פרוטוקול assay המבוסס תא לחיזוי הפרוגנוזה של Idiopathic עקמת באמצעות סלולרית דיאלקטרי ספקטרוסקופיה

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לחזות את הפרוגנוזה של עקמת אידיופטית על פי הקבוצה התפקודית של החולים על ידי סינון תגובת PBM C שלהם להפעלת GPCR R באמצעות ספקטרוסקופיה דיאלקטרית תאית. זה מושג על ידי תרבית pbmc בנוכחות פיטו המגלוטינין או PHA כדי להרחיב את מספר התאים. הרחבת התא הושלמה בצינור, נשמרת במצב נוטה.

כשלב שני, התאים מטופלים ב-OSTEOPONTIN או OPN, מה שמגביר או מפחית את פעילות חלבון מערכת העיכול. בהתאם לחולים לאחר הטיפול, תרחיף התאים מועבר למיקרו-פלטה. לאחר מכן, התאים מגורים עם אגוניסטים של GI או GS GPCR כדי לקבוע את שינויי העכבה הנובעים מכך.

התוצאות מספקות תגובות קינטיות לכל הבארות ולאחר מכן מכמתים תגובות משולבות על סמך שינויי עכבה. ההשלכות של טכניקה זו הן הרבה מעבר לאבחון פשוט. אז בפעם הראשונה, אנחנו יכולים לזהות בשלב מוקדם חולים סימפטומטיים בסיכון לפתח עקמת, ועכשיו כשאנחנו יודעים מי יפתח עקמת או באיזה שלב הם נמצאים, אנחנו יכולים לספק טיפולים חדשים לטיפול בהם.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו חשיפה לקרני רנטגן, הוא שטכניקה זו מאפשרת לחזות עקמת פרוגנו-אוסטאופתית ללא צורך במדידת קוביד וללא סיכון בריאותי. הדבר האחרון, הטכניקה עכשיו תהיה עוזרת המחקר שלנו ניטה פרנקו, הפשרה של אליקוט קפוא של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. בעזרת פיפטה סטרילית העבירו את תרחיף התא לצינור של 50 מיליליטר המכיל 15 מיליליטר של מדיה שלמה וצנטריפוגה.

התאים שואפים את הסופרנטנט. לאחר מכן השעו בעדינות את גלולת התא במיליליטר אחד של מדיה PHA, השלימו את הנפח ל-20 מיליליטר עם אותה מדיה מכסה את הצינור באופן רופף כדי לאפשר כניסת אוויר. דגרו את הצינור למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני כדי לאפשר ללימפוציטים שקטים להפוך ללימפובלסטים המתרבים במהירות.

הדק את הכובעים לחלוטין וגלגל את התאים באמצעות צנטריפוגה. הסר את הסופרנטנט על ידי שאיפה. תלו בעדינות את כדור התא במיליליטר אחד של מדיה שלמה.

השלם את הנפח ל-20 מיליליטר עם אותה מדיה וכסה את הצינור בתרבית רופפת למשך הלילה כדי להרחיב את מספרי התאים. לאחר שתי כביסות עם 10 מיליליטר RPMI 1640, השעו בעדינות את גלולת התא ב -600 מיקרוליטר של RPMI 1640. מדוד את ריכוז התאים ואת כדאיות התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי ומנתח כדאיות.

לאחר מכן הוסף נפח מתאים של RPMI 1640 כדי להתאים לריכוז תאים של 1.5 כפול 10 לתאים החמישיים לכל 20 מיקרוליטר. העבירו 100 מיקרוליטר מהמתלה לשני צינורות אורף סטריליים של 1.5 מיליליטר. הוסף אוסטאופונטין רקומביננטי בשפופרת אחת לריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם למיליליטר.

הוסף נפח שווה של PBS לצינור השני. ערבבו בעדינות כל מצב על ידי פיפטה פעמיים באמצעות פיפטה סטרילית שנקבעה בנפח 100 מיקרוליטר. לאחר מכן, הוסף חמישה מיקרוליטר של RPMI 1640 לכל באר של צנטריפוגה של צלחת 96 באר את הצלחת ב-200 GS למשך שלוש דקות כדי להסיר בועות אוויר כדי להעביר את התאים מצינור למיקרופלייט.

פיפטה בעדינות למעלה ולמטה פעם אחת כדי להבטיח השעיה אחידה של התאים. זרע 40 מיקרוליטר של תרחיף תאים לבאר בשכפול מרובע לתאים לא מטופלים ובשכפול לתאים שטופלו ב- ROPN או PBS. השאירו את לוחית התא מתחת למכסה המנוע הסטרילי למשך חמש דקות כדי לאפשר לתאים לנוח ולהתייצב באופן שווה בתחתית הבאר.

כדי לייעל את ההשפעה של תרבית OPN, התאים במשך 18 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת פחמן דו חמצני מאזנים את התרביות בטמפרטורת החדר למשך כ-30 דקות. בינתיים, הכינו מיליליטר אחד של 100 סומטוסטטין מיקרו-מולרי ואיזופרוטרנול ב-RPMI 1640. מלאו את צלחת התרכובת על ידי חלוקת 20 מיקרוליטר בבארות מתאימות.

מכסים את צלחת התרכובת בחותם הניתן לריפוי. טען את קצות פיפטת הצלחת והצלחת המורכבת למערכת מבוססת CDS. תן שם לצלחת בתוכנת המכשירים מבוססת CDS.

עבור אל רשימת הפרוטוקולים ובחר את הפרוטוקול המתאים להפעלת הפרוטוקול. לחץ על התחל. המערכת הנוזלית המשולבת מוסיפה בו זמנית את התרכובות לכל הבארות.

המערכת המבוססת על CDS אוספת אוטומטית את הנתונים במשך 15 דקות לאחר שדמות התאים במהדורה מורכבת הייתה דומה בין כל הדגימות עם ערכים עקביים בטווח של 86 ו-96%לעומת זאת, נצפו שינויים גבוהים במספרי התאים. מבין 32 הדגימות, השתמשו בשתיים עם מספר לא מספיק של תאים ולא סווגו. דוגמה זו מציגה את הסיווג התפקודי לפי מידת חוסר האיזון בין איתות GI ל-GI.

הערכת השפעת ה-OPN בתגובה לגירוי מערכת העיכול גילתה כי OPN הגביר את התגובה בחולים 353 ו-371. לעומת זאת, התגובה הופחתה ביותר מ-50% בחולים 345 ו-382 ובפחות מ-50% בחולים 370 לאחר טיפול ב-ROPN. לכן, על פי קריטריוני הסיווג שלנו, הצלחנו לסווג חולים 353 ו-371 ב-FG אחד, 300 חולים מ-45 ו-382 ב-FG 2 וחולה 370 ב-FG 3.

במקביל, כל המטופלים נבדקו לתגובתם לגירוי חלבון במערכת העיכול והושוו לנבדקי הביקורת. כצפוי, כל המטופלים הגיבו פחות מנבדקי הביקורת. חולים שסווגו באותה קבוצה תפקודית הראו רמות דומות של תגובה מקסימלית.

הסיווג של קבוצה גדולה של חולי SC שעקבו אחריהם באופן קבוע במרפאה המיוחדת שלנו בבית החולים סן ג'סטין גילה ששלוש הקבוצות התפקודיות היו מפוזרות באופן דומה. בקרב מקרים בינוניים, FG 2 היה דומיננטי בקרב מקרים קשים. לאחר המתנה לסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לסווג מטופלים לשתיים-שלוש קבוצות פונקציונליות באמצעות ספקטרוסקופיה דיאלקטרית תאית.