Name: אחזור אנטיגן המושרה על ידי חום: שיטה יעילה לאיתור וזיהוי סוגי תאי אב במהלך נוירוגנזה בהיפוקמפוס למבוגרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: למדו שיטת אחזור אנטיגן מושרה על ידי חום לזיהוי תאי אב בנוירוגנזה של היפוקמפוס למבוגרים בעכברים. טכניקה זו משפרת ויזואליזציה של סוגי תאים פרוגניטוריים ומסייעת בחקר מנגנוני התפתחות נוירונים חדשים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המתודולוגיה פותחה במקור במעבדתו של ד"ר הונגג'ון סונג במכון להנדסת תאים, המחלקה לנוירולוגיה, בית הספר לרפואה של ג'ונס הופקינס. עבודה זו מומנה על ידי NIMH (R00MH090115), NARSAD, קרן מחקר הסרטן של מאיו של מסדר האחווה של הנשרים וחבילת סטארט-אפ מקרן מאיו שהוענקה ל-M.H.J. ולתוכנית המחקר המדעי הבסיסי באמצעות קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) במימון משרד החינוך, המדע והטכנולוגיה (A3014385) שהוענקה ל-W.R.K.

1. פרה-אימונוהיסטוכימיה: זלוף והיסטולוגיה
<ol>
	<li>השתמש בעכברים לפי פרוטוקול טרנס-קרדיאלי כללי המותאם לעכברים וחלץ את המוח ל-4% פרפורמלדהיד (PFA)9.</li>
	<li>השאירו את המוח ב-PFA למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (למשל צינור חרוטי של 10 מ"ל מלא ב-PFA). יש לשמור ב-PFA למשך 12-24 שעות לפחות, לא יותר מ-36 שעות לקיבוע מלא. לאחר קיבוע לילה, רוקנו את ה-PFA מהצינור החרוטי אך השאירו את המוח בפנים. יוצקים 30% סוכרוז לתוך הצינור ושוטפים את המוח למשך 5 שניות קצרות כדי להסיר שאריות PFA. לבסוף, מלאו שוב שפופרת המכילה מוחות עם 30% סוכרוז. שמור את המוח בסוכרוז בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שהמוח שוקע לתחתית הצינור.</li>
	<li>חותכים קטעי מוח של 40 מיקרומטר על מיקרוטום. התייעץ עם אטלס מוח של עכבר כדי להתחיל לאסוף קטעים מתחילת הבליטה המשוננת ועד סופה. שמרו קטעים בתמיסה נגד הקפאה (מתכון פשוט הוא 300 גרם סוכרוז ב 500 מ"ל, 0.1 M PBS ו -300 מ"ל אתילן גליקול) עד שהם מוכנים לאימונוהיסטוכימיה.</li>
	<li>הרכיבו את הרקמה החתוכה על שקופיות מיקרוסקופ שתוכננו במיוחד כדי להיצמד חזק לרקמה. שקופיות אלו מספקות אחיזה חזקה לרקמות בשלב הרתיחה. לאחר הרכבת הטישו, נא לתת לשקופית להתייבש למשך 10 דקות או עד שהיא יבשה לחלוטין. ניתן לזרז את הייבוש אם המגלשה מונחת על משטח אנכי כשהקצה התחתון של המגלשה מונח על מגבת נייר. אם מותקנת יותר משקופית אחת, ניתן להשאיר את השקופיות האחרות יבשות במהלך תקופה זו (1-2 שעות זה בסדר) עד שיהיו מוכנות להמשיך לשלב הבא.</li>
	<li>לאחר שהשקופית יבשה, יש לשטוף עם PBS שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחת ולייבש שוב (PBS buffer = 0.137 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0.0119 M Na2PO4). זה מבטיח שכל כימיקל קודם (כגון גליצרול מתמיסת אחסון נגד הקפאה) מוסר מספיק ואינו יכול לפגוע בדבקות הרקמה בשקופית.</li>
</ol>
2. הכנת ריאגנטים וציוד קל
<ol>
	<li>הכן תמיסה A (0.1 M או 19.21 גרם / ליטר חומצת לימון) ותמיסה B (0.1 M או 24.9 גרם / ליטר tris-sodium citrate) בה ירתחו קטעי רקמה.</li>
	<li>בצילינדר מדורג, שלבו 9 מ"ל של תמיסה A ו-41 מ"ל של תמיסה B. הוסיפו 450 מ"ל של ddH2O לתערובת זו.</li>
	<li>יוצקים את התערובת הזו למיכל ריק (למשל קופסת קצות פיפטה ריקה) הבטוח לשימוש במיקרוגל.</li>
</ol>
3. אחזור אנטיגן המושרה על ידי חום
<ol>
	<li>מרתיחים תמיסה המיוצרת בשלב 2 למשך 5 דקות בהגדרה סטנדרטית במיקרוגל רגיל. התמיסה תתחיל לרתוח בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס ומעלה.</li>
	<li>לאחר השלמת הרתיחה, הוציאו בזהירות את המיכל מהמיקרוגל והניחו לתוכו שקופיות מיובשות, וודאו שפני המגלשה עם חלקי ההיפוקמפוס פונים כלפי מטה וחשופים לחלוטין לנוזל. במידת האפשר, הניחו שקופיות בזווית כנגד קירות הקופסה וערמו סביבן שקופיות אחרות. ודא שה"התאמה" שלהם בתוך הקופסה הדוקה כך שלמגלשות לא יהיה מקום לנוע זו על גבי זו.</li>
	<li>מרתיחים את התערובת הזו עם שקופיות במשך 7 דקות בהגדרות סטנדרטיות במיקרוגל. התמיסה תרתח במהלך תקופה זו בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס ומעלה.</li>
	<li>בשלב הרתיחה הזה, מלאו שני דליי קרח באמצע הדרך בקרח.</li>
	<li>לאחר השלמת הרתיחה בשלב 3.3, הוציאו את המיכל מהמיקרוגל והניחו אותו בתוך אחד מדלי הקרח. יוצקים את שאר הקרח מהדלי השני מסביב למיכל ומכסים אותו לחלוטין. תן לזה לשבת שעה.</li>
</ol>
4. צביעת נוגדנים ראשונית ומשנית
<ol>
	<li>בתום תקופת ההמתנה של שעה, הוציאו את השקופיות מהמיכל ושטפו עם מאגר TBS-T 3x למשך 5 דקות כל אחת. ניתן להשתמש בכל מכשיר לביצוע שטיפות בסיסיות אלה. (מאגר TBS = 50 מ"מ Tris HCl, 150 מ"מ NaCl, TBS-T = 0.05% מאגר Triton X-100 TBS, TBS-TT = 4% מאגר TBS-T בסרום חמור).</li>
	<li>לאחר הכביסה, הניחו לשקופיות להתייבש במקום חשוך (למשל בתוך מגירת ספסל, הניחו מגבת נייר בתוך המגירה והטו את המגלשה אליה) למשך 5-10 דקות או עד שהמגלשה יבשה לחלוטין. במהלך תקופה זו, הכינו תא לצביעת נוגדנים ראשונית למשך הלילה. תא מכתים פשוט עשוי לכלול מיכל עם שטח פנים גדול מלא ב-ddH2O ו-stage בתוך המיכל, שעליו ניתן להניח את המגלשה מעל ddH2O.</li>
	<li>לאחר שהמגלשה התייבשה, צייר קו מתאר סביב חלקי הרקמה באמצעות עט דוחה מים. במהלך שלב 4.5, מתווה זה משמש כמחסום המונע מתערובת הנוגדנים לזרום.</li>
	<li>הכן את תערובת הנוגדנים העיקרית ב-TBS-TT. לפחות 500 מיקרוליטר נדרשים כדי לכסות שקופית שלמה אחת, למשל, אם מלאי הנוגדנים הוא בריכוז של 1:500, הוסף 1 מיקרוליטר של נוגדן מסוים ל-500 מיקרוליטר של TBS-TT). השתמש בנוגדנים ראשוניים כאמור בטבלת הריאגנטים.</li>
	<li>הנח את השקופית המיובשת על גבי הבמה בתא הצביעה. הוסף 500 מיקרוליטר מהנוגדנים העיקריים לאט וכסה את כל פני השטח. מכסים את כל המכשיר ועוטפים בנייר אלומיניום כדי לחסום את האור החיצוני. תן לזה לשבת לילה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>למחרת, שטפו את המגלשה שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחת עם מאגר TBS-T. הניחו לו להתייבש באזור חשוך כמתואר בשלב 4.2.</li>
	<li>הכן תערובת נוגדנים משנית בדומה לשלב 4.4. עיין בטבלת הריאגנטים לנוגדנים משניים.</li>
	<li>הנח את השקופית המיובשת בתא הצביעה כמתואר בשלבים 4.2 ו-4.5. הוסף 500 מיקרוליטר של הנוגדנים המשניים לאט וכסה את כל פני השטח. עטפו את תא הצביעה בנייר אלומיניום כדי להגן עליו מפני אור חיצוני. הניחו לו לשבת מכוסה ומוגן מפני אור חיצוני למשך שעתיים לפחות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לאחר השלמת הצביעה המשנית, שטפו את השקופית שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחת עם מאגר TBS-T. תן לשקופית להתייבש באזור חשוך. לאחר הייבוש, הניחו תמיסת הרכבה וכסו את השקופית בהחלקת כיסוי בזהירות ומונעים הכנסת בועות. תן לשקופית לשבת באזור חשוך לפחות שעתיים לפני הניתוח הבא.</li>
	<li>בצע ניתוח זמן-lapse או קונפוקלי על הרקמה המוכתמת.</li>
</ol>

<ol><li>Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system.</a> Annual Reviews of Neuroscience. 28, 223-250 (2005).</li>
<li>Santarelli, L., Saxe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+hippocampal+neurogenesis+for+the+behavioral+effects+of+antidepressants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants.</a> Science. 301 (5634), 805-809 (2003).</li>
<li>Sahay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+adult+hippocampal+neurogenesis+is+sufficient+to+improve+pattern+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation.</a> Nature. 472 (7344), 466-4670 (2011).</li>
<li>Clelland, C. D., Choi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+role+for+adult+hippocampal+neurogenesis+in+spatial+pattern+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation.</a> Science. 325 (5937), 210-213 (2009).</li>
<li>Wang, J. W., David, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+fluoxetine+stimulates+maturation+and+synaptic+plasticity+of+adult-born+hippocampal+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chronic fluoxetine stimulates maturation and synaptic plasticity of adult-born hippocampal granule cells.</a> Journal of Neuroscience. 28 (6), 1374-1384 (2008).</li>
<li>D'Amico, F., Skarmoutsou, E., Stivala, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State+of+the+art+in+antigen+retrieval+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">State of the art in antigen retrieval for immunohistochemistry.</a> Journal of Immunological Methods. 341 (1-2), 1-18 (2009).</li>
<li>Daneshtalab, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troubleshooting+tissue+specificity+and+antibody+selection%3A+Procedures+in+immunohistochemical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 61 (2), 127-135 (2010).</li>
<li>Jang, M. H., Bonaguidi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+frizzled-related+protein+3+regulates+activity-dependent+adult+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Secreted frizzled-related protein 3 regulates activity-dependent adult hippocampal neurogenesis.</a> Cell Stem Cell. 12 (2), 215-223 (2013).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).</li>
<li>Porcelli, M., Cacciapuoti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-thermal+effects+of+microwaves+on+proteins%3A+Thermophilic+enzymes+as+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Non-thermal effects of microwaves on proteins: Thermophilic enzymes as model system.</a> FEBS Letters. 402 (2-3), 102-106 (1997).</li>
<li>Stone, J. R., Walker, S. A., Povlishock, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+visualization+of+a+new+class+of+traumatically+injured+axons+through+the+use+of+a+modified+method+of+microwave+antigen+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">The visualization of a new class of traumatically injured axons through the use of a modified method of microwave antigen retrieval.</a> Acta Neuropathologica. 97 (4), 335-346 (1999).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

השלבים הקריטיים ביותר לאחזור אנטיגן וצביעה מוצלחת של סוגי תאי אב הם: 1) שימוש ברקמה מקובעת היטב בעובי העטרה האופטימלי; 2) מתן זמן מספיק לרתיחה ולקירור לאחר מכן במהלך שליפת האנטיגן; 3) מיומנות ידנית בהרכבת קטעי קורונל קבועים ומניעת נזקם בעת ביצוע פעולה זו.
זה קריטי ב-IHC להשתמש ברקמה מוחדרת שעברה קיבוע מספיק אך לא קיבוע יתר. קושי עיקרי יכול להיות חוסר הנגישות של האנטיגן לנוגדן. השיטה שלנו נועדה לשפר את הנגישות. החדרה נכונה של החיה במהלך הניתוח וקיבוע לאחר מכן חיונית כצעד ראשון. בפרוטוקול שלנו, ...

נוירוגנזה, יצירת נוירונים חדשים מתאי גזע עצביים, ידועה כיום כמתרחשת באופן קבוע בבגרות בשני אזורים מיוחדים במוח. אלה כוללים את האזור התת-חדרי (SVZ) של פקעת הריח ואת האזור התת-גרגירי (SGZ) של הבליטה המשוננת בהיפוקמפוס. במהלך העשור האחרון, תחום הנוירוגנזה של ההיפוקמפוס למבוגרים ראה עבודה משמעותית. האזור משך עניין רב מכיוון שתאי עצב שזה עתה נולדו ב-SGZ תורמים לגמישות עצבית משופרת שיכולה לקיים תפקודי מוח ספציפיים1-5. נוירוגנזה של היפוקמפוס במבוגרים מעורבת כממלאת תפקידים חשובים בוויסות מצב הרוח, התחדשות ולמידה וזיכרון. לפיכך, נעשה מאמץ מרוכז להבין את ההתפתחות והוויסות של נוירונים בנישה נוירוגנית עשירה זו.
היבט בלתי נמנע וחשוב בחקר נוירוגנזה בהיפוקמפוס במבוגרים הוא זיהוי שלבים נפרדים שתא גזע עצבי מופעל עובר בדרכו להפוך לתא עצב מתפקד לחלוטין. בתהליך זה, תא הגזע העצבי השקט מופעל וממשיך דרך סדרה של סוגי תאי אב פעילים מוקדמים ופעילים מאוחרים (איור 1). ניתן לזהות אוכלוסיות מובחנות אלה של אבות עצביים על ידי מורפולוגיה וביטוין של סמנים מולקולריים כגון MCM2, nestin, Tbr2 ו-Doublecortin (DCX) ו-NeuN המנחים את ההמרה של RGLs לסוגי תאי האב שלהם. נסטין הוא חלבון נימה ביניים המתבטא על פני תאים דמויי גליה רדיאליים וכמה סוגי תאי אב מוקדמים. סמן נוסף הוא Tbr2 המתבטא באופן ספציפי בתאי האב המגבירים. ביטוי הטרנסגן Tbr2 כבוי בתחילה בתאי Type-1 (דמויי גליה רדיאלית), מופעל על פני אבות Type-2a, Type-2ab ו-Type-2b ונכבה בין תאי העצב Type-3 והלא בשלים המובחנים יותר (איור 1). DCX הוא סמן נדידה עצבי המתבטא באבות העצביים Type-2ab, Type-2b ו-Type-3. באמצעות שילוב זה של שלושה סמנים, אנו יכולים לסמן תת-סוגים שונים של אבות עצביים. אלה כוללים את Type-1 (MCM2+nestin+Tbr2-), Type-2a (MCM2+nestin+Tbr2+), Type-2ab (חלקי MCM2+nestin-Tbr2+ וחלקי MCM2+Tbr2+DCX-), Type-2b (MCM2+Tbr2+DCX+) ו-Type-3 (MCM2+Tbr2-DCX+). ניתן לזהות תאים פוסט-מיטוטיים כגון הנוירונים הלא בשלים והמשולבים מבחינה תפקודית על ידי שימוש ב-DCX ובסמן העצבי הבוגר, NeuN.
שיטות מסורתיות של IHC משתמשות בנוגדנים כדי לזהות אנטיגנים לסוגי תאים ספציפיים על סמך ביטוי הגנים שלהם. ניתן להשתמש בהדמיה שלאחר מכן באמצעות טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית לזיהויים. עם זאת, כיום קיימות בעיות בשיטות אלה שאינן מאפשרות זיהוי יעיל של התאים דמויי הגליה הרדיאלים וסוגי תאי האב המוקדמים. קשה לזהות את סוגי התאים הספציפיים הללו מכיוון שהנוגדן המופעל אינו מסוגל לחדור ולקשור ביעילות את חלבון הנסטין . נסטין הוא חלבון נימה ביניים המרכיב את התהליכים הרדיאליים המיוצרים על ידי התא דמוי גליה רדיאלי. הקישור הלא יעיל של נוגדן לאנטיגן יכול להיות תוצאה של גורמים רבים כולל זמן קיבוע, טמפרטורה וטכניקה בשימוש6-7. כדי לעזור לפתור בעיות כאלה, פיתחנו שיטת אחזור אנטיגן או "הרתחה". מלבד נסטין, שיטה זו של אחזור אנטיגן משפרת גם את הצביעה עבור סמנים אחרים כגון Ki67, BrdU, חלבון חומצי סיבי גליה (GFAP), Tbr2 ו-MCM2. השיטה שלנו משלבת יחד גישות כימיות ופיזיקליות. זה כרוך בקיבוע כימי של הרקמה בפרפורמלדהיד ולאחר מכן רתיחה בטמפרטורה גבוהה של קטעי היפוקמפוס עטרה דקים במאגר של דנטורנט וטיפול כאוטרופי. זה משפר את הנגישות של האנטיגן לנוגדן, משפר את ספציפיות הנוגדנים ומאפשר זיהוי משופר של סוגי תאי אב. הגישה שלנו פשוטה לשימוש ודורשת בעיקר כלים וריאגנטים שכבר זמינים במעבדה. השתמשנו בו באופן נרחב כדי לחקור את ההתפתחות של תאי גזע עצביים ואת הוויסות שלהם באמצעות גורמים סביבתיים גנטיים או חיצונייםפנימיים 8.

<table><tbody><tr><td>SuperFrost Plus Slide</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td>מספק היצמדות חזקה לרקמת ההיפוקמפוס במהלך הרתיחה</td></tr><tr><td>PVA/DABCO מדיה הרכבה</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>10981-100 מ"ל</td><td> </td></tr><tr><td>נסטין (עוף) </td><td>Aves Lab</td><td>NES</td><td>סמן תאי גזע עצביים</td></tr><tr><td>GFAP (ארנב)</td> <td>Dako צפון אמריקה</td><td>Z033401-2</td><td>אסטרוציטים וסמן תאי גזע עצביים</td></tr><tr><td>MCM2 (עכבר)</td><td>מעבדת התמרה BD</td><td>610701</td><td>סמן התפשטות</td></tr><tr><td>DCX (עז)</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>SC8066</td><td>סמן נוירונים לא בוגר</td></tr><tr><td>Tbr2 (ארנב)</td><td>Abcam</td><td>Ab23345</td><td>סמן אב מגביר</td></tr><tr><td>NeuN (עכבר)</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td>סמן נוירונים בוגר</td></tr><tr><td>Cy2 (נגד ארנב)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-226-047</td><td> </td></tr><tr><td>Cy2 (נגד עוף)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>303-165-006</td><td> </td></tr><tr><td>Cy5 (נגד עכברים)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>315-175-047</td><td> </td></tr><tr><td>Cy5 (נגד עז)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>305-165-047</td><td> </td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>D1306</td><td> </td></tr><tr><td>Dako Pen</td><td>S2002</td><td>Dako</td><td>עט דוחה מים</td></tr></tbody></table>

אחזור אנטיגן המושרה על ידי חום: שיטה יעילה לאיתור וזיהוי סוגי תאי אב במהלך נוירוגנזה בהיפוקמפוס למבוגרים

Heat-Induced Antigen Retrieval: An Effective Method to Detect and Identify Progenitor Cell Types during Adult Hippocampal Neurogenesis

שיטות מסורתיות של אימונוהיסטוכימיה (IHC) לאחר קיבוע רקמות מאפשרות הדמיה של סוגי תאים שונים. אלה ממשיכים בדרך כלל ביישום נוגדנים לקשירת אנטיגנים וזיהוי תאים בעלי מאפיינים שהם פונקציה של הביולוגיה וההתפתחות הטבועים. נוירוגנזה בהיפוקמפוס בוגרים היא תהליך רציף שבו תא גזע עצבי שקט יכול להיות מופעל ולהתקדם בשלבים של התפשטות, התמיינות, התבגרות ואינטגרציה תפקודית. כל שלב נבדל עם מורפולוגיה אופיינית וויסות של גנים. זיהוי שלבים אלה חשוב כדי להבין את מנגנוני הרגולציה הפועלים וכל שינוי בתהליך זה העומד בבסיס הפתופיזיולוגיה של הפרעות מתישות. גישת אחזור האנטיגן המושרה בחום שלנו משפרת את עוצמת האות שמזוהה ומאפשרת זיהוי נכון של סוג תא האב. כפי שנדון במאמר זה, זה מאפשר לנו במיוחד לעקוף את הבעיות הנוכחיות בזיהוי סוגים מסוימים של תאי אב.

נוירוגנזה בהיפוקמפוס של מבוגרים היא תהליך רצפי שבו ניתן לזהות את סוג תא המוצא המייצג בכל שלב באמצעות שילוב של סממנים. קיבוע כימי קפדני ושחזור אנטיגנים משפרים את היעילות והנגישות של סממנים שקשה לזהותם בדרך אחרת. אחד מאלו הוא nestin, המבטא בקרב תאי גזע עצביים דמויי גליא רדיאלית וכמה מסוגי תאי מוצא פעילים מוקדמים. Nestin עשוי להיות חלבון מפתח בזיהוי סוגי תאי מוצא מוקדמים, שכן ביטויו אובד כאשר תא הגזע או תא המוצא מבצעים לאחר מכן התמיינות לנוירון בוגר.
דיאגרמה סכמטית של התהליך הרצפי של נוירוגנזה בה...

במהלך נוירוגנזה של היפוקמפוס במבוגרים, קבוצה מובחנת של סמנים גנטיים מתבטאת כאשר תא גזע עצבי שקט מתקדם ברצף ומתפתח לנוירון משולב תפקודית במעגל. באמצעות אחזור אנטיגן המושרה על ידי חום, סוגי תאי אב שאחרת קשה לזהות מזוהים עם יעילות משופרת.

Traditional  methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization  of various cell types. These typically proceed with the ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבצע שחזור אנטיגן (antigen retrieval) ברקמת מוח מההיפוקמפוס, כדי להדמיץ את סוגי תאי הפרוגניטור שמהם נוצרים נוירונים חדשים. הדבר מושג תחילה על ידי הוצאת המוח המבושם מעכבר, חיתוך של נתחים קורונליים דקים, והצמדת נתחים אלו לשקופית זכוכית, שתוכננה במיוחד להיקשר בחוזקה לרקמה. השלב השני הוא הרתחה של השקופיות עם הרקמה והטיפול האטופי (atopic treatment), ולאחר מכן המתנה לזמן קירור מספיק.בשלב הבא, צבעו את הרקמה למשך לילה עם נוגדים ראשוניים. השלב הסופי הוא ביצוע צביעה בנוגדים משניים על הרקמה למחרת למשך שעתיים לפחות. לבסוף, הדמיזו את סוגי תאי הפרו-מגדר השונים לאורך שלבי הפיתוח השונים במהלך נוירוגנזה של מבוגרים ברקמת ההיפוקמפוס באמצעות מיקרוסקופיה של time lapse או מיקרוסקופיה קונפוקלית.שלום, שמי Hun Jo, פוסט-דוקטורנט וחבר במעבדה של Dr.Ian John וב-Mayo Clinic. המיקוד המרכזי שלנו במעבדה של John הוא חקירת תהליך הנוירוגנזה בתוך הפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות. המטרה הסופית שלנו היא לתרגם ידע זה בהצלחה ליישומים טיפוליים; נדגים את הפרוצדורה שלנו לשליפת אנטיגן (antigen retriever) עם Quam Hui, ושלום ל-John מהמעבדה שלנו.היתרון המרכזי של הטכניקה שלנו על פני שיטות קיימות של אימונוהיסטוכימיה הוא שהיא מאפשרת ויזואליזציה יעילה של סוגי תאים מובחנים במהלך נוירוגנזה של ההיפוקמפוס במבוגרים. סוגי תאים אלו, כולל תאי הגזע העצביים הקדמונים שקשה לזהותם בדרכים אחרות, ניתנים לסימון ולוויזואליזציה יעילה באמצעות שיטת השחזור של האנטיגן שלנו. שיטה זו תספק תובנות על הפיתוח והוויסות של נוירונים חדשים במהלך נוירוגנזה של ההיפוקמפוס במבוגרים.עבור אלו המעוניינים בחקר הפרעות נפשיות וטיפול פרמקולוגי, שלב השחזור של האנטיגן שלנו יתגלה כמועיל בחקירת תפקידו של ההתפתחות העצבית במהלך מחלה זו. פתוגנזה. התחילו את הפרוצדורה על ידי הנחת מוח מעכבר שעבר פרפוזיה ב-4%para formaldehyde בתוך מבחנה קונית של 10 milliliters למשך לילה בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס, או למשך 12 עד 24 שעות לפחות, אך לא יותר מ-36 שעות, לצורך קיבוע מלא. לאחר קיבוע למשך לילה, הסירו את ה-PFA והשאירו את המוח במבחנה הקונית.בשלב הבא, שטפו את המוח ב-30% sucrose כדי להסיר שאריות של PFA והשליכו את ה-sucrose. לאחר מכן, מלאו את המבחנה שוב ב-30% sucrose ושמרו אותה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד שהמוח ישקע לתחתית המבחנה. לאחר מכן, חתכו את ההיפוקמפוס לפרוסות מוח בעובי 40 micrometer באמצעות מיקרוטום.שמרו את החתכים בתמיסת נוגד-קיפאון עד שיהיו מוכנים לאימונוהיסטוכימיה. לאחר מכן, הצמידו את הפרוסות לשקופיות מיקרוסקופ שתוכננו במיוחד להצמדה חזקה לרקמה. לאחר הצמדת הרקמה, הניחו לשקופיות להתייבש במשך כ-10 דקות.ניתן להאיץ את הייבוש אם מניחים את השקופיות כשהן נשענות על משטח אנכי מעל נייר סופג, כדי להבטיח הסרה מלאה של כימיקלים קודמים. לאחר שהשקופיות יבשו, יש לשטוף אותן ב-PBS 3 פעמים למשך חמש דקות בכל פעם. לאחר מכן, יש להניח להן להתייבש שוב.בנוהל זה, הכינו את התמיסה להרצאת הרקמה בהתאם לתיאור המופיע בכתב העת הנלווה. לאחר מכן, הרתיחו את התמיסה למשך חמש דקות במיקרוגל סטנדרטי בהגדרה רגילה. עם סיום ההרצאה, הוציאו בזהירות את המיכל מהמיקרוגל.לאחר מכן, העבירו את השקופיות המיובשות לתוך התמיסה. ודאו שהצד שבו נמצאים חיתוכי ההיפוקמפוס חשוף לחלוטין לתמיסה. במידת האפשר, הניחו את השקופיות בזווית כנגד דפנות המכל והערימו שקופיות אחרות מסביבן.לאחר מכן, הרתיחו את התערובת עם השקופיות במשך שבע דקות במיקרוגל בהגדרות סטנדרטיות. בינתיים, מלאו שני דליי קרח עד מחציתם בקרח. עם סיום ההרתחה, הוציאו את המכל מהמיקרוגל והניחו אותו בתוך אחד מדליי הקרח.שפכו את שאר הקרח מהדלי השני מסביב למכל וכסו אותו לחלוטין. לאחר מכן, המתינו שעה אחת. הוציאו את השקופיות מהמכל.שטוף אותן עם תמיפת TBST שלוש פעמים, למשך חמש דקות בכל פעם. לאחר מכן, ייבש את השקופיות בחושך למשך חמש עד 10 דקות, או עד שהשקופית תהיה יבשה לחלוטין. בינתיים, הכן תא עם DDH two O לצביעה של נוגדן ראשוני למשך הלילה.לאחר שהשקופיות התייבשו, שרטטו מסגרת סביב נתחי הרקמה באמצעות עט דוחה מים. מסגרת זו משמשת כמחסום למניעת זליגה של תערובת הנוגדנים. לאחר מכן, הכינו את תערובת הנוגדנים הראשוניים ב-T-B-S-T-T.הניחו את השקופיות המיובשות על הבמה בתוך תא הצביעה. הוסיפו באיטיות 500 microliters של הנוגדן הראשוני כך שיכסה את כל השטח. לאחר מכן, כסו את תא הצביעה כדי לחסום אור חיצוני והשאירו אותו למשך הלילה בטמפרטורת החדר. למחרת, שטפו את השקופיות שלוש פעמים, חמש דקות בכל פעם, עם תמיסת TBST.לאחר מכן, ייבשו אותן בחושך. כעת הכינו את תערובת הנוגדנים המשניים ב-T-B-S-T-T. לאחר מכן, הניחו את השקופיות היבשות בתא הצביעה.הוסף 500 µL של הנוגדן המשני. כסה באיטיות את תא הצביעה ושמור אותו מהגנה מאור חיצוני למשך שעתיים לפחות בטמפרטורת החדר. לאחר סיום הצביעה המשנית, שטוף את השקופיות שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל פעם באמצעות בופר TBST, וייבש את השקופיות בחושך. הוסף תמיסת קיבוע לשקופיות.כסו אותן עם זכוכית כיסוי בזהירות כדי למנוע כניסת בועות. לאחר מכן, שמרו את השקופיות בחושך למשך שעתיים לפחות לפני ניתוחים עוקבים וביצוע בדיקות time lapse או convo על הרקמה הצבועה. נוירוגנזה היפוקמפלית במבוגרים מופיעה לאורך האזור הסוב-גרנולרי (sub granular zone) של הפיתול המסננת (dentate gyrus).תא גזע מסוג אחד, דמוי גליאל רדיאלי מופעל, עובר שלבים מובחנים בעודו מבדיל את עצמו, מבשיל ונשלב תפקודית בעל מורפולוגיה מורכבת אל תוך המעגל הנוירונלי. ניתן לזהות כל אחד מהשלבים ואת סוגי התאים המתאימים להם על בסיס ביטוי של שילוב של סמנים. MCM 2 הוא סמן פרוליפרציה המבוטא בכל סוגי תאי הפרוגניטור המיטוטיים, בעוד ש-Nestin מבוטא בקרב תאי גזע דמויי גליאל רדיאליים ולא רדיאליים.במהלך התמיינותם של תאי אב מסוג A2, הביטוי של nestin כבוי תחילה. ביטוי של Anti TBR two עולה בתא האב הפוסט-מיטוטי, בעוד שהביטוי של MCM two נעלם, בעוד שהביטוי של DCX ו-NEWAN מכוון את הנדידה וההבשלה לנוירון תפקודי. זוהי תמונת קונפוקאל מייצגת של צביעות MCM two בסגול, neston בירוק ו-dappy באדום.התמונות המוגדלות בתיבות מראות תא מקור מסוג GL רדיאלי המבטא neston, MCM 2 ו-dpi. כאן מוצגת תמונת קונפוקאלית מייצגת של MCM 2 בכחול, TBR 2 באדום, DCX בירוק ו-dpi באפור. צביעה המאפיינת סוג תא של תא מקור B מסוג 2 מוצגת בתמונות המוגדלות בתיבות, המבטאות MCM 2, TBR 2, DCX ו-dpi.במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שלושה דברים. ראשית, יש להשתמש ברקמה מקובעת ומבושפת היטב, בעלת עובי קורונלי מתאים. שנית, יש להניח את הרקמה בצורה שטוחה על השקופיות ולמנוע כל נזק במהלך הפעולה.ולבסוף, שלוש, כדי לאפשר זמן מספיק להרתחה וקירור עוקב במהלך שחזור האנטיגן. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון שחזור רקמות קונפוקאלי וניסויי התנהגות, כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע לאופן שבו נוירונים רך-נולדים עשויים להשתלב במעגלי ההיפוקמפוס ולתרום לתפקוד קוגניטיבי. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן ביצוע שחזור האנטיגן ברקמת ההיפוקמפוס שלכם, כדי להדגים ביעילות רבה יותר את סוגי התאים המייצגים המולידים נוירונים חדשים במהלך נוירוגנזה בהיפוקמפוס.

heat-induced-antigen-retrieval-an-effective-method-to-detect-identify

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

שחזור אנטיגן הנגרם על ידי חום: שיטה יעילה לזיהוי והבחנה של סוגי תאי אב במהלך נוירוגנזה היפוקמפית של מבוגרים

הסרטון מדגים שיטת צביעה אימונופלואורסצנטית המשמשת לבחינת נוירוגנזה בהיפוקמפוס הבוגר. בתחילה, אזור מוח עכבר עובר טיפול בנוגדנים ראשוניים המכוונים לחלבוני סמן הקשורים לנוירוגנזה בתאי אב עצביים. לאחר מכן, הוא מסומן עם נוגדנים משניים מתויגים עם fluorophores. לאחר מכן נצפה קטע המוח תחת מיקרוסקופ קונפוקלי כדי להבחין בין תת-סוגים שונים של תאי אב, בהתבסס על דפוסי הביטוי של שילובים שונים של חלבוני סמן.

טכניקת צביעה אימונופלואורסצנטית לזיהוי נוירוגנזה של היפוקמפוס בוגר

סרטון זה מדגים את ההליך להכתמת תאי גזע עצביים חדשים במקטעי רקמת מוח באמצעות שילוב EdU, ואחריו immunofluorescence כדי לדמיין חלבונים ספציפיים, שיפור ההבנה של דינמיקה התא והתפשטות.

צביעת אימונופלואורסצנטיות להדמיית תאי גזע עצביים מתרבים באזורי מוח עכבר

מאמר וידאו זה מדגים פרוטוקול מקיף לאיתור וכימות של כל שלבי הנוירוגנזה של ההיפוקמפוס במבוגרים באותו קטע רקמה. פיתחנו שיטה להתגבר על המגבלות של אימונופלואורסצנציה מרובה עקיפה המתעוררת כאשר נוגדנים מתאימים ממינים מארחים שונים אינם זמינים.

אימונוהיסטוכימיה ותיוג מרובה עם נוגדנים ממיני Host אותו ללימוד למבוגרים בהיפוקמפוס נוירוגנזה

אנו מתארים פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה ללמוד את הפרופיל של הפעלת תא עצב בהיפוקמפוס בעקבות חשיפה למשימה למידה מרחבית במודל של עכברים מתאפיינים בליקויים קוגניטיביים ממוצא התפתחות נוירולוגית. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על שני המודלים של העכברים גנטיים או תרופתיים המאופיין בליקויים קוגניטיביים.

ויזואליזציה immunohistochemical של היפוקמפוס Neuron פעילות לאחר מרחבי למידה במודל עכבר של הפרעות נוירו-התפתחותי

אנו מציגים שיטה לשחזור ויעילים כדי לבודד את תרבות ובתאים עצבית של רקמת מוח עובריים ופוסט עבור immunoprecipitation כרומטין (ChIP) של היסטון 3 ליזין 79 dimethylation (H3K79me2) - סימן היסטון ממוקם במרחק תחום הכדוריים של היסטון 3.

בידוד, טיפוח של אבות עצבית ואחריו Immunoprecipitation-כרומטין של היסטון 3 ליזין 79 Dimethylation מארק

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר גישה לניתוח התנהגות של מבוגרים בתאי גזע/מחולל קדמון בתגובה לטיפול כימוגנטי של מעגל מקומי ספציפי עצביים.

Assaying בוויסות מעגל ספציפי של היפוקמאל מבוגרים תאים מקודמן עצבי

מאמר זה מציג ארבע מהטכניקות הנפוצות ביותר להדמיית תאים חיוביים של BrdU למדידת נוירוגנזה בוגרת בחולדות. עבודה זו כוללת הוראות להכנת מגיבים, ניהול אנלוגי של תימידין, פרפוזיה של שריר הלב, הכנת רקמות, תגובה אימונוהיסטוכימית של פרוקסידאז, אימונופלואורסצנציה, הגברת אותות, צביעה נגדית, הדמיית מיקרוסקופיה וניתוח תאים.

טכניקות אימונוהיסטוכימיה לניתוח התפשטות תאים ונוירוגנזה בחולדות באמצעות BrdU אנלוגי של תימידין

דלקת המוח האוטואימונית היא קטגוריה חדשה של מחלות בתיווך נוגדנים של מערכת העצבים המרכזית. ניתן להשתמש בנוירונים בהיפוקמפוס כדי לגלות ולאפיין נוגדנים אלה. מאמר זה מספק פרוטוקול לתרבית תאים ראשונית ואימונוסטינינג כדי לקבוע נוגדנים עצמיים בסרום ובנוזל המוח והשדרה של חולים.

תרביות נוירונים בהיפוקמפוס כדי לזהות ולחקור נוגדנים פתוגניים חדשים המעורבים בדלקת המוח אוטואימונית

השתלה של נוירונים GABAergic שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שנוצרו על ידי תכנות עצבי יכולה להיות גישה טיפולית פוטנציאלית להפרעות נוירו-התפתחותיות. פרוטוקול זה מתאר את הדור וההשתלה של מבשרים עצביים GABAergic שמקורם בתאי גזע אנושיים במוחם של עכברים ילודים, מה שמאפשר חקירה ארוכת טווח של נוירונים מושתלים והערכת הפוטנציאל הטיפולי שלהם.

השתלת תאי עצב GABAergic שמקורם בתאי גזע אנושיים בהיפוקמפוס העכברים המוקדם לאחר הלידה כדי למתן הפרעות נוירו-התפתחותיות

מוצגת כאן שיטה לרצף גרעינים בודדים שבודדו מהפיתול המשונן של העכבר, שאינה כוללת את רוב תאי העצב באמצעות מיון גרעינים המופעלים על ידי פלואורסצנציה (FAN). גישה זו מייצרת פרופילי ביטוי איכותיים ומקלה על המחקר של רוב סוגי התאים האחרים המיוצגים בנישה, כולל אוכלוסיות נדירות כגון תאי גזע עצביים.

מיון שלילי של גרעינים המופעלים על ידי פלואורסצנציה של נוירונים בשילוב עם ריצוף RNA של גרעין יחיד כדי לחקור את הנישה הנוירוגנית של ההיפוקמפוס

למדו שיטת אחזור אנטיגן מושרה על ידי חום לזיהוי תאי אב בנוירוגנזה של היפוקמפוס למבוגרים בעכברים. טכניקה זו משפרת ויזואליזציה של סוגי תאים פרוגניטוריים ומסייעת בחקר מנגנוני התפתחות נוירונים חדשים.

אחזור אנטיגן המושרה על ידי חום: שיטה יעילה לאיתור וזיהוי סוגי תאי אב במהלך נוירוגנזה בהיפוקמפוס למבוגרים

גלה סרטונים נוספים