Name: Multiplex assay PCR ?????? ?? ???? Mec ???????? ???? Staphylococcal I ?V ?-methicillin ??????????? (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: למדו שיטת PCR מרובבת לזיהוי מהיר של סוגי SCCmec I-V בחיידקי MRSA. הטכניקה מפשטת את אופיינות זני Staphylococcus aureus עמידים למתיצילין ומייעלת מעקב אפידמיולוגי במעבדות קליניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ל-T. Ito, K. Hiramatsu, R. Daum, H. de Lencastre ו-D. Coleman על המתנה האדיבה של כמה זני ייחוס ששימשו במחקר זה. עבודה זו נתמכה בחלקה כספית על ידי המרכז לעמידות אנטי-מיקרוביאלית (CAR), שירותי הבריאות של אלברטה-קלגרי/שירותי מעבדה של קלגרי/אוניברסיטת קלגרי.

????? ??? ?????? ?????? ?????? ?????? ?????? ???????? ???? 2. ???? ??? ???? ????? ???? ????? ?????? ????? ?? ???????? ??? ???. 1. ?????? ???? <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ??????? ???? ???? ????? ?? MRSA ??????. ???? ????? ?-PCR ??? ????? ?????, ??? ????? ??? ?? MRSA ?? ??? ????? ?????? ?????? ?? ??? ?? ???????? ?? ??? (TSA) ???? ???? tryptic. ?????? ????? ???????? ??????? ???? ?? ???? ???. ????? ????? ???? 37

<ol><li>IWG-SCC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+%28SCCmec%29%3A+guidelines+for+reporting+novel+SCCmec+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Classification of staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec): guidelines for reporting novel SCCmec elements.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (12), 4961-4967 (2009).</li>
<li>Ito, T., Hiramatsu, K., Tomasz, A., de Lencastre, H., Perreten, V., Holden, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+Reporting+Novel+mecA+Gene+Homologues%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for Reporting Novel mecA Gene Homologues.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (10), 4997-4999 (2012).</li>
<li>Okuma, K., Iwakawa, K., Turnidge, J. D., Grubb, W. B., Bell, J. M., O'Brien, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+of+new+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+clones+in+the+community%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dissemination of new methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in the community.</a> Journal of Clinical Microbiology. 40 (11), 4289-4294 (2002).</li>
<li>Kondo, Y., Ito, T., Ma, X. X., Watanabe, S., Kreiswirth, B. N., Etienne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+multiplex+PCRs+for+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type+assignment%3A+rapid+identification+system+for+mec%2C+ccr%2C+and+major+differences+in+junkyard+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Combination of multiplex PCRs for staphylococcal cassette chromosome mec type assignment: rapid identification system for mec, ccr, and major differences in junkyard regions.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (1), 264-274 (2007).</li>
<li>Oliveira, D. C., de Lencastre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+strategy+for+rapid+identification+of+structural+types+and+variants+of+the+mec+element+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (7), 2155-2161 (2002).</li>
<li>Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+to+the+multiplex+PCR+strategy+for+assignment+of+mec+element+types+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (9), 3374-3377 (2007).</li>
<li>Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+strategy+for+subtyping+the+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type+IV+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%3A+%27SCCmec+IV+multiplex%27%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR strategy for subtyping the staphylococcal cassette chromosome mec type IV in methicillin-resistant Staphylococcus aureus: 'SCCmec IV multiplex'.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (1), 42-48 (2007).</li>
<li>Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Louie, T., Conly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+multiplex+PCR+assay+for+characterization+and+concomitant+subtyping+of+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+types+I+to+V+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Novel multiplex PCR assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (10), 5026-5033 (2005).</li>
<li>Zhang, K., McClure, J. A., Conly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+multiplex+PCR+assay+for+typing+of+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+types+I+to+V+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Enhanced multiplex PCR assay for typing of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Molecular and Cellular Probes. 26 (5), 218-221 (2012).</li>
<li>de Lamballerie, X., Zandotti, C., Vignoli, C., Bollet, C., de Micco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one-step+microbial+DNA+extraction+method+using+%22Chelex+100%22+suitable+for+gene+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A one-step microbial DNA extraction method using "Chelex 100" suitable for gene amplification.</a> Research in Microbiology. 143 (8), 785-790 (1992).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>McClure, J. A., Conly, J. M., Elsayed, S., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+assay+to+facilitate+identification+of+the+recently+described+Staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type+VIII%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR assay to facilitate identification of the recently described Staphylococcal cassette chromosome mec type VIII.</a> Molecular and Cellular Probes. 24 (4), 229-232 (2010).</li>
<li>Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Conly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type%2C+tentatively+designated+type+VIII%2C+harboring+class+A+mec+and+type+4+ccr+gene+complexes+in+a+Canadian+epidemic+strain+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Novel staphylococcal cassette chromosome mec type, tentatively designated type VIII, harboring class A mec and type 4 ccr gene complexes in a Canadian epidemic strain of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 531-540 (2009).</li>
</ol>

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

בדיקת ה-PCR המולטיפלקס המתוארת כאן מספקת שיטה פשוטה ואמינה לסיווג סוגים ותת-סוגים עיקריים של SCCmec IV בסטפילוקוקים, עם אפליה בו זמנית של MRSA מ-MSSA. הבדיקה חזקה, נעשית בנוחות בתגובת PCR אחת והתוצאות קלות לפירוש. לבדיקה יש מגבלות בכך שהיא מכוונת למיקומים בודדים בתוך כל סוג SCCmec , אך אינה מציעה הקלדה מורכבת מקיפה של ccr ו-mec , ולכן אינה יכולה להיחשב כתקן זהב. בלי קשר, אימות נרחב של הפרוטוקול הוכיח שהוא נותר כלי מולקולרי רב ערך למחקרים מדעיים ואפידמיולוגיים על MRSA.
<p class="jov...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/50779/multiplex-pcr-assay-for-typing-staphylococcal-cassette-chromosome-mec">Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus</a>.&#160; There was a&#160;typo&#160;in Table 1.
In Table 1, the Oligonucleotide sequence for Type III-F5 was updated from:
TTCTCATTGATGCTGAAGCC
To:
GAAACTAGTTATTTCCAACGG

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/50779/multiplex-pcr-assay-for-typing-staphylococcal-cassette-chromosome-mec">Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus</a>.&#160; There was a&#160;typo&#160;in Table 1.

Erratum: Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

??????????? Methicillin ???? (MRSA) ??? ??????? ???? ????? ??? ????? ???? 21-67-KB ????, ???? ???? ???????? MEC staphylococcal (SCC MEC) ????? ?? ??????? methicillin (MECA) ??????? ???? ?????? ???????????? ????? 1 . SCC MEC ??????? ?? ??? ??????? ?? ????? ???? ?????? ???????, ??? ??????? ?????? ??????? (???? ??? MEC ??????? ?? CCR), ??? J-?????? (???? 1). ???? ?? MEC ????? ?IS 431mec, Meca, ????? ????? ?? ??????? ?? ??? ?????????, mecR1 ?mecI, ????? ???? ?? CCR ????? ?? recombinases (CCR / ccrAB) ??? ????? ????????? ?? SCC MEC ??????? ??? ? ???????? ???? 1. ??????? ??? ??? ??????? MEC ???? (mecB </em&gt; ?MECC) ?????, ????? ????? ???????? ???? Meca ??? 2. ??? ????? MEC SCC ????? ?????? J (J1, J2, J3 ?) ??????? ??? ?????? ?????? CCR MEC ??????? ???? ?? ?????? ?????. ???? ???? ????? ?? MEC ????? (???? A, B, C, D ?-E) ?allotypes ?? CCR ????? (???? 1-8) ??????. ??????? ????? ?? ??????? ???????? ??? ?allotypes ????? ???? MEC SCC ?????. ?? ?? ??????? ?? SCC MEC ????? ?????? ?? ??? ????? ?????? ?????????? ?????? ?? ?????? ???????? ???? Staphylococcal (IWG-SCC), ?????? MEC SCC ??????? ?????? ???????? ?? ???? ?? MEC ?????? ???? CCR, ??? ????? ???? ???? ?? ?? ?????? ????? J 1-DNA. MRSA??????? ??????? ???? ??? ?? ??? ????? ?? ???? ????? MEC SCC ?????? ?? ????? ?? ??? (?? / ????) ????? ???????? ?? ??? ?????, ???? ????? multilocus ??? (ST) ? / ?? ????? staphylococcal ?? (???) ????? (???? ST8 -T008-MRSA-IVA). ???, SCC MEC ????? ??? ??? ???????? ???? ???? ????? ????????????? ?????? ?? ????? ?? MRSA, ?????? ?? ?????????? ???????? ?? ????? ??????? MRSA (CA-MRSA) ?????? ?? ???? ????? ?????. ??????? ????? PCR ???????? ????? SCC MEC ?? ??? ????? ?????? MEC ???? ?????? ??????? CCR ????, ??? ?????? ????? ???? (20 ?? 30) ??? ?????? ???????? PCR ?????? ??????. Okuma et al., ????, ????? 21 ???????? ??????? ???? ?? PCR ???? ??? ?????? SCC-MEC ??? IVb 3. ????? et al. Subse?????? ??? ????? assay ??? ???? ?????? ?? CCR, MEC, ??????? ?????? ?J-???????, ??? ?? ?? ???? ???? ?? ?? ???????? ??????? PCR ???? 4. ??? ???? ????? MEC SCC, ????? PCR (M-PCR) ????? ?????? ??????? ?????? ????? ????? ?????? PCR ???. ?? Lencastre ??????? ????? M-PCR ?????? ????? ?? SCC MEC I-IV, ?????? ???? ??? ?SCC MEC ??????, ?? M-PCR ???? ?????? ?? SCC MEC IV 5,6,7. ?? ???, ????? ???? ?? ???? ???? ????, ?????? 2 ?????? ??? ????? ?? SCC MEC IV, ?????? ???? ?? ??? typeable. ??????? ???? ?? ????? MEC SCC, ?????? ?????? assay PCR ????? ???? ?????? ????? ?? ????? ??? ??? ???? V 8 MEC SCC ??????, ????? ??? ????? ???? ????? ? ??? ???ecame ???? 9. assay ???? ?? ????? ???? MEC SCC ?????? ?????? ???, ?? ???? ???? ?????? ????? ????? ?????? (337 ??????; ?????? 30 ????? 2013). ??? ?????? ??????, ?????? ????? ???? ????? ??????? ?????? assay ?? ???? ?????? MEC ???? ??? MRSA SCC ????. ??? ????? ??????? ?? assay ????? ?? ?? ???????? ??????? ??????, ?? ???????? ??????, ??? ????? assay ?? ??????? ??????. ??? ???? ?? ?????? ?? ???? assay MRSA SCC MEC, ????? ?????? ??? ?????? ???? ?????? ?? M-PCR ???? ?SCC MEC ?????, ??? ?? ???? ???? ?????? ???????? ????????? ??????????? ??????? ???? ????????.

אגר <table><tbody><tr><td>סויה טריפטי</td><td>פישר (BD)</td><td>CA90002-700 (236920)</td><td></td></tr><tr><td>מים מזוקקים סטריליים</td><td>Life Technologies</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq: כולל 10x מאגר PCR ו-50 מ"מ MgCl2</td><td>Life Technologies</td><td>10966-034</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dNTP</td><td>Life Technologies</td><td>10297-018</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15576-028</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Life Technologies</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Life Technologies</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>1Kb+ חיי סולם DNA</td><td> טכנולוגיות</td><td>10787-026</td><td></td></tr><tr><td>אתידיום ברומיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E7637</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל </td><td>VWR (Axygen Scientific)</td> <td>10011-700</td><td></td></tr><tr><td>מקלות תרבית</td><td>VWR</td><td>CA10805-018</td><td></td></tr><tr><td>צינורות PCR</td><td>קוטר</td><td>AD0210-FCN (חדש #: DIATEC420-1250)</td><td></td></tr> <tr><td>צנטריפוגה</td><td>אפנדורף</td><td>5417c</td><td></td></tr><tr><td>בלוק חום</td><td>VWR</td><td>13259-030 / 13259-286</td><td></td></tr><tr><td>Thermalcycler</td><td>Applied Biosystems (2720)</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>תא אלקטרופורזה ג'ל אופקי וצולל עם תבנית ג'ל</td><td>BioRad</td><td>170-4469</td><td></td></tr><tr><td>ספק כוח</td><td>BioRad</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>שייקר נדנדה</td><td>VWR</td><td>40000-300</td><td></td></tr><tr><td>מולקולרי מערכת Imager Gel Doc</td><td>BioRad</td><td>1708170</td><td></td></tr></tbody></table>

multiplex assay pcr ?????? ?? ???? mec ???????? ???? staphylococcal i ?v ?-methicillin<em&gt; ???????????</em

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Staphylococcal ???? ???????? MEC (SCC MEC) ????? ??? ??? ???????? ???? ???? ????? ???????? ?? ????????????? ??????? ?? ??????????? Methicillin ???? (MRSA), ?????? ?? ?????????? ???????? ?? ????? ??????? MRSA (CA-MRSA) ?????? ?? ???? ????? ?????. ??????? ????? PCR ???????? ????? SCC MEC ?? ??? ????? ?????? MEC ???? ?????? ??????? CCR ????, ??? ?????? ????? ???? ??? ?????? ???????? PCR ?????? ??????. ?????? ??????? assay PCR ????? ???? ?????? ????? ?? ????? ??? ??? ???? V MEC SCC ??????, ????? ??? ????? ???? ????? ??? ??? ??? ????. assay ???? ?? ????? ???? MEC SCC ?????? ?????? ???, ?? ???? ???? ???? ????? ???? ????? ?????. ?? ???, ??? ?? ??????????? ?? assay ????? ?? ?? ???????? ??????? ??????, ?? ???????? ??????, ??? ????? assay ?? ??????? ??????. ??? ???? ?? ?????? ?? ???? assay MRSA SCC MEC, ??? ??? ??????? ???? ?????? ?? assay PCR ?????, ????? ???? ?????? ???????? ????????? ??????????? ?? ???? ?? ?? ??????.

שיטה זו המעודכנת של M-PCR מסוגלת לקבוע (לסווג) את סוגי SCCmec I-V, כמו כן תת-סוגים עיקריים של SCCmec IV. הבדיקה מתמקדת באתרים ייחודיים וספציפיים של SCCmec I, II, III, IVa, IVb, IVc, IVd, IVE ו-V, עם זיהוי נלווה של הגן mecA. זיהוי ראשוני של SCCmec VI ו-VIII הוא אפשרי גם כן, אך ידרוש בדיקות נוספות לאישור. איור 3 מדגים SCCmec I-VI ו-VIII מייצגים ואת מיקומם של כל יעד בתוך האלמנט.
הפריימרים הספציפיים לסוג I (אדום) פוגעים ב-orf E...

אנו מדגימים בדיקת PCR מולטיפלקס פשוטה לסינון והקלדה מהירים של כרומוזום קלטת סטפילוקוקלית (SCCmec) סוגים I-V עבור סטפילוקוקוס זהוב עמיד למתיצילין, ומספקים כמה מהשלבים החיוניים והניואנסים הפרוצדורליים שהופכים אותה למוצלחת בהתאמת בדיקה זו למעבדות בודדות.

Multiplex assay PCR ?????? ?? ???? Mec ???????? ???? Staphylococcal I ?V ?-methicillin<em&gt; ???????????</em

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לקבוע את סוג ה-SCC MEC של בידודים של Staphylococcus aureus עמיד למתיצילין (MRSA) באמצעות בדיקת multiplex PCR. הדבר מושג תחילה על ידי בידוד DNA מהזנים, תוך שימוש בטכניקת מיצוי מהירה ופשוטה הכוללת חימום של התאים הבקטריאליים במים. השלב השני הוא ביצוע בדיקת multiplex PCR כדי להגביר מטרות ספציפיות לכל אחד מסוגי ה-SEC ME.בשלב הבא, תוצרי ה-PCR מופרדים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל AROS. השלב הסופי הוא צביעת הג'ל לצורך ויזואליזציה של ה-DNA וניתוח נתונים. בסופו של דבר, השילוב הייחודי של תוצרי PCR ספציפיים שהתקבלו באמצעות בדיקת multiplex PCR זו משמש לקביעת סוגי ה-SE cmec של בידודי ה-MRS A. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תכניות S CEC טיפוסיות מסורתיות, המכוונות לקומפלקסים בודדים של גני CCR ו-MEC ודורשות מספר רב של מבחנות PCR נפרדות, הוא שתהליך זה מפשט משמעותית את עומס העבודה וניתן לביצוע במבחנת PCR אחת.יש לבצע הליכים אלו במעבדה מאושרת ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2). יש להשתמש בציוד מגן אישי מתאים בכל עת ביום שלפני ביצוע ה-PCR. בחר מושבה בודדת של MRSA ממיכל גידול טרי שגדל בן לילה באמצעות מקל תרבית סטרילי, והכן מריחה דחוסה של החיידקים על צלחת triptych soy agri.ניתן לבצע מריחה של מספר דגימות על צלחת אחת ולהדגיר למשך לילה ב-37 °C. הוסף 75 µL של מים מזוקקים סטריליים לשפרוret של מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 mL. השתמש במקל תרבית סטרילי.קחו כמות קטנה של בקטריות מהמריחה הכבדה של הלילה. ערבבו את הבקטריות במים סטריליים להכנת תמיסה עכורה. חזרו על תהליך זה עבור כל הדגימות.דגרו את המבחנות בבלוק חימום יבש המכוון ל-95 °C למשך 10 דקות כדי לליז את החיידקים ולשחרר את ה-DNA. הוציאו את הדגימות מבלוק החימום והניחו להן לעמוד בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. סבבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 13,000 RPM למשך דקה אחת.הדגימה המתקבלת כוללת משקע של פסולת תאית ונוזל על (supernatant) צלול המכיל את ה-DNA. כדי להיערך ל-PCR, הוצא את ריאגנטים ה-PCR, כולל PCR buffer 10X, מגנזיום כלוריד 50 millimolar, DTPs ופריימרים, מהמקפיא בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס והנח להם להפשיר בטמפרטורת החדר על משטח עבודה נקי ל-PCR, שבו אין להכניס חיידקים או DNA. ניתן להכין ולסמן מבחנות PCR בנפח 0.2 milliliter בשלב זה.לאחר ההפשרה, יש לבצע ערבוב קצר במכשיר vortex כדי לערבב את כל הריאגנטים, ולאחר מכן לשלב אותם בהתאם לטבלה בפרוטוקול הטקסט. חשוב להשתמש ב-platinum tech DNA polymerase, שכן נמצא כי הוא משפיע על הצלחת התגובה. לאחר חלוקת ה-master mix לתוך מבחנות ה-PCR האינדיבידואליות באמצעות vortex, סגור את כל מבחנות ה-PCR והעבר אותן לשולחן העבודה הכללי.הוסיפו את התבנית למבחנות ה-PCR על ידי פיפטה של 2 µL מהנוזל העליון (supernatant) הצלול מדגימות החיידקים שהוכנו קודם לכן. עברו למיקום הייעודי להגברה לפני הנחת המבחנות במכשיר ה-thermal cycler והרצת התגובה כפי שמפורט בפרוטוקול הכתוב. עבדו במיקום ייעודי לאלקטרופורזה של ג'ל, עם 2.5 g של agarose ל-100 mL של 0.5 X TAE buffer בתוך בקבוק ארלנמאייר מזכוכית.כסו את הבקבוק בנייר נשבך והרתיחו את התמיסה במיקרוגל עד להמסה מלאה. ג'ל בריכוז של 2.5% יגלוש במהירות מהבקבוק בעת הרתיחה. לכן, עצרו את המיקרוגל וסובבו את התמיסה מדי פעם.קררו את ה-agros עד למגע נעים על ידי סיבוב תחת מים קרים או על ידי השהייה על השולחן למשך חמש דקות. שפכו את ה-agros לתבנית היציקה לאחר הוצאת המבחנות מה-PCR thermal cycler. הכינו את הדגימות על ידי הוספת 2 µL של צבע טעינה 6 XDNA לכל דגימה.טען 5 עד 10 µL של דגימה לכל באר בג'ל. סולם DNA של 1 KB plus או 100 bp מתאים לגדלי הפסים הצפויים. ניתן להוסיף אתיודיום ברומיד לג'ל לפני המזיגה, או לחלופין, ניתן לצבוע את הג'ל באמבט של אתיודיום ברומיד לפני הוויזואליזציה.הניחו את הג'ל המוכן בתמיסה של 0.5 micrograms per milliliter של atherium bromide ומים מזוקקים, וערבבו בעדינות על שייקר למשך 10 דקות. העבירו את הג'ל למכל נקי והשאירו במים מזוקקים למשך 10 דקות נוספות. מוצג כאן ג'ל מייצג המדגים את תוצרי ה-PCR הצפויים עבור כל הזנים המייצגים של SEC MEC מסוגים 1 עד 6 ו-8, וכן עבור תתי-הסוגים A עד F של SEC MEK 4. עבור זן טיפוסי של SEC MEK 1 צפויות שתי רצועות.הפס הספציפי לסוג one ב-613 base pairs וכן ה-mec, פס ביקורת ב-147 base pairs. מוצגים שלושה זנקים מייצגים של SEC MEK two, כולל ה-type two הפרוטוטיפי של זנק N three 15 והסוגים הפחות נפוצים Type two A ו-type two B. כדי לסווג זנק כ-SEC mek two, שני פסים צריכים להיות נוכחים, כולל היעד של ה-type two locus ב-128 base pairs והביקורת של Meca. שני זנקים מייצגים של SEC MEK three מוצגים על הג'ל, כולל ה-SEC MEK three הפרוטוטיפי של זנק 85 2 0 8 2 והסוג הפחות נפוץ type three A של זנק JCSC two 90. זיהוי של SSC MEC three מתבסס על נוכחותם של שני תוצרי PCR, כולל היעד הספציפי לסוג three ב-257 base pairs ויעד ביקורת של Mecca.ה-SEC MEC three הדומיננטי יהיה חיובי גם למטרה של כספית ב-280 base pairs, שנשאת על אלמנט SEC סמוך ומשמשת להבחנתו מה-SEC MEC three A five הפחות נפוץ. מוצגים אלמנטים מייצגים של SEC MEC four, כולל סוגים four A, four B, four C, four D, four E ו-four F. בניגוד ל-SC MEK one עד שלושה, אין מטרה אחת הנוכחת בכל תתי-הסוגים של SCC MEK four, למעט meck A. זן SCC MEK four E המייצג מזוהה על סמך נוכחות הפס של Type four E וכן תוצר ה-CCR AB four, שנמצא על אלמנט עזר סמוך, ותוצר ה-type four C שנמצא מכיוון ש-SEC MEK four E חולק את אותו אזור J one כמו SE Cmk four C. ה-SCC MEK four F דומה ל-SEC MEK four E בכך שהוא חולק את אותו אזור J three ולכן הוא חיובי למטרה four E וכן חיובי למטרה CCR AB four בשל אלמנט עזר סמוך. עם זאת, ניתן להבחין בין S Cmk four F לבין S CMK four E בכך שחסרה בראשון המטרה type four C.במקרה טיפוסי של SE CMK 5, יופיעו שני תוצרי PCR על הג'ל: הפס הספציפי לסוג 5 בגודל 325 base pairs והבקרה ME בגודל 147 base pairs. לבסוף, אף שמטרת בדיקה זו לא הייתה לספק זיהוי מוחלט של SE CMK 6 או 8, נכללו זנים מייצגים עבור שניהם, שכן תבנית PCR ספציפית מספקת ראיות המצביעות על נוכחותם של סוגים אלו.בנוסף למטרה Meck A, ה-SEC MEK six המייצג צפוי להפיק תוצר CR AB ארבע חיובי באורך 106 זוגות בסיסים, שכן זהו סוג ה-CCR complex העיקרי שלו. ה-SEC MEC שמונה המייצג יהיה חיובי גם עבור MEC A באורך 147 זוגות בסיסים ועבור C-C-R-A-B ארבע באורך 106 זוגות בסיסים, וניתן יהיה להבדילו מה-SEC MEK שש על בסיס תוצר ספציפי לסוג שני חיובי, הנובע מכך שיש לו את אותו אזור J שני כמו ל-SEC MEK שני. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי בשל אופיו המורכב של הבדיקה והמספר הרב של הפריימרים הנוכחים בתגובה, קיימת אפשרות לקשיים.בעת התאמת פרוטוקול זה למעבדות בודדות, תשומת לב מעמיקה לסוגיות מפתח מסוימות, כגון הכנת תבנית ה-DNA ומותג ריאגנט ה-PCR, תסייע רבות להשגת מטרה זו.

multiplex-pcr-assay-for-typing-staphylococcal-cassette-chromosome-mec

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

שיטה זולה, תפוקה גבוהה לגילוי סימולטני של עד 43 מטרות מולקולריות מתואר. יישומים של mPCR / RLB כוללים הקלדה וזיהוי של חיידקים פתוגנים רבים של דוגמאות קליניות.

Multiplex PCR הפוך כתם וקו הכלאה Assay (mPCR / RLB)

אנו מתארים זמנית PCR לזיהוי מהיר של סלמונלה enterica serovars enteritidis, הדר, היידלברג, ו Typhimurium. Serovars סלמונלה מסוימים ניתן לזהות על ידי מיקוד זמנית PCR לגנים רצפים ייחודיים אשכול O-האנטיגן ביוסינתזה ו flagellin של serovar נתון. Serovar מוקצה אז סלמונלה לבודד המבוססת על הופעתו של, amplicons גודל מסוים (מוצר PCR) המתאים אלל היעד.

Allelotyping PCR לזיהוי סלמונלה enterica Serovars enteritidis, הדר, היידלברג, ו Typhimurium

אנו מתארים שיטה זמנית לצורך זיהוי של מיקרואורגניזמים בתוך מדגם באמצעות חרוזי ניאון oligonucleotide מצמידים. Amplicon מכל האורגניזמים בתוך מדגם הוא הכלאה בפני פאנל של בדיקה, בשילוב חרוזים. מכשיר Luminex או Bio-Plex משמש עבור כל שאילתת חרוז חרוז סוג האות הכלאה.

Multiplex זיהוי של חיידקים דוגמאות מורכבות קלינית הסביבה באמצעות oligonucleotide מצמידים פלורסנט microspheres

biosensors phage ממוסס וחרוזים נוגדנים מסוגלים להבחין בין Methicillin עמיד (MRSA) וחיידקים סטפילוקוקוס רגישים. לפאגים היו משותקים על ידי שיטת אנגמיור-Blodgett על גבי משטח של חיישן microbalance גביש קוורץ ועבדו כבדיקות סטפילוקוקוס מגוון רחבות. חרוזים נוגדנים לזהות MRSA.

Biosensor לאיתור של חיידקי סטפילוקוקוס עמידים לאנטיביוטיקה

Microarray הגברה משלב הכלאת הגברה וmicroarray PCR אסימטרי לתוך תא בודד, אשר מייעל באופן משמעותי את זרימת עבודה microarray למשתמש הקצה. פישוט זרימת העבודה microarray הוא צעד ראשון הכרחי ליצירת אבחון מבוסס microarray שניתן להשתמש באופן שיגרתי בסביבות נמוכים יותר משאבים.

הוכחת סמים רבים עמידים<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; Microarray ההגברה

פרוטוקול זה מתאר את הזיהוי של אינטגרונים מסוג 1 וקלטות הגנים הקשורות אליהם במזון.

הקרנת מזון לכיתה Integrons 1 וג&#39;ין קלטות

כאן, נעשה שימוש במרווח ריבוזומלי PCR (RS-PCR) יחד עם מערכת אלקטרופורזה ממוזערת כשיטה מהירה וברזולוציה גבוהה לגנוטיפ S. aureus בעלויות מתונות המאפשרות תפוקה גבוהה.

genotyping של<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; על ידי ריבוזומלי Spacer PCR (RS-PCR)

אנו מציגים שתי ערכות RT-qPCR חד-שלביות מבוססות בדיקה עבור וירוסים נשימתיים נפוצים. הבדיקה הראשונה היא עבור SARS-CoV-2 (N), שפעת A (H1N1 ו- H3N2) ושפעת B. השני הוא עבור SARS-Cov-2 (N) ו- MERS (UpE ו- ORF1a). בדיקות אלה ניתן ליישם בהצלחה בכל מעבדה מיוחדת.

פיתוח מבחני RT-qPCR בזמן אמת לזיהוי SARS-CoV-2, שפעת A/B ו-MERS-CoV

הפרוטוקולים של ניצול לפתוח זרימת biofilms מערכת עם כורים זרימה טפטוף וסיבוב כורים דיסק מוצגים בפירוט.

השימוש זרימה טפטוף ו כורים דיסק סיבוב עבור Staphylococcus aureus Biofilm ניתוח

העור Murine מודל זיהום ברקמות רכות מנוצל להערכת תפקוד ארסיות של Staphylococcus aureus עמידים methicillin (MRSA) לבין התגובות החיסוניות המארח. כאן, הצגנו מודל זיהום תת עורי לעור זיהום ברקמות רכות.

זיהום תת עורי של סטפילוקוקוס אוראוס עמיד Methicillin (MRSA)

למדו שיטת PCR מרובבת לזיהוי מהיר של סוגי SCCmec I-V בחיידקי MRSA. הטכניקה מפשטת את אופיינות זני Staphylococcus aureus עמידים למתיצילין ומייעלת מעקב אפידמיולוגי במעבדות קליניות.

Multiplex assay PCR ?????? ?? ???? Mec ???????? ???? Staphylococcal I ?V ?-methicillin

גלה סרטונים נוספים