אחזור אנטיגן המושרה על ידי חום: שיטה יעילה לאיתור וזיהוי סוגי תאי אב במהלך נוירוגנזה בהיפוקמפוס למבוגרים
30 באוגוסט 2013
במהלך נוירוגנזה של היפוקמפוס במבוגרים, קבוצה מובחנת של סמנים גנטיים מתבטאת כאשר תא גזע עצבי שקט מתקדם ברצף ומתפתח לנוירון משולב תפקודית במעגל. באמצעות אחזור אנטיגן המושרה על ידי חום, סוגי תאי אב שאחרת קשה לזהות מזוהים עם יעילות משופרת.
המטרה הכללית של הליך זה היא לבצע שחזור אנטיגן (antigen retrieval) ברקמת מוח מההיפוקמפוס, כדי להדמיץ את סוגי תאי הפרוגניטור שמהם נוצרים נוירונים חדשים. הדבר מושג תחילה על ידי הוצאת המוח המבושם מעכבר, חיתוך של נתחים קורונליים דקים, והצמדת נתחים אלו לשקופית זכוכית, שתוכננה במיוחד להיקשר בחוזקה לרקמה. השלב השני הוא הרתחה של השקופיות עם הרקמה והטיפול האטופי (atopic treatment), ולאחר מכן המתנה לזמן קירור מספיק.
בשלב הבא, צבעו את הרקמה למשך לילה עם נוגדים ראשוניים. השלב הסופי הוא ביצוע צביעה בנוגדים משניים על הרקמה למחרת למשך שעתיים לפחות. לבסוף, הדמיזו את סוגי תאי הפרו-מגדר השונים לאורך שלבי הפיתוח השונים במהלך נוירוגנזה של מבוגרים ברקמת ההיפוקמפוס באמצעות מיקרוסקופיה של time lapse או מיקרוסקופיה קונפוקלית.
שלום, שמי Hun Jo, פוסט-דוקטורנט וחבר במעבדה של Dr.Ian John וב-Mayo Clinic. המיקוד המרכזי שלנו במעבדה של John הוא חקירת תהליך הנוירוגנזה בתוך הפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות. המטרה הסופית שלנו היא לתרגם ידע זה בהצלחה ליישומים טיפוליים; נדגים את הפרוצדורה שלנו לשליפת אנטיגן (antigen retriever) עם Quam Hui, ושלום ל-John מהמעבדה שלנו.
היתרון המרכזי של הטכניקה שלנו על פני שיטות קיימות של אימונוהיסטוכימיה הוא שהיא מאפשרת ויזואליזציה יעילה של סוגי תאים מובחנים במהלך נוירוגנזה של ההיפוקמפוס במבוגרים. סוגי תאים אלו, כולל תאי הגזע העצביים הקדמונים שקשה לזהותם בדרכים אחרות, ניתנים לסימון ולוויזואליזציה יעילה באמצעות שיטת השחזור של האנטיגן שלנו. שיטה זו תספק תובנות על הפיתוח והוויסות של נוירונים חדשים במהלך נוירוגנזה של ההיפוקמפוס במבוגרים.
עבור אלו המעוניינים בחקר הפרעות נפשיות וטיפול פרמקולוגי, שלב השחזור של האנטיגן שלנו יתגלה כמועיל בחקירת תפקידו של ההתפתחות העצבית במהלך מחלה זו. פתוגנזה. התחילו את הפרוצדורה על ידי הנחת מוח מעכבר שעבר פרפוזיה ב-4%para formaldehyde בתוך מבחנה קונית של 10 milliliters למשך לילה בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס, או למשך 12 עד 24 שעות לפחות, אך לא יותר מ-36 שעות, לצורך קיבוע מלא. לאחר קיבוע למשך לילה, הסירו את ה-PFA והשאירו את המוח במבחנה הקונית.
בשלב הבא, שטפו את המוח ב-30% sucrose כדי להסיר שאריות של PFA והשליכו את ה-sucrose. לאחר מכן, מלאו את המבחנה שוב ב-30% sucrose ושמרו אותה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד שהמוח ישקע לתחתית המבחנה. לאחר מכן, חתכו את ההיפוקמפוס לפרוסות מוח בעובי 40 micrometer באמצעות מיקרוטום.
שמרו את החתכים בתמיסת נוגד-קיפאון עד שיהיו מוכנים לאימונוהיסטוכימיה. לאחר מכן, הצמידו את הפרוסות לשקופיות מיקרוסקופ שתוכננו במיוחד להצמדה חזקה לרקמה. לאחר הצמדת הרקמה, הניחו לשקופיות להתייבש במשך כ-10 דקות.
ניתן להאיץ את הייבוש אם מניחים את השקופיות כשהן נשענות על משטח אנכי מעל נייר סופג, כדי להבטיח הסרה מלאה של כימיקלים קודמים. לאחר שהשקופיות יבשו, יש לשטוף אותן ב-PBS 3 פעמים למשך חמש דקות בכל פעם. לאחר מכן, יש להניח להן להתייבש שוב.
בנוהל זה, הכינו את התמיסה להרצאת הרקמה בהתאם לתיאור המופיע בכתב העת הנלווה. לאחר מכן, הרתיחו את התמיסה למשך חמש דקות במיקרוגל סטנדרטי בהגדרה רגילה. עם סיום ההרצאה, הוציאו בזהירות את המיכל מהמיקרוגל.
לאחר מכן, העבירו את השקופיות המיובשות לתוך התמיסה. ודאו שהצד שבו נמצאים חיתוכי ההיפוקמפוס חשוף לחלוטין לתמיסה. במידת האפשר, הניחו את השקופיות בזווית כנגד דפנות המכל והערימו שקופיות אחרות מסביבן.
לאחר מכן, הרתיחו את התערובת עם השקופיות במשך שבע דקות במיקרוגל בהגדרות סטנדרטיות. בינתיים, מלאו שני דליי קרח עד מחציתם בקרח. עם סיום ההרתחה, הוציאו את המכל מהמיקרוגל והניחו אותו בתוך אחד מדליי הקרח.
שפכו את שאר הקרח מהדלי השני מסביב למכל וכסו אותו לחלוטין. לאחר מכן, המתינו שעה אחת. הוציאו את השקופיות מהמכל.
שטוף אותן עם תמיפת TBST שלוש פעמים, למשך חמש דקות בכל פעם. לאחר מכן, ייבש את השקופיות בחושך למשך חמש עד 10 דקות, או עד שהשקופית תהיה יבשה לחלוטין. בינתיים, הכן תא עם DDH two O לצביעה של נוגדן ראשוני למשך הלילה.
לאחר שהשקופיות התייבשו, שרטטו מסגרת סביב נתחי הרקמה באמצעות עט דוחה מים. מסגרת זו משמשת כמחסום למניעת זליגה של תערובת הנוגדנים. לאחר מכן, הכינו את תערובת הנוגדנים הראשוניים ב-T-B-S-T-T.
הניחו את השקופיות המיובשות על הבמה בתוך תא הצביעה. הוסיפו באיטיות 500 microliters של הנוגדן הראשוני כך שיכסה את כל השטח. לאחר מכן, כסו את תא הצביעה כדי לחסום אור חיצוני והשאירו אותו למשך הלילה בטמפרטורת החדר. למחרת, שטפו את השקופיות שלוש פעמים, חמש דקות בכל פעם, עם תמיסת TBST.
לאחר מכן, ייבשו אותן בחושך. כעת הכינו את תערובת הנוגדנים המשניים ב-T-B-S-T-T. לאחר מכן, הניחו את השקופיות היבשות בתא הצביעה.
הוסף 500 µL של הנוגדן המשני. כסה באיטיות את תא הצביעה ושמור אותו מהגנה מאור חיצוני למשך שעתיים לפחות בטמפרטורת החדר. לאחר סיום הצביעה המשנית, שטוף את השקופיות שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל פעם באמצעות בופר TBST, וייבש את השקופיות בחושך. הוסף תמיסת קיבוע לשקופיות.
כסו אותן עם זכוכית כיסוי בזהירות כדי למנוע כניסת בועות. לאחר מכן, שמרו את השקופיות בחושך למשך שעתיים לפחות לפני ניתוחים עוקבים וביצוע בדיקות time lapse או convo על הרקמה הצבועה. נוירוגנזה היפוקמפלית במבוגרים מופיעה לאורך האזור הסוב-גרנולרי (sub granular zone) של הפיתול המסננת (dentate gyrus).
תא גזע מסוג אחד, דמוי גליאל רדיאלי מופעל, עובר שלבים מובחנים בעודו מבדיל את עצמו, מבשיל ונשלב תפקודית בעל מורפולוגיה מורכבת אל תוך המעגל הנוירונלי. ניתן לזהות כל אחד מהשלבים ואת סוגי התאים המתאימים להם על בסיס ביטוי של שילוב של סמנים. MCM 2 הוא סמן פרוליפרציה המבוטא בכל סוגי תאי הפרוגניטור המיטוטיים, בעוד ש-Nestin מבוטא בקרב תאי גזע דמויי גליאל רדיאליים ולא רדיאליים.
במהלך התמיינותם של תאי אב מסוג A2, הביטוי של nestin כבוי תחילה. ביטוי של Anti TBR two עולה בתא האב הפוסט-מיטוטי, בעוד שהביטוי של MCM two נעלם, בעוד שהביטוי של DCX ו-NEWAN מכוון את הנדידה וההבשלה לנוירון תפקודי. זוהי תמונת קונפוקאל מייצגת של צביעות MCM two בסגול, neston בירוק ו-dappy באדום.
התמונות המוגדלות בתיבות מראות תא מקור מסוג GL רדיאלי המבטא neston, MCM 2 ו-dpi. כאן מוצגת תמונת קונפוקאלית מייצגת של MCM 2 בכחול, TBR 2 באדום, DCX בירוק ו-dpi באפור. צביעה המאפיינת סוג תא של תא מקור B מסוג 2 מוצגת בתמונות המוגדלות בתיבות, המבטאות MCM 2, TBR 2, DCX ו-dpi.
במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שלושה דברים. ראשית, יש להשתמש ברקמה מקובעת ומבושפת היטב, בעלת עובי קורונלי מתאים. שנית, יש להניח את הרקמה בצורה שטוחה על השקופיות ולמנוע כל נזק במהלך הפעולה.
ולבסוף, שלוש, כדי לאפשר זמן מספיק להרתחה וקירור עוקב במהלך שחזור האנטיגן. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון שחזור רקמות קונפוקאלי וניסויי התנהגות, כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע לאופן שבו נוירונים רך-נולדים עשויים להשתלב במעגלי ההיפוקמפוס ולתרום לתפקוד קוגניטיבי. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן ביצוע שחזור האנטיגן ברקמת ההיפוקמפוס שלכם, כדי להדגים ביעילות רבה יותר את סוגי התאים המייצגים המולידים נוירונים חדשים במהלך נוירוגנזה בהיפוקמפוס.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה דן בתהליך של נוירוגנזה בהיפוקמפוס של מבוגרים, תוך התמקדות בביטוי של סממנים גנטיים בתאי גזע עצביים בעת התפתחותם לנוירונים משולבים. המחקר עושה שימוש בשחזור אנטיגנים מושרה בחום כדי לשפר את הגילוי של סוגי תאי מקור ברקמת ההיפוקמפוס.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- נוירוגנזה
רקע
- נוירוגנזה בבגרות מתרחשת בהיפוקמפוס.
- תאי גזע עצביים יכולים להתמיין לסוגים שונים של תאים.
- זיהוי תאי אב הוא קריטי להבנת הנוירוגנזה.
- טכניקות לשחזור אנטיגן משפרות את הוויזואליזציה של תאים אלה.
מטרת המחקר
- להדמיית סוגי תאי אב ברקמת ההיפוקמפוס.
- לשיפור הזיהוי של תאים המעורבים בנוירוגנזה.
- להבנת שלבי הפיתוח של נוירונים רכים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- קצירה של רקמת מוח עכברית שעברה פרפוזיה.
- חיתוך של נתחים קורונליים דקים של המוח.
- הרתחה של שקופיות עם רקמה לצורך חשיפת אנטיגן.
- צביעת הרקמה באמצעות נוגדנים ראשוניים ושניוניים.
תוצאות עיקריות
- שיפור הוויזואליזציה של סוגי תאי אב.
- זיהוי סממנים גנטיים במהלך נוירוגנזה.
- יישום מוצלח של שחזור אנטיגנים מושרה בחום.
- תובנות לגבי שילובם של נוירונים רכים במעגלים.
מסקנות
- שחזור אנטיגן יעיל לחקר נוירוגנזה.
- הבנת תאי progenitor מסייעת למחקר בתחום מדעי העצבים.
- מחקרים עתידיים יכולים להבסס את ממצאים אלו להשגת תובנות טיפוליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שחזור אנטיגנים המושרה בחום משפר את הגילוי והזיהוי של סוגי תאי אב במהלך נוירוגנזה של ההיפוקמפוס במבוגר, ובכך נותן מענה לאתגר מרכזי בביולוגיה של מערכת העצבים ובגילוי תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS). ויזואליזציה משופרת של אוכלוסיות נפרדות של תאי גזע ותאי אב עצביים מאפשרת תיקוף מדויק יותר של מטרות והפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבים מוקדמים של פיתוח בתחום מדעי המוח. יכולת זו תומכת במחקר תרגומי של הפרעות נוירו-התפתחותיות ונוירו-פסיכיאטריות, ומסייעת בקבלת החלטות לגבי תיקי פיתוח ובאסטרטגיות של סמנים ביולוגיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר זיהוי מדויק של תתי-סוגים של תאי אב עצביים (neural progenitor subtypes), החיוניים לתיקוף מטרות במחקר של נוירוגנזה.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבהרת שלבי התפתחות ומערכות יחסים של שושלות תאים בהיפוקמפוס.
- תומך בביטחון חיזוי בקישור פנוטיפים תאיים למנגנונים רלוונטיים למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- משפר את רגישות וסגוליות הבדיקה לזיהוי סוגי תאי פרוגניטור נדירים או כאלו המוסתרים באופן אחר.
- מנstandardizes את תהליכי העבודה של immunohistochemistry לקבלת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור בין ניסויים שונים.
- מכין מערכות רקמות שעברו תיקוף עבור סריקת תרכובות (compound screening) ואנליזה פנוטיפית בשלבים הבאים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את זיהוי הסמנים התאיים עם אסטרטגיות לסמנים ביולוגיים תרגומיים במודלים של מחלות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- מאפשר רצף ממחקרים מכניסטיים בשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של התערבויות נוירוגניות.
- תומך בקידום מותאם סיכונים של מועמדים למודולציה של נוירוגנזה.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline) וזרימת עבודה (Workflow)
שיטה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי כך שהיא מאפשרת זיהוי חסון של אוכלוסיות תאי אב עצביים ברקמת מוח מקובעת, ובכך תומכת הן במחקר מונחה-השערות והן בפיתוח של בדיקות כמותיות.
- ביולוגיה של גילוי: מספקת זיהוי ברמת ודאות גבוהה של סממנים התפתחותיים לצורך בדיקת השערות והבהרת מסלולים ביולוגיים.
- סריקה: מספקת תוצרי אימונוהיסטוכימיה כמותיים וניתנים לשחזור להכשרת בדיקות (assays).
- אנליטיקה: מאפשרת ניתוח השוואתי של שכיחות תאי אב וביטוי סממנים בתנאים ניסויים שונים.
- מחקר תרגומי: מסייעת בהלימה בין פנוטיפים תאיים לנקודות קצה רלוונטיות למחלה במודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: קובעת פרוטוקול סטנדרטי וניתן להרחבה לניתוח רקמות של ה-CNS בתוכניות מחקר שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות בתיקוף של מטרות עצביות.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה של בדיקות מבוססות רקמה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) והקצאת הון בתיקי מחקר בנוירוביולוגיה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בסדר עדיפויות מותאם סיכונים של נכסים פרה-קליניים ותגליות בתחום ה-CNS.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בנוירו-אנטומיה, אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופיה קונפוקלית.
- מחייב גישה לתשתיות איכותיות לעיבוד רקמות ודימות.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הקיבוע, החיתוך והצביעה.
- עשוי לדרוש התאמה עבור אזורי מוח שונים או מאפייני רקמה ספציפיים למין.
- תלוי בפנלים מאומתים של נוגדנים ובבקרה קפדנית של תנאי השחזור של האנטיגן.
