זיהוי אוכלוסיות נוירונים חושיים ספציפיים לחקר תעלות יונים מבוטאות
24 בדצמבר 2013
נוירונים חושיים מאותתים מידע חושי מהפריפריה למערכת העצבים המרכזית. זיהוי נוירונים אפרנטיים ספציפיים יעזור בהבנת הפיזיולוגיה שלהם. אנו מתארים שיטה של תיוג לאחור לזיהוי נוירונים אפרנטיים, וחוקרים את תעלות היונים עם שער המתח בתאי עצב אלה באמצעות אלקטרופיזיולוגיה ואימונוציטוכימיה של מהדק טלאי.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות נוירונים מגיעים על ידי תיוג צבע לאחור ולחקור את תעלות היונים בתאי עצב אלה באמצעות אלקטרופיזיולוגיה ואימונוכימיה של מהדק טלאי. זה מושג על ידי הזרקת DAI תחילה לרקמת המטרה כדי לסמן את הנוירונים המעצבבים. השלב השני הוא לבודד נוירונים אפרנטיים מגרעיני השורש הגביים.
לאחר מכן, הנוירונים המסומנים מהודקים טלאי כדי להקליט את תעלות היונים המגודרות, השלב האחרון הוא לזהות תעלות יונים מבוטאות בתאי העצב המסומנים באמצעות אימונוכימיה. בסופו של דבר באמצעות שילוב של טלאי, מהדק ואימונוכימיה, אנו מסוגלים לזהות את דפוס הביטוי כמו גם את התכונות התפקודיות של תעלות היונים בתאי עצב מגיבים. היתרון העיקרי של שיטה זו על פני שיטות קיימות אחרות הוא שמדובר בשיטה לא פולשנית וה-DAI בו אנו משתמשים, DAI I ידוע בקליטתו המהירה על ידי המסופים העצביים.
חוסר העברה בין נוירונים ושימור ארוך טווח בתוך הנוירונים שאנו מזריקים. נדגים את ההליך אני וסטפני, טכנאית מחקר מהמעבדה שלנו להזרקת צבע. ראשית, גלחו את השיער מעל אזור העגל בשתי רגלי החולדה המורדמת באמצעות סכין גילוח חשמלי.
לאחר מכן, מלאו מזרק סטרילי CC אחד ב-200 מיקרוליטר של תמיסת 1.5% Dai. הכנס לאט את המחט במקביל לציר הארוך של כל שריר גסטרו והזריק 100 מיקרוליטר דאי לשריר לפני הוצאת המחט מהשריר. משוך לאחור את בוכנת המזרק כדי להבטיח שהצבע כבר לא יזרום מהקצה.
המתן 10 שניות ולאחר מכן משוך את המחט מהשריר. נדרשים ארבעה עד חמישה ימים כדי להגדיר את חלוקת הצבע לדיסקציה. מניחים עם 10 מיליליטר HBSS, צלחת פטרי 35 מילימטר וצלחת פטרי 100 מילימטר על קרח.
לאחר מכן, שקלו שבעה מיליגרם קולגנאז, מיליגרם אחד של DNA ו-10 מיליגרם של חימום מוקדם של טריפסין, אמבט מים רועד ל-37 מעלות צלזיוס וחממו צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של EBSS באמבטיה. לאחר המתת חסד של החולדה לפני הניתוח, חתכו במהירות את העור בגב החיה. לאחר מכן הסר את רקמת החיבור והשריר לאורך עמוד השדרה לחשיפה טובה יותר.
לאחר מכן, הסר את החלק המותני של עמוד החוליות. לאחר מכן, הניחו את עמוד החוליה המבודד בצלחת פטרי בגודל 100 מילימטר. מרחו תמיסת HBSS צוננת באמצעות פיפטת מרעה סטרילית כדי לשמור על התכשיר לח וקר.
חותכים את השרירים מצידי עמוד החוליות. בצע כריתת למינקטומיה גבית באמצעות רונג'ורים או מספריים כדי להסיר בעדינות את העצם וסגירת השקעים המכילים את גרעיני השורש הגביים. שוב ושוב. החל HBSS קר כקרח במהלך הליך זה.
תחת המיקרוסקופ, בודד את ה-DRG על ידי חיתוך העצבים ההיקפיים והמרכזיים, והשאיר מילימטר עד שני מילימטרים של עצב כדי להקל על הטיפול בגרעין. לאחר מכן הנח את ה-DRG המבודד בצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר המכילה מאגר HBSS קר כקרח. חזור על ההליכים עד שכל L ארבע ו-L חמש DRG מבודדים.
הסר עודפי עצבים וכלי דם באמצעות מספריים מיקרו ומלקחיים. חתוך את ה-DRG לחשיפה טובה יותר לאנזימים, אך אל תסיר את ה-DRG לדיסוציאציה של נוירוני DRG. הוסף את האנזימים למדיה החמה של EBSS, ולאחר מכן מערבולת כדי להמיס ולסנן סטריליזציה.
לאחר מכן, הנח את כל ה-DRG בתמיסת האנזים עם ראש צינור מרעה סטרילי. לאחר מכן מבעבעים את הבקבוק עם 95% חמצן ו-5% CO2 למשך 60 שניות לפני שסוגרים היטב את הבקבוק. לאחר מכן דגרו את הבקבוק באמבט מים מטלטלים של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות ב-240 סל"ד.
בסוף הדגירה במרץ. נער את הבקבוק 50 פעמים כדי לנתק את ה-DRG בתנאים סטריליים. הוסף חמישה מיליליטר של MEM פלוס לבקבוק כדי לעצור את הפעילויות האנזימטיות.
העבירו את תכולת הבקבוק לצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מיליליטר, וצנטריפוגה ב -16 פעמים G למשך שש דקות. לאחר מכן, הסר והשליך את הסופרנטנט. הוסף חמישה מיליליטר של MEM פלוס לדגימה טריטראט בעדינות עם פיפטה.
כדי לפרק את הגלולה חזור על שלב הצנטריפוגה, הסר והשליך את הסופרנטנט והוסף 500 מיקרוליטר של MEM בתוספת טריטראט בעדינות עם קצה הפיפטה של מיליליטר אחד על פיפטה ליצירת תרחיף תאים. לאחר מכן, הניחו כיסוי זכוכית מצופה פוליליזין לתוך צלחת ריקה וסטרילית של 35 מילימטר. לאחר מכן הוסף טיפה של מתלה התא למרכז החלקת הכיסוי.
חזור על הליך זה עד למיצוי תמיסת התא. הנח את הכלים של 35 מילימטר באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך שעה כדי לאפשר לתאי העצב להיצמד לשפתיים החלקות הכיסוי לאחר שעה. הוסף שני מיליליטר נוספים של מדיה לכל מנה והחזיר אותם לחממה כדי לבצע הקלטת מהדק תיקון.
ראשית, זהו את נוירוני ה-DRG המסומנים בצבע באמצעות מיקרוסקופ עם אפי פלואורסצנטי. לאחר מכן, מלאו את אלקטרודת הזכוכית בתמיסה פנימית. הקש בעדינות כדי להסיר בועות כלואות.
לאחר מכן הנח את האלקטרודה במחזיק האלקטרודה. הורד את האלקטרודה לתא באמצעות מיקרו מניפולטור. לאחר שהאלקטרודה נוגעת בתא, הפעל יניקה עדינה דרך צינור היניקה עד שנוצר אטימה הדוקה.
לאחר מכן מהדק את מתח הממברנה בפוטנציאל ההחזקה הרצוי. השג את כל תצורת מהדק תיקון התא על ידי הפעלת יניקה חזקה יותר. כדי להסיר את תיקון הממברנה בקצה האלקטרודה, לאחר שנקבעה תצורת מהדק תיקון תא שלם, התחל את ההקלטה.
בהליך זה, תקן את הנוירונים על תלושי הכיסוי עם 4%para פורמלדהיד למשך שעה. לאחר מכן לחלחל את הנוירונים עם 2% בין 20 ב-PBS למשך 10 דקות. לאחר מכן, דגרו את התאים בתמיסה חוסמת למשך שעה.
תאי הבדיקה מודגרים בתמיסת החסימה בתוספת נוגדן ראשוני למשך הלילה. קבוצת הבקרה של הנוירונים נותרת לדגור בן לילה בתמיסת חסימה ללא נוגדנים ראשוניים. למחרת, שטפו את החלקות הכיסוי עם בופר PBS שלוש פעמים למשך חמש דקות כל אחת, ולאחר מכן שתי שטיפות של חמש דקות כל אחת עם 1% עד 20 כדי להסיר נוגדן ראשוני לא קשור.
לאחר מכן דגרו את החלקות כיסוי הבדיקה והבקרה עם הנוגדן המשני המתויג פלואורסצנטי המתאים למשך 30 דקות, אשר נקשר לנוגדנים הראשוניים כדי לאפשר הדמיה. לאחר מכן, שטפו את החלקות הכיסוי עם PB S3 פעמים למשך חמש דקות כל אחת כדי להסיר עודפי נוגדנים משניים. לאחר מכן, הרכיבו את החלקות הכיסוי על מגלשת זכוכית נקייה באמצעות אמצעי הרכבה.
לאחר מכן מרחו לק שקוף על קצה החלקת הכיסוי כדי לקבע אותו במקומו. לאחר הייבוש, דמיין את הנוירונים וצלם תמונות באמצעות התוכנה המלווה את המיקרוסקופ הקרינה. זהו ייצוג של הזרקת דאי לשריר הגסטרו והובלה לאחור מהשריר ל-DRG.
ה-L ארבע ו-L חמש DRG מסומנים כאן. הנוירונים הנכנסים מוצגים בתמונת השדה הבהיר ותמונה פלואורסצנטית זו מציגה צבע אחד המסומן בנוירון אפרנטי של השריר. היסטוגרמה זו מציגה את עוצמת הפלואורסצנט DII של נוירונים חושיים.
השיא הגדול הוא מנוירונים לא מסומנים ומצויד במשוואה גאוס לקביעת העוצמה הממוצעת וסטיית התקן. הקו האנכי המקווקו מייצג את הסף לתיוג DAI. ההיסטוגרמה כוללת נתונים מ-1047 נוירונים כאשר 167 מסומנים בדאי.
לפניכם נוירון שריר מייצג עם שליטה טובה במתח הממברנה. זרמי הנתרן במינוס 20, מינוס 10 ואפס מילי-וולט מוצגים משמאל ויחס מתח הזרם מוצג מימין. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לנתח במהירות אך בעדינות את ה-DRGs ולשמור על התכשיר לח שוב ושוב בקוד קרח hbss.
בעקבות הליך זה, ניתן לתייג ולזהות נוירונים אחרים כדי להבין את תפקידם בפיזיולוגיה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה לזיהוי נוירונים תחושתיים אפרנטיים באמצעות סימון רטרוגרדי בצבע, ובחינה של תעלות היונים שלהם באמצעות אלקטרופיזיולוגיה בשיטת patch clamp ואימונוכימיה. גישה זו מאפשרת לחוקרים להפיק תובנות לגבי התכונות הפיזיולוגיות של נוירונים אלו.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- נוירונים תחושתיים אפרנטיים מעבירים מידע תחושתי למערכת העצבים המרכזית.
- הבנת הפיזיולוגיה של נוירונים אלו היא קריטית למחקר במדעי המוח.
- סימון רטרוגרדי הוא טכניקה המשמשת לזיהוי נוירונים ספציפיים.
- אלקטרופיזיולוגיה בשיטת Patch clamp מאפשרת לחקור את הפעילות של תעלות יונים בנוירונים.
מטרת המחקר
- זיהוי נוירונים אפרנטיים באמצעות סימון בצבע רטרוגרדי.
- חקר תעלות יונים תלויות-מתח בנוירונים אלו.
- הבנת דפוסי הביטוי והתכונות הפונקציונליות של תעלות יונים בנוירונים אפרנטיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הזרקת DAI לרקמה המטרה לצורך סימון נוירונים אפרנטיים.
- בידוד של נוירונים אפרנטיים מגנגליון השורש הדורסלי.
- ביצוע Patch clamping לנוירונים המסומנים להקלטת פעילות תעלות יונים.
- אימונוכימיה לזיהוי תעלות יונים המובעות בנוירונים המסומנים.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת זיהוי לא פולשני של נוירונים אפרנטיים.
- DAI מדגים ספיגה מהירה על ידי סיומים עצביים.
- ניתן לאפיין ביעילות תכונות תפקודיות של תעלות יונים.
- השילוב של הטכניקות מספק הבנה מקיפה של פיזיולוגיית הנוירונים.
מסקנות
- שיטה זו משפרת את היכולת לחקור נוירונים אפרנטים ואת תעלות היונים שלהם.
- היא מציעה יתרונות על פני שיטות מסורתיות הודות לאופייה הבלתי פולשני.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על ממצאים אלו כדי לחקור את התפקודים הנוירונליים באופן מעמיק יותר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
זיהוי מדויק ואפיון תפקודי של תתי-אוכלוסיות של נוירונים תחושתיים הם קריטיים להפחתת סיכונים בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות המכוונות לערוצי יונים. תהליך עבודה זה מאפשר בחינה ממוקדת של ביטוי ותפקוד של ערוצי יונים במעגלים נוירונליים הרלוונטיים למחלה, ובכך תומך בביטחון חיזוי בתיקוף המטרה ובהבנה מכניסטית. שילוב של סימון רטרוגרדי עם patch clamp ואימונוציטוכימיה מספק בסיס חסון למיון תיק תרופות ולהמשכיות תרגומית במחקר ופיתוח של טיפולים נוירותרפויטיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר זיהוי סלקטיבי של נוירונים תחושתיים המעצבבים שרירים, לצורך תיקוף של מטרות ספציפיות למסלול.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית (mechanistic de-risking) על ידי קישור ביטוי של תעלות יומיות ליכולת עירור תפקודי באוכלוסיות נוירונליות מוגדרות.
- מאפשר ביטחון חזוי במעורבות המטרה על ידי שילוב של מדדים פונקציונליים ומולקולריים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין אוכלוסיות נוירונים שעברו ולידציה עבור בדיקות אלקטרופיזיולוגיות ואימונוציטוכימיות המשך.
- מאפשר כימות הדיר בביצועיו (reproducible) של פעילות ותעתוק של תעלות יונים בקבוצות תאים מוגדרות.
- תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה ובשרירות (scalability) לצורך סריקת תרכובות במערכות הרלוונטיות למחלה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים נתונים פונקציונליים של תעלות יונים למודלים של מחלות כגון מחלה פריפרית של כלי הדם או אי-ספיקת לב.
- מספק רצף מהגילוי התאי ועד לתיקוף פרה-קליני של מטרות נוירונליות.
- מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים המבוסס על תובנות מכניסטיות לגבי עירור נוירונלי.
שילוב זרימת עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מאימות ראשוני של המטרה דרך פיתוח בדיקות ומחקר פרה-קליני, ובכך היא תומכת בבדיקה חזרתית של היפותזות ובצמצום סיכונים מכניסטיים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בזיהוי מבוסס-היפותזה של תתי-סוגי נוירונים ואפיוני תעלות היונים שלהם.
- סריקה: מספקת תוצרי אלקטרופיזיולוגיים ואימונוציטוכימיים כמותיים וניתנים לשחזור לצורך מוכנות הבדיקה.
- אנליטיקה: מספקת ספים סטטיסטיים לסימון נוירונים ומדידות זרם כמותיות לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין תפקוד תעלות יונים תאי לבין פנוטיפים של עירור הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה זרימת עבודה מודולרית הניתנת להתאמה לאוכלוסיות נוירונים אחרות ולמדלי מחלה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזיוי ומפחית עמימות מכניסטית בתהליך תיקוף של מטרות תעלות יונים.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של זיהוי נוירונים ואפיון תפקודי למען הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק מידע לקבלת החלטות של go/no-go ומשפר את יעילות ההון על ידי התמקדות במטרות נוירונליות מתוקפות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של תוכניות לטיפול נוירו-תרפויטי המבוסס על נתונים מכניסטיים חסונים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיסקציה של נוירונים, אלקטרופיזיולוגיה בשיטת patch clamp ואימונוציטוכימיה.
- מחייב גישה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית, מערכות אלקטרופיזיולוגיות ותוכנות אנליטיות לניתוח כמותי.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי סימון, הקלטה וניתוח.
- ניתן להתאמה למערכות נוירונליות אחרות באמצעות בחירה מתאימה של צבעים ומיקוד ברקמה הרלוונטית.
- תלוי בזמינות של נוגדנים ספציפיים וחוסמי תפקוד לצורך אפיון מקיף של תעלות יונים.
