בידוד ובידול של Th17 הנאיביים T מסוג CD4 לימפוציטים

עם פונקציות מפעיל להבדיל מתת תא T אחר, תאי Th17 היו מעורבים באופן מרכזי באוטואימוניות דלקתיות. במבחנה פרוטוקול בידול Th17 זו מספק אמצעי כדי לקבוע אם לימפוציטים מסוג CD4 + T נאיביים יכולים להתמיין לתאי Th17, ולבחון את תפקידם באוטואימוניות ותגובת מארח נוסף.

המטרה הכוללת של הליך זה היא להבדיל בין תאי TH 17 לבין CD נאיבי ארבעה לימפוציטים חיוביים מסוג T. זה מושג על ידי קצירת בלוטות הלימפה והטחול מעכבר C 57 שחור בוגר. בשלב השני, הרקמות נטחנות לקבלת תרחיף תא בודד.

לאחר מכן, ארבעת תאי ה-CD החיוביים CD 25 שליליים מבודדים ומתורבתים בתנאי השראת TH 17 או בקרת הפעלה. בסופו של דבר ניתן להשתמש ב-Q-P-C-R-E-I-S-A ובציטומטריית זרימה כדי להעריך ביטוי IL 17 A. כך ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ההתמיינות של לימפוציטים CD 4 T ל-T שמונה 17 תאים ב-C 57 שישה עכברים שחורים.

ניתן ליישם אותו גם על דגמי עכברים אחרים. הדגמה של שיטה זו היא קריטית מכיוון שבלוטות הלימפה קטנות מאוד, מה שמקשה על שלבי הדיסקציה. ללא הדמיה ישירה של שיטה זו, לפחות ארבע שעות לפני הוספת התאים מצפים את הבארות של צלחת תרבית רקמות מיקרו UBO חדשה של 96 בארות עם 30 מיקרוליטר של אנטי CD שלושה מדוללים ב-PBS סטרילי הקש על דפנות הצלחת כדי להבטיח כיסוי אחיד של הבארות ולאחר מכן דגר את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס לאחר ארבע שעות, מקררים את הצלחת עד שהגיע הזמן להוסיף את התאים.

לאחר אישור מוות כתוצאה מפריקת צוואר הרחם, יש לעקר את אזור החתך בעכבר C 57 שחור בוגר עם 70% אתנול. לאחר מכן תפסו את העור הקדמי לפתח השופכה וחתכו מקו האמצע הגחוני לאזור הסנטר, תוך הקפדה לא להפריע לצפק. לאחר מכן הצמד את העור כדי לאפשר גישה לבלוטות הלימפה והטחול להסרה.

כעת הסר את בלוטות הלימפה בבית השחי שנמצאות ליד בית השחי של העכבר מאחורי שרירי החזה והנח את הרקמה בצלחת פטרי המכילה חמישה מיליליטר של מאגר ריצה אוטומטי. לאחר מכן הסר את בלוטות הלימפה הברכיאליות הממוקמות ברקמת החיבור ליד כל בית שחי. לאחר מכן, הסר את בלוטות הלימפה הצוואריות השטחיות שנמצאות בצוואר החיה, מאגפות את קנה הנשימה, ואז הסר את בלוטות הלימפה המפשעתיות הממוקמות באזור הירך בצמידות שלושת כלי הדם.

כדי לגשת לבלוטות הלימפה המזנטריות, חתכו תחילה את קו האמצע הגחוני דרך רירית הצפק. בלוטות הלימפה המזנטריות ממוקמות עמוק בתוך המזנטריה של העכבר, בדרך כלל במחרוזת של ארבעה עד שמונה צמתים שעשויים להופיע כמחרוזת פנינים. הסר את הטחול, משוך ומנתק אותו מהלבלב.

לאחר מכן מניחים אותו בצלחת פטרי עם בלוטות הלימפה כדי לטחון את האיברים. הנח את בלוטות הלימפה בצד החלבי של שקופית מיקרוסקופ אחת ולאחר מכן שפשף את הרקמות עם הצד הקפוא של שקופית שנייה. כדי לסנן את איברי הקרקע למתלה תא יחיד, קפלו תחילה חתיכה של כשלושה אינץ' על שלושה אינץ' של חומר ניילון 40 מיקרון מספר פעמים והניחו אותה בחלק העליון של צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר.

השתמש במזרק של חמישה מיליליטר המצויד במחט בגודל 21 כדי לשאוב את התאים ולחצץ ולאחר מכן להוציא את תמיסת התא לאט לתוך הניילון המקופל. הקפד להימנע מניקוב החומר עם המחט. לאחר שהושגה תרחיף של תא בודד, התמיסה צריכה להיראות עקבית ללא חתיכות גלויות של רקמה מוצקה.

הניחו תמיסה זו על קרח. לאחר מיון התאים לפי הפרדת AutoMax לטוהר תאים שלילי של לפחות 80%CD ארבעה חיוביים CD 25. ספור את התאים על ידי אי הכללה של טריאן כחול ולאחר מכן דלל את תרחיף התאים לאחת כפול 10 לששת התאים למיליליטר במדיה של תרבית תאים.

כעת שטפו את כל הבארות של הצלחת המצופה נגד CD עם 200 מיקרוליטר PBS. כל אחד משליך את הכביסה למיכל פסולת. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של TH 17 מעורר קוקטייל או תערובות בקרת הפעלה לבארות המתאימות בשלוש עותקים.

לבסוף, הוסיפו 100 מיקרוליטר של תאים לכל באר ודגרו על התאים למשך 72 שעות לפחות או עד חמישה ימים כדי להשיג התמיינות תאי TH 17 עבור Eli SA ו-QPCR. לאחר תקופת הדגירה, יש לאסוף משולשים של כל דגימה לצינורות עינור בודדים. לאחר סיבוב התאים, העבירו את הסופרנטנט לצינורות איינור נפרדים ואחסנו במינוס 20 מעלות צלזיוס כדי למדוד מאוחר יותר את ייצור IL 17 A על ידי ELI.

A.To להתכונן ל-QPCR לאחר הסרת ה-supernatant resuspend, את הכדורים הנותרים ב-175 מיקרוליטר, מאגר ליזה RNA למיצוי RNA מיידי או לאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שמוכנים להתחיל בהליך לאחר תקופת הדגירה. כהכנה להפעלת תאים לפני IL 17, מאגר צביעה תוך-תאי כל אחד מתאי הבקרה המעוררים או מפעילים TH 17 משולש לבארות בודדות של צלחת תרבית תאים של 24 בארות. הוסף 400 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים לכל באר.

כדי להביא את הנפח הכולל למיליליטר אחד, הוסף PMA יון מיצין ופלדן A לכל באר ודגר את התאים למשך ארבע שעות ב-37 מעלות צלזיוס כדי לזהות נוכחות של IL 17 A על ידי צביעה תוך תאית וזרימה ציטומטרית. ראשית, העבירו את התאים מכל באר של צלחת 24 הבארות לצינור איינור נפרד. ואז סובב את הצינורות.

הסר את הסופרנטנטים והשהה מחדש את כדוריות התא ב-200 מיקרוליטר של מאגר פקס. העבירו את התאים התלויים לצלחת ציטומטריה של 96 זרימה וסובבו את התאים שוב לאחר שטיפת הכדורים ב-200 מיקרוליטר של מאגר פקס, השעו מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של מאגר פקס והוסיפו 100 מיקרוליטר מתערובת צביעת הנוגדנים החוץ-תאיים. יש לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר הרחק מאור.

לאחר שטיפת התאים פעמיים, דגרו את הכדורים ב -100 מיקרוליטר ציטו BD. יש לתקן את מאגר הסלסול המכוסה בנייר כסף למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. כעת שטפו את התאים פעמיים ב-100 מיקרוליטר של מאגר כביסה אחד X BD, ולאחר מכן דגרו את התאים ב-50 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים תוך-תאית מכוסה בנייר כסף למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר שטיפת התאים שוב, השעו את התאים ב-200 מיקרוליטר של מאגר צביעה BD, ולאחר מכן העבירו את התאים לצינורות ציטומטריית זרימה המכילים 200 מיקרוליטר של מאגר הצביעה. אחסן את הצינורות בארבע מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים לקריאה לניתוח זרימה ציטומטרי של הדגימות השער הראשון באוכלוסיית התאים החיים. לאחר מכן, השתמש באוכלוסיית התאים החיים כדי להגדיר את ה-CD ארבע חיובי CD שמונה אוכלוסייה שלילית.

לבסוף, מה-CD ארבע CD חיוביות, שמונה אוכלוסייה שלילית הולכות על IL 17 אוכלוסייה חיובית כדי להבדיל בין תאי TH 17, יש להעשיר את בלוטות הלימפה המאוגדות הלא מקוטעות ותאי הטחול עבור CD ארבעה חיוביים CD 25 שליליים לאוכלוסיית תאי T שליליים. באיור זה מוצגים תאי בלוטות לימפה מאוגדות לא מקוטעות, ציטים SP ושברי תאי TT מופרדים של AutoMax המוכתמים באנטי CD 4 ואנטי CD 25. תרשים פיזור ראשון זה מציג פרופיל מייצג של אחוז הלימפוציטים השליליים CD 4 חיוביים, CD 25 חיוביים ו-CD 4 חיוביים CD 25 שליליים הקיימים בבלוטות הלימפה ובתאי הטחול המאוחסנים הלא מופרדים.

נוהל הבידוד מספק גם אוכלוסיית טרג חיובית מועשרת CD 4 25 חיובית שניתן להשתמש בה בניסויים נוספים. בתרשים פיזור סופי זה, מוצגת העשרת התאים הרצויה עם אוכלוסייה של 84% CD ארבעה חיוביים CD 25 תאי T שליליים. אוכלוסיית תאי T מועשרת זו של CD 4 חיוביים CD 25 שליליים עוזרת להבטיח התמיינות מוצלחת יותר של TH 17 כפי שמוצג באיור זה.

בעוד שדגירה של CD 4 לימפוציטים T חיוביים CD 25 שליליים עם אנטי CD 3 ואנטי CD 28 למשך חמישה ימים מניבה CD 25 לימפוציטים T חיוביים דגירה בתנאים הגורמים ל-TH 17 מניבה תת-קבוצה של IL 17 המייצרת CD ארבעה לימפוציטים חיוביים CD 25. ניתן להעריך עוד יותר את סטטוס ההתמיינות של TH 17 באמצעות PCR כמותי ו-Elis A כאן, נתונים מ-CD מועשר, ארבעה חיוביים, CD 25 לימפוציטים T שליליים שהודגרו תחת בקרה או מצבים מעוררי TH 17 מוצגים, CD 4 חיובי. לימפוציטים מסוג T שלילי CD 25 שהודגרו בתנאי TH 17 מווסתים את IL 17 A, אותו ניתן לברר באמצעות QPCR ו-ELI SA. גורם השעתוק הספציפי TH 17 ROAR gamma T מווסת גם על ידי CD ארבעה תאי T שליליים חיוביים CD 25 המודגרים בתנאים מעוררי TH 17 כפי שניתן למדוד על ידי QPCR.

בזמן השתתפות בהליך זה, חשוב לזכור להשיג לפחות 80% CD 4 חיובי CD 25 טוהר תאים שלילי לפני הדגירה של התאים בתנאים מעוררי TH 17. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לנתח בלוטות לימפה וטחול משישה עכברים שחורים C 57, כיצד לדגור על תאים בתנאי T שמונה 17 או בקרת הפעלה, וכיצד להעריך את ההתמיינות של לימפוציטים נאיביים CD ארבעה T ל-T שמונה 17 תאים דרומה.