הכנת ראשונית לנוירונים חזותי neurites במצב קפוא-התייבשות באמצעות Cryo-אלקטרונים טומוגרפיה

כדי לשמר את התהליכים עצביים לניתוח ultrastructural, אנו מתארים פרוטוקול לציפוי של נוירונים העיקרי ברשתות במיקרוסקופ אלקטרונים ואחרי הבזק הקפאה, מניב דגימות טהורים בשכבה של קרח זגוגי. ניתן לבחון דגימות אלה עם מיקרוסקופ אלקטרונים cryo-לדמיין מבנים בקנה המידה ננומטרי.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לגדל נוירונים ראשוניים של חולדות בצורה כזו שהנוירונים שלהם יתאימו להדמיה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים קריו. זה מושג על ידי הכנת כלים עם רשתות EM לציפוי נוירונים ראשוניים. השלב השני הוא להכין ולצלח את הנוירונים העיקריים ברשתות EM.

לאחר מכן, מתבצעת ויטריפיקציה של נוירונים ברשתות EM. השלב האחרון הוא איסוף תמונות על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים קריו, ולאחר מכן עיבוד לאחר והערות. בסופו של דבר, מיקרוסקופ אלקטרונים קריו וטומוגרפיה משמשים להצגת מבנה האולטרה של נויריטים במצב לחות קפוא.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא שניתן להשתמש בה להדמיה תלת מימדית של נויריטים מיובשים קפואים ברזולוציה ננומטרית ללא שימוש בקיבוע כימי. לכן, הקלה על הערכת המאפיינים המורפולוגיים הקרובים יותר למצב הילידי. התחל הליך זה על ידי בחינת שלמות הפחמן הקדוש ברשתות ה-EM של הזהב.

באמצעות מיקרוסקופ אור בהגדלה של פי 25 לפחות, ודא שחורי הפחמן גדולים מ-98% שלמים. לציפוי נוירונים ראשוניים השתמש במבער בונסן כדי לעקר את רשתות ה- EM ובמקביל להפוך אותן להידרופיליות. העבירו מיד את הרשת עם צד הפחמן כלפי מעלה למרכז הזכוכית.

צלחת תחתונה, הניחו רשת EM אחת לכל מנה והשתמשו רק בכלי תחתית זכוכית מעוקרים מראש. לאחר מכן השתמש במיקרוסקופ אור כדי לבדוק את תקינות הרשת תוך שמירה על רשת ה- EM בתוך צלחת תחתית הזכוכית במכסה מנוע לתרבית רקמות, מרחו 250 מיקרוליטר של חומר הציפוי המתאים על אזור הזכוכית המרכזי של צלחת הפטרי. לאט ובזהירות, ודא שחומר הציפוי המתאים מכסה את כל רשת ה-E EM.

לאחר מכן, מכסים את צלחת הפטרי במכסה שלה ומדגרים את הדגימות למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שאפו את כל תערובת הפוליאול ליזין מהכלים בעזרת קצה פיפטה סטרילי המחובר לצינור הוואקום במכסה המנוע. הימנע ממגע ישיר עם רשת E EM.

לאחר מכן, השתמש בפיפטה מתכווננת להזזת אוויר כדי למרוח בזהירות 250 מיקרוליטר של PBS סטרילי כדי לכסות באופן מלא את רשת ה-EM באזור הזכוכית המרכזי של כל צלחת פטרי. לאחר מכן שאפו את ה- PBS מכל מנה. חזור על ההליך שלוש פעמים לאחר מכן.

הניחו לכלים עם רשתות EM להתייבש בקולט האדים למשך 15 דקות. בדיקה מתחת למיקרוסקופ האור. ודא שהם יבשים לחלוטין ואין בועות לחות ברשת.

אחרת שאפו בזהירות ליד רשת ה-EM כדי לחסל את הלחות הנוספת הזו, יש להשתמש ברשת המצופה מיד לציפוי הנוירונים. בהליך זה, חשב את נפח התאים המתאים לכל מנה על מנת להשיג ריכוז של 50,000 תאים למיליליטר למנה. כמות המריחה המקסימלית צריכה להיות 250 מיקרוליטר כדי למלא רק את שטח הזכוכית המרכזי, ולא את כל המנה.

לאחר מכן, דגרו את הכלים במשך 30 דקות באינקובטור CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לתאים להתאושש ולהיצמד לאחר 30 דקות, הוסיפו לאט לאט 1.5 מיליליטר של המדיה התאית המחוממת לכל צלחת, והימנעו מלגעת ברשת האלקטרומגנטית עבור נוירונים בהיפוקמפוס. החליפו את המדיה למחרת ואז החליפו מחצית מהמדיה כל יומיים למשך 14 יום. בהליך זה, הכינו את הציוד ואת כל החומרים להקפאה ואחסון רשתות EM זהב בטמפרטורה קריוגנית, הכוללות מכשיר זיגוג עם תא לחות, נייר סינון נטול סידן, זוג פינצטה ארוכה ושטוחה, זוג פינצטה מיוחדת עדינה למכונת הזיגוג, עושה חנקן נוזלי, מיכל נוזל קירור, ותיבת האחסון של רשת EM.

לאחר מכן, הפעל את מכשיר הוויטריפיקציה. הגדר את הלחות ל 100% ואת הטמפרטורה ל 32 מעלות צלזיוס. בקטע האפשרויות, הגדר את זמן החסימה לאפס שניות.

זה מאפשר ספיגה ידנית דרך החלון הצדדי של תא הלחות. לאחר מכן ערמו שלושה ניירות סינון ללא סידן. חותכים את הערימה לרצועות ברוחב 0.5 סנטימטר שאורכן כשני סנטימטרים לאחר מכן, מכופפים אותם בזווית של 90 מעלות כך שחלק אחד של הנייר יהיה 0.5 סנטימטרים על 0.5 סנטימטרים.

חלק זה ישמש לספיגת הדגימה. הסר את הנייר האמצעי והנח אותו על נייר סינון אחר ללא סידן עד לשימוש. לאחר מכן, השתמש בוויטריפיקציה המיוחדת לפינצטה כדי לבחור בזהירות את רשת ה- EM מהצלחת.

שימו לב לצד של רשת ה-EM שעליו הנוירונים גדלים מכיוון שהמיקום יהיה חשוב לשלב הבא. לאחר מכן השתמש במנעול ההזזה השחור בפינצטה כדי לנעול היטב את הפינצטה על רשת ה-EM. כעת הכניסו את הפינצטה למכונת הזיגוג כך שהצד של רשת ה- EM שעליו מודבקים הנוירונים פונה שמאלה והרחק מחור הפתיחה העגול בצד מכונת הזיגוג.

לאחר מכן משוך את הפינצטה המחזיקה את רשת ה- EM לתוך מכונת הזיגוג. לאחר מכן, הנח את מיכל נוזל הקירור המלא ב-LN 2 מתאים ואתאן נוזלי במחזיק המתאים של מכונת הזיגוג באמצעות פקודת המסך המתאימה של מכונת הזיגוג. הרם את תא נוזל הקירור כלפי מעלה עד שהוא נשטף בתחתית תא הלחות בעזרת הפינצטה השטוחה.

אחוז בקצה אחד של נייר הסינון כך שהצד הקצר יותר יהיה בניצב לפינצטה. פנים אלה יבואו במגע ישיר עם רשת ה- EM לצורך ספיגה. כעת, הכנס בזהירות את נייר הסינון לחור הצדדי של תא הלחות ביציבות החזק את הנייר כנגד רשת ה- EM למשך 10 שניות, השלך את הנייר וצלול מיד.

הקפיאו את הדגימה באתאן הנוזלי באמצעות האוטומציה של מכונת הזיגוג. לאחר מכן, העבירו בזהירות את רשת ה-EM המיובשת הקפואה לאחד החריצים באחסון הרשת. זוהי תמונת מיקרוסקופ אור של האזור המרכזי של רשת EM בהגדלה של פי 10 שעליו גדלים נוירונים ראשוניים של חולדות במשך שבועיים.

הנה התצוגה המוגדלת של תיבת האקווה שבה נצפים הנוירונים והקרנות הנויריטים שלהם. זהו מיקרוגרף אלקטרונים של נויריט המקרין החוצה מגוף הנוירון בהגדלה של 4K. הקופסה הכחולה נראית מקרוב כאן, שם המאפיינים הפנימיים של הנויריטים נראים בבירור בהגדלה של 20 K.

סרטון זה מציג ערימה משוחזרת בתלת מימד של מיקרוגרפים של נויריט מהתרבית הראשונית של נוירונים בהיפוקמפוס של חולדות. הוא מצולם באמצעות טומוגרפיה ואחריו הערת הצבע התלת-ממדית המתאימה. הנה סרטון נוסף המציג ערימה משוחזרת תלת מימדית של תמונות של אקסון גנגליון שורש גבי של חולדה שנאסף באמצעות טומוגרפיה קריו-אלקטרונית ואחריה הערת הצבע התלת-ממדית המתאימה ומוצג כאן מונטאז' של ארבע תמונות cryo-EM דו-ממדיות של אקסון גנגליון שורש גבי נפרד של חולדה שצולמו בהגדלה של 20 K.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין נוירונים ראשוניים על רשתות מיקרוסקופ אלקטרונים בצורה כזו שמתאימה להמחשת הנוירונים שלהם במצב מיובש קפוא באמצעות טומוגרפיה קריו-אלקטרונית.