרצועה המתאימה לתקן התג. העבירו אותו לחתיכת זכוכית גדולה ונייר מי גבינה, ולאחר מכן לצינור מיקרו צנטריפוגה שטוף ממס של 1.5 מיליליטר.

הוסף לדגימה מיליליטר אחד של שלושה עד שניים ממס מתנול כלורופורם וסוניקט למשך דקה אחת. גלולה את הסיליקה על ידי צנטריפוגה ולאחר מכן העבירו את הממס לצינור חדש שנשקל מראש. חזור על מיצוי מיליליטר אחד, משוך את המסננים ולאחר מכן אידוי הממס מתחת לזרם חנקן.

אחסן את השאריות המיובשות המכילות תגים מתחת לחנקן בחושך בארבע מעלות צלזיוס בזמן שדגימות רקמה נוספות מופרדות על ידי TLC Rho Domine. שישה G קיים בדגימות, אך הוא אינו מסיס בהקסאן ומוסר במהלך פירוק הדגימה. מיד. לפני ניתוח MS, הכינו את תמיסת העבודה של 500 fmol למיקרוליטר A CTH ותקני תג של 10 מיליגרם למיליליטר כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

כמו כן, הכינו את תמיסת המלאי המולארי של DHB עם 90% מתנול לשימוש כמדגם ומטריצה סטנדרטית. מכסים את הצינור בנייר אלומיניום כדי להגן עליו מפני אור. כעת שלבו 10 מיקרוליטר של מטריצת DHB, 10 מיקרוליטר של דגימה או סטנדרטית, וחמישה מיקרוליטרים של תערובת נתרן הידרוקסיד מולרית אחת, וצנטריפוגה קצרה של הצינור כדי להביא את התערובת למקום התחתון.

מיקרוליטר אחד של דגימה סטנדרטית או CTH על לוחית מטרה מנירוסטה MALDI ומניחים בחומר ייבוש לייבוש. לאחר מכן הנח את לוחית המטרה לתוך המכשיר לרכישת נתונים. בצע את ניתוח MALDI toff MS במצב השתקפות חיובית.

כוונן וכייל את המכשיר כפי שתואר על ידי יצרן המכשיר באמצעות A CTH ותג פתרונות סטנדרטיים. רכוש ספקטרום עבור כל דגימה שנצפתה על לוחית המטרה לאחר החלקה והפחתת הרקע מפסגות היונים של תהליך Aldi Spectra באופן ידני עם מפות השומנים של מנוע החיפוש המקוון, העתק והדבק את ספקטרום הרשימה ברשימת היונים הקודמים ותיבת העוצמה. הגבל את החיפוש להרכב AAL הרצוי זהה תגים לפי יחסי מטען המסה מיונים הקיימים בספקטרום עבור כל דגימה.

אם אחוזי מתיל אסטר של חומצות שומן זמינים מניתוח GCMS נפרד, הוסף נתונים אלה כדי לקבל הסתברויות של תגים. הווה ניתוח ליפידים אינטגרטיבי של יונקים על ידי TLC מכין עם HEA מכיוון שהשלב הנייד נפתר בדרך כלל לארבע רצועות נפרדות המתאימות לסטרים, תגי FFAs ואסטרים סטריליים, EERs סקוואלן. ספקטרום רב למסה אלה הושגו עבור תגים שבודדו מהעטלף האדום המזרחי.

אופייני להכנה מיונקים שאינם מימיים. הספקטרום מכיל שיאי יונים בטווח המסה שבין יחס המטען הראשי שמונה 50 לתשע 10. חלקי חומצות שומן הם המרכיבים והתגיות הדומיננטיים של AAL.

ניתן להסיק מידע נוסף על יחסי AAL על ידי התבוננות בפסגות באזור הגליצרידים D AAL של הספקטרום, המייצגים פיצול תגים. ספקטרום MALDI מציג שלושה אזורי תגים נפרדים שבהם יחס הטעינה הראשי מבוסס על מספר הפחמנים. רקמת כנף העטלף האדום המזרחי מאופיינת בפסגות דומיננטיות בשלושת האזורים הללו ביחס מטען ראשי: 8, 53, 0.7, 8, 79, 0.7 ו-907.8.

זכור שכאשר אתה עובד עם עטלפים חיים או מורדמים, עליך להשיג את כל האישורים הנדרשים לטיפול, אחסון והובלה של בעלי חיים אלה. כמו כן, עליך לקבל אישור מהוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים וכן מהוועדה המוסדית לבטיחות ביולוגית. אם מטפלים בעטלפים חיים או ברקמות עצבים מעטלפים, זכור שכל המטפלים צריכים להיות מחוסנים נגד כלבת.

כמו כן, כאשר עובדים עם פתוגנים מסוימים של עטלפי אמבטיה כגון נמלים גיאוגרפיות MiSiS, נדרשת מעבדה ברמה 2 של בטיחות ביולוגית.