Name: הכנת ראשונית לנוירונים חזותי neurites במצב קפוא-התייבשות באמצעות Cryo-אלקטרונים טומוגרפיה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: למדו הכנת נוירונים ראשוניים מחולדות לצפייה במיקרוסקופ אלקטרונים קריו. השיטה כוללת ייבוש קפוא של נויטריטים לניתוח מבני ברזולוציה גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה כבר נתמך על ידי מענקי NIH (PN2EY016525 וP41GM103832). SHS נתמכה על ידי מענק מהתכנית ללימודי ההדרכה Nanobiology בינתחומי של מרכז קק WM להבינתחומי Bioscience הדרכה של חוף מפרץ קונסורציומים (NIH גרנט מס T32EB009379). SHS גזור, גדל ומזוגג DRG ותאים בהיפוקמפוס, שנאסף cryo-EM ונתונים cryo-ET של DRG ואקסונים בהיפוקמפוס; שוחזר וצבע-מבואר סדרת ההטיה. MRG גזור וסיפק תאים בהיפוקמפוס במעבדה של MNR. SC סייע בביאור סדרת הטיה. SHS הוכשר על ידי CW על כיצד לנתח ולגדול נוירונים. SHS, WCM והמקלחת הגו את הניסויים. SHS הכין את כתב היד עם קלט ממחברים אחרים. וידאו זה צולם במרכז לסלולרי הדמיה וNanoAnalytics (C-Cina) של Biozentrum של tהוא באזל האוניברסיטה. C-Cina משתלב במחלקה לBiosystems מדע וההנדסה (D-BSSE) של המכון הטכנולוגי של ציריך, הממוקם בבאזל, שוויץ.

1. הכנת מאכלים עם EM רשתות עבור נוירונים העיקרי ציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את התקינות של פחמן מחורר על רשתות EM הזהב באמצעות מיקרוסקופ אור בהגדלה של לפחות 25X. לעשות חורי פחמן בטוחים&gt; 98% בשלמותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לציפוי נוירונים עיקרי, השתמש במבער בונזן להבה לעקר רשתות EM ובמקביל להבהיר להם הידרופילי. להשתמש בפינצטה כדי להרים את רשת EM על ידי הקצה שלה, לא את אזור gridded המרכזי. זהירות: לעולם אל תשאיר את מבער בונזן מואר ללא השגחה, ולא להשתמש בכפפות או פינצטה עם רכיבי פלסטיק בעת ביצוע הפעולות הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שהדלקתי את המבער בונזן, הגדר את התאמות האוויר וגז למיקום מינימאלי פתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדליק את המבער בונזן באמצעות צור חלוץ או מצית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את התאמות האוויר וגז כדי להשיג אש קטנה, כחולה פנימית בתוך להבה גבוהה יותר, קלה יותר כחול / סגולה. קצה הלהבה הפנימית הוא החלק החם ביותר של הלהבה. הידית מתחתNeath צורב מתאים את כמות הגז שנכנס לצינור צורב, ואילו החבית של המבער ניתן להפעיל כדי להתאים את כמות האוויר שנכנס למבער. הפיכת כיוון השעון התאמת האוויר מקטינה את האוויר (וכתוצאה מלהבה סגולה) ונגד כיוון שעון מגביר את האוויר (וכתוצאה מלהבה צהובה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פינצטה מתכת (ללא חלקי פלסטיק) כדי להחזיק את רשת EM, להעביר אותו במהירות דרך הלהבה פעמיים, מול פחמן בצד למעלה. צד פחמן יופיע יותר מט (פחות מבריק) ועם יותר מגוון אפרפר יותר מהצד השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להעביר את הרשת (פחמן בצד למעלה) למרכז צלחת הזכוכית תחתונה ממוקמת בתוך 10 סנטימטר של המבער בונזן. השתמש ברשת EM אחד לכל צלחת (איור 1). להשתמש רק בזכוכית התחתונה מנות הpresterilized, כלומר באמצעות גמא הקרנה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במיקרוסקופ אור כדי לבדוק את תקינות הרשת (חורי פחמן ללא פגע) תוך שמירת רשת EM בתוך זכוכית בוטהמנה om (כדי למנוע זיהום). כאשר פונה לכל חומר על הרשת או כל דבר שבאות במגע עם תאי העצב, השתמש בהליך סטרילי וטיפים פיפטה סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במכסת מנוע בתרבית רקמה באמצעות הליך סטרילי, להחיל 250 μl של חומר הציפוי המתאים לאט ובזהירות לאזור הזכוכית המרכזי של צלחת פטרי. ודא שחומר הציפוי המתאים מכסה את כל רשת EM. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנוירונים בהיפוקמפוס, השתמש פולי-L-ליזין (PLL, 1 מ&quot;ג / מיליליטר) כחומר הציפוי, שהוכן כמתואר 19 בעבר. שים לב ש250 μl יש צורך לרשת EM, לכל צלחת, ולכן קנה מידה אצווה בהתאם. לגנגליון שורש הגבי נוירונים (DRG), להשתמש בתערובת חלבון דביקה המופרש על ידי Engelbreth-Holm-הנחיל (EHS) תאי סרקומה עכבר (ראה טבלה של חומרים וריאגנטים) כחומר ציפוי, להכין באופן הבא. שים לב ש250 μl יש צורך לרשת EM, לכל צלחת, ולכן קנה מידה אצווה בהתאם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר בקבוק המניהשל תערובת החלבונים הדביקה מופרש על ידי Engelbreth-Holm-נחיל תאי סרקומה עכבר (EHS) הלילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על קור תערובת חלבונים הדביקה מופרש על ידי Engelbreth-Holm-נחיל (EHS) תאי סרקומה עכבר, ואת כל הרכיבים המשמשים לייצור הפתרון, כלומר על ידי שמירה על אותם על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד על קרח, לדלל תערובת חלבונים הדביקה הזה במדיום Neurobasal להניב דילול 01:20 (כלומר לדלל 500 μl של תערובת החלבונים הדביקה ל10 מיליליטר של Neurobasal). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פער בדילול תערובת חלבונים דביק לתוך 1 מיליליטר aliquots, ולאחסן באופן מיידי כל aliquots נוספים ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 250 μl לרשת EM, לכל צלחת, כפי שתואר בסעיף 1.4. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את צלחת פטרי עם הראש שלה ודגירה (או עם PLL לדגימות בהיפוקמפוס, או עם תערובת החלבונים הדביקה לדגימות DRG) במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר במכסת המנוע בתרבית הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ASPIלדרג כל PLL (עבור דגימות בהיפוקמפוס) או תערובת הדביקה החלבון (לדגימות DRG) מהכלים. כדי לעשות זאת, השתמש במערכת הוואקום במכסת המנוע בתרבית הרקמה. השתמש בקצה פיפטה סטרילית המצורף לצינור הוואקום. להימנע ממגע ישיר עם רשת EM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה אוויר העקירה מתכווננת ליישם בזהירות 250 μl של PBS סטרילי (פוספט שנאגרו מלוח) לרשת EM באזור הזכוכית המרכזית של כל צלחת פטרי, כך שרשת EM מכוסה באופן מלא על ידי PBS. ואז, לשאוב את PBS מכל מנה. חזור 3x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר המנות עם רשתות EM לייבוש מתחת למכסת המנוע בתרבית הרקמה במשך 15 דקות. לוודא שהם יבשים לחלוטין על ידי בדיקה מתחת למיקרוסקופ האור בחדר בתרבית הרקמה. ודא שאין בועות של לחות ברשת. אם כן, בזהירות לשאוב הבא לרשת EM לחסל לחות נוספת זה. יש להשתמש ברשת המצופה באופן מיידי לציפוי תאי העצב. </li></ol> 2. הכנה וPlating ראשי נוירונים בEM רשתות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלחת נוירונים עיקרי, לנתח ראשון, trypsinize (באמצעות טריפסין 2.5%) וtriturate לנתק hippocampi (או גנגליון השורש הגבי של עוברי עכברים ישנים 18 יום) לתאים בודדים, כמתואר 19 בעבר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Triturate היא מונח נפוץ בשימוש על ידי neurobiologists לתאר גושים מתנערים של תאים לתוך תאים בודדים, בעיקר על ידי שימוש בפיפטה זכוכית עם קצה אש מלוטשת. התוצאה מושגת על ידי ציור בזהירות ובאיטיות ומשחרר את התאים, מעלה ומטה, מספר רב של פעמים (~ 30V) באמצעות פיפטה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את ההליכים כפי שתוארו לעיל לנתיחה DRG ותא בידוד 24, בשים לב לשימוש טריפסין 0.25% (בHBSS) כדי לבודד את הנוירונים DRG חולדה, ולא להשתמש באנזימים הציעו (פפאין, collagenase / dispase) שמתאימים יותר לעכבר נוירונים DRG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מספר תאי העצב הבודד (כלומר באמצעות hemocytometer)ולהשתמש בערך זה כדי לחשב את הנפח המתאים של תאים שיחולו על כל מנה כדי להשיג ריכוז של 50,000 תאים / מ&quot;ל ​​לכל צלחת. הנפח המרבי ליישם הוא 250 μl. שים לב שזה רק ממלא את האזור המרכזי הזכוכית, לא את כל המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הכלים ל30 דקות בCO 2 באינקובטור ב 37 ° C. לאפשר לתאים להתאושש ולדבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להוסיף 1.5 מיליליטר של תקשורת חיממה לכל מנה, נזהר שלא להפריע לרשת EM. הסוג של מדיה תלוי בסוג התא (בהיפוקמפוס או DRG). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדיה המתאימה לאף אחד מתאי עצב בהיפוקמפוס 19 או נוירונים גנגליון השורש הגבי 24, אשר שחמם באמבט מים 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. דגירה צלחות הלילה בחממת CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנוירונים בהיפוקמפוס, לשנות את התקשורת ביום שלמחרת. שינוי מחצית התקשורת בכל יומיים ואילך ל14 ימים. לחמם את התקשורת באמבט המים C ° 37 לפני השימוש. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנוירונים DRG, ביום שלמחרת לנתיחה / ציפוי, להכין מלאי חדש של תקשורת עם סוכן אנטי mitotic (uridine ו5&#39;-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine) להפוך את פתרון מניות 10 מ&quot;מ של כל אחד, בנפרד; להשתמש סופי ריכוז של 10 מיקרומטר לכל אחד. הסר מחצית תקשורת DRG (875 μl) ולהוסיף 875 μl של תקשורת טרי עם הסוכן אנטי mitotic. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנוירונים DRG, כל יומיים בשבוע הראשון, חלופי שינוי תקשורת בין כלי תקשורת אנטי mitotic ותקשורת DRG הסטנדרטי. בשבוע השני, לשנות את תקשורת DRG סטנדרטית בכל יומיים. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Vitrifying נוירונים בEM רשתות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הציוד ואת כל החומרים להקפאה ואחסון רשתות EM זהב בטמפרטורת קירור: מכשיר vitrification עם תא לחות 17, פינצטה מיוחדת עדין נקודה למכונת vitrification, פינצטה נקודה ארוכה שטוחה, דיואר (ים) של חנקן נוזלי (LN 2), גמיכל oolant, תיבת אחסון רשת EM, נייר סינון ללא סידן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מכשיר vitrification. הגדר את הלחות ל100% וטמפרטורה ל32 ° C. בסעיף &quot;המסוף&quot;, הגדר את זמן כתם לאפס שניות. זה מאפשר למדריך לסופג דרך צד החלון של תא הלחות של המכונה vitrification. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידית נייר סינון ללא סידן עם כפפות, שכבותיהם כך ששלושה עיתונים נערמים. חותכים את הערימה לרצועות רחבה 0.5 סנטימטר כי הם ~ עוד 2 סנטימטר. לכופף אותם בזווית של ° 90 כך שצד אחד של הנייר יש 0.5 סנטימטר x 0.5 פנים סנטימטר (איור 2). בעזרת פינצטה, להסיר את הנייר באמצע ומניח אותו על נייר סינון ללא סידן נוסף עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את כפתור אחסון רשת בבעל הכפתור בתוך תא התהליכים. למלא את התא הפנימי של מיכל נוזל הקירור עם חנקן נוזלי ולחכות עד אידוי מוחלט. למלא את התא החיצוני של המיכל נוזל קירור דואר עם חנקן נוזלי עד שהוא משיג טמפרטורה יציבה שלימשיך לשלב הבא. למלא את התא הפנימי עם אתאן גזי טוהר גבוה שיהיה לדחוס למצב נוזלי בתוך התא מקורר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הצלחת (es) מהחממה לצלחת קלקר 100 מ&quot;מ גדול להובלה לחדר vitrification, אם לא בסביבה הקרובה. השתמש בפינצטה vitrification מיוחדת כדי לבחור את רשת EM זהירות מהצלחת. שים לב באיזה צד נוירונים גדלים על רשת EM; העמדה משנה לשלב הבא. השתמש בנעילה הזזה השחורה בפינצטה כדי לנעול מאובטח פינצטה על רשת EM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את פינצטה לתוך מכונה vitrification צד שכזו של רשת EM שבנוירונים הם דבקו פרצופים לשמאל, הרחק מהחור בצד הפתיחה של המכונה vitrification. לחזור בי פינצטה מיוחדת למכונה vitrification. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את מיכל נוזל הקירור בבעל המתאיםשל המכונה vitrification. יש למלא אותו עם LN נאות 2 ואתאן הנוזלי. באמצעות פקודת המסך המתאימה של המכונה vitrification, להעלות את תא נוזל הקירור כלפי מעלה עד שהוא הסמיק עם החלק התחתון של תא הלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם פינצטה הנקודה שטוחה, לתפוס קצה אחד של נייר הסינון כך שהצד הקצר יותר (0.5 סנטימטר 0.5 x הפנים סנטימטר) הוא בניצב לפינצטה. פניה זו באה במגע ישיר עם רשת EM לסופג (איור 2). בזהירות להכניס את נייר הסינון לצד החור של תא הלחות של המכונה vitrification (איור 2 א). יציבות תצמיד את נייר רשת EM (הצד הפונה הרחק מהדגימה) ל10 שניות. מחק את הנייר אחר כך ומייד לצלול להקפיא את הדגימה באתאן הנוזלי באמצעות האוטומציה של המכונה vitrification. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר רשת EM-התייבשות הקפואה שלך בזהירות לאחד החריצים באחדכפתורי אחסון רשת. חזור על התהליך עבור רשתות EM נוספות במנות. כפתורי אחסון רשת EM משמשים בניסויים אלה יכולים לאחסן רשתות EM מרובות התייבשות קפוא. </li></ol> 4. אוסף תמונה, עיבוד, וביאור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך לאסוף micrographs אלקטרונים 2-D ו / או סדרה להטות 3-D של 5 neurites באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים cryo-בתנאי במינון נמוך. תמונות 2-D נועדו להעריך את האיכות של הרשת במונחים של עובי קרח והתחומים האפשריים להיות שימושי סדרה להטות 3-D ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה זה, את כל התמונות נאספו באמצעות מצלמת CCD 4k x 4k המצורפת למיקרוסקופ אלקטרונים 200 קילו וולט מצויד בבעל העברת cryo להטות חנקן הנוזלי יחיד, בהגדלה מיקרוסקופ 20k ביעד underfocus של 7 מיקרומטר ודגימה של 4.4 A / פיקסל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג tomogram 3D של המדגם, לנקוט בשורה של תמונות הקרנה תוך הטיית אל המדגם באופן הדרגתיאונג ציר מיקרוסקופ האלקטרונים הילוכים (TEM) אחד. בהתחשב בזוויות ההטיה והגדרות ניסיוניות אחרות, יש כמה תוכנות שונות זמינות כדי לאסוף את הסדרה להטות 5 באופן אוטומטי. הסדרה להטות 3-D מוצגת כאן נאספו באותו מיקרוסקופ באמצעות תוכנת רכישת סדרה להטות חצי אוטומטית-26 על פני טווח של -60 ° 60 ° ב 5 ° מרווחים עם מינון מצטבר של ~ 60 דואר / 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את סדרת ההטיה של neurites באמצעות תוכנת עיבוד תמונה 21 כפי שתוארה קודם לכן לדוגמאות אחרות 5,29. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צבע תסמן את תכונות 3-D של neurites ידי פילוח הראשון tomogram ויצירת מודל פני השטח באמצעות תוכנת עיבוד תמונה 3-D כפי שתואר בעבר 5. </li></ol>

<ol><li>Al-Amoudi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitreous+sections%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitreous sections.</a> EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).</li>
<li>Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease-like+dystrophic+neurites+characteristically+associated+with+senile+plaques+are+not+found+within+other+neurodegenerative+diseases+unless+amyloid+beta-protein+deposition+is+present%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present.</a> Brain Res. 606, 10-18 (1993).</li>
<li>Binks, B. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBinks%2C+BP+%22Modern+characterization+methods+of+surfactant+systems%22">Modern characterization methods of surfactant systems</a>. , Marcel Dekker. New York, New York, USA. (1999).</li>
<li>Briggman, K. L., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+neural+circuit+reconstruction+with+volume+electron+microscopy+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography+of+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography of bacterial cells.</a> J. Vis. Exp. (39), e1943(2010).</li>
<li>DiFiglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+huntingtin+in+neuronal+intranuclear+inclusions+and+dystrophic+neurites+in+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain.</a> Science. 277, 1990-1993 (1997).</li>
<li>Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+aqueous+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Frozen aqueous suspensions.</a> Ultramicroscopy. 10, 55-61 (1982).</li>
<li>Fernández-Busnadiego, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+molecular+organization+of+the+neuron+by+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc%22%5BJournal%5D)">Insights into the molecular organization of the neuron by cryo-electron tomography.</a> J. Electron Microsc. 60, 137-148 (2011).</li>
<li>Frey, T. G., Perkins, G. A., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+tomography+of+membrane-bound+cellular+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Electron tomography of membrane-bound cellular organelles.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 199-224 (2006).</li>
<li>Garvalov, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+particles+within+cellular+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Luminal particles within cellular microtubules.</a> J. Cell. Biol. 174, 759-765 (2006).</li>
<li>Grünewald, K., Cyrklaff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+complex+viruses+and+virus-infected+cells+by+electron+cryo+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Structure of complex viruses and virus-infected cells by electron cryo tomography.</a> Curr. Opin. Microbiol. 9, 437-442 (2006).</li>
<li>Gu, J., Bourne, P. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGu%2C+J+%22Structural+bioinformatics%22">Structural bioinformatics</a>. , Wiley-Blackwell. Hoboken, New Jersey, USA. (2009).</li>
<li>De Hoop, M. J., Meyn, L., Dotti, C. G. Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal rodent brain. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDe+Hoop%2C+MJ+%22Cell+Biology%3A+A+Laboratory+Handbook%22">Cell Biology: A Laboratory Handbook</a>. 1, W.H. Freeman. New York, New York, USA. (1998).</li>
<li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+Block-Face+Scanning+Electron+Microscopy+to+Reconstruct+Three-Dimensional+Tissue+Nanostructure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure.</a> PLoS Biol. 2, e329(2004).</li>
<li>Fink, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+regulation+of+neurite+extension+and+synapse+formation+by+the+beta+but+not+the+alpha+isoform+of+CaMKII%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII.</a> Neuron. 39, 283-297 (2003).</li>
<li>Jacob, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+matrix+granules%3A+their+behavior+during+changing+metabolic+situations+and+their+relationship+to+contact+sites+between+inner+and+outer+mitochondrial+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial matrix granules: their behavior during changing metabolic situations and their relationship to contact sites between inner and outer mitochondrial membranes.</a> Microsc. Res. Tech. 27, 307-318 (1994).</li>
<li>Jensen, G. J., Briegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+electron+cryotomography+is+opening+a+new+window+onto+prokaryotic+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).</li>
<li>Ibiricu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo+Electron+Tomography+of+Herpes+Simplex+Virus+during+Axonal+Transport+and+Secondary+Envelopment+in+Primary+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Cryo Electron Tomography of Herpes Simplex Virus during Axonal Transport and Secondary Envelopment in Primary Neurons.</a> PLoS Pathog. 7, e1002406(2011).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Koning, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo+electron+tomography+of+vitrified+fibroblasts%3A+microtubule+plus+ends+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryo electron tomography of vitrified fibroblasts: microtubule plus ends in situ.</a> J. Struct. Biol. 161, 459-468 (2008).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).</li>
<li>Lotharius, J., Brundin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+Parkinson%27s+disease%3A+dopamine%2C+vesicles+and+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of Parkinson's disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein.</a> Nat. Rev. Neurosci. 3, 932-942 (2002).</li>
<li>Lucić, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+imaging+of+neurons+grown+in+culture%3A+from+light+microscopy+to+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiscale imaging of neurons grown in culture: from light microscopy to cryo-electron tomography.</a> J. Struct. Biol. 160, 146(2007).</li>
<li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and.</a> 2, 152-160 (2007).</li>
<li>Marsh, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+tomographic+studies+of+the+mammalian+Golgi%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Lessons from tomographic studies of the mammalian Golgi.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1744, 273-292 (2005).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).</li>
<li>Medalia, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+actin+networks+in+intact+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Organization of actin networks in intact filopodia.</a> Curr. Biol. 17, 79-84 (2007).</li>
<li>Medalia, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+architecture+in+eukaryotic+cells+visualized+by+cryoelectron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography.</a> Science. 298, 1209-1213 (2002).</li>
<li>Meyerson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+molecular+structures+of+HIV+envelope+glycoproteins+using+cryo-electron+tomography+and+automated+sub-tomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging.</a> J. Vis. Exp. (58), e2770(2011).</li>
<li>Nakatomi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Hippocampal+Pyramidal+Neurons+after+Ischemic+Brain+Injury+by+Recruitment+of+Endogenous+Neural+Progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors.</a> Cell. 110, 429-441 (2002).</li>
<li>Peachey, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Microscopic+Observations+on+the+Accumulation+of+Divalent+Cations+in+Intramitochondrial+Granules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules.</a> J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).</li>
<li>Raza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+is+associated+with+elevated+intracellular+calcium+levels+and+altered+calcium+homeostatic+mechanisms+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons.</a> Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).</li>
<li>Scroggs, R. S., Fox, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+current+variation+between+acutely+isolated+adult+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+of+different+size%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size.</a> J. Physiol. 445, 639-658 (1992).</li>
<li>Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSquire%2C+LR+%22Fundamental+neuroscience%22">Fundamental neuroscience</a>. , Academic Press. Amsterdam; Boston. (2003).</li>
<li>Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+hit+hypotheses+for+dopamine+neuron+loss+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).</li>
<li>Tapia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+expression+of+glycine+and+GABA%28A%29+receptors+in+developing+spinal+cord+neurons.+Effects+on+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth.</a> Neuroscience. 108, 493-506 (2001).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

אנחנו מראים שנוירונים חולדה עובריים (גנגליון שורש הגבי והיפוקמפוס) ניתן לגדל במיקרוסקופ אלקטרונים זהב רשתות (EM) וקפוא בקרח זגוגי רזה מספיק neurites להיות צילמה באמצעות 2-D cryo-EM וcryo-3-D ET. בעוד neurites בהיפוקמפוס בעבר צילמה באמצעות cryo-ET 8,10,18,23, פרוטוקול מפורט מספיק לשכפול מוצלח באמצעות מכשירים זמינים מסחרי כבר חסרים. יתר על כן, בעוד שהמחקר שלהם הוא החלוצה השימוש של cryo-ET להמחשת neurites בהיפוקמפוס, המחקרים שלנו לחקור את הישימות של cryo-ET ליותר מסוג אחד ...

נוירונים להקים חיוני מעגלים המורכבים לתפקוד של מערכת העצבים המרכזית ואת הפריפריה על ידי לפרט דנדריטים לקבל מידע ואקסונים, לעתים קרובות די ארוך, כדי לתקשר עם הנוירונים במורד הזרם. התוצאה neurite ממלאת תפקיד מהותי במהלך התפתחות עוברית והתמיינות ותחזוקה של neurites עצביות תומכת באופן ביקורתי את התפקוד של מערכת העצבים. תהליכים מדלקת עצבים גם תכונה קריטית בפגיעה עצבית והתחדשות, כמו גם הפרעות במערכת עצבים. לימודי אדריכלות עצבית הוא חיוניים כדי להבין הן את המוח הבריא והחולה. למרבה המזל, מערכות תרבית תאים עצביות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית קיימות שיכול לשחזר מבנים תאיים מורכבים והטרוגנית. בהתבסס על הבהרה של פלטפורמות ניסיוניות מוצקות, אסטרטגיות יעילות להדמיה המאפשרות ניתוחים איכותיים וכמותית של מורפולוגיה עצבית יש צורך. שימושי במיוחד הייתלהיות מתודולוגיה מפורטת המספקת פלטפורמה אחידה המאפשרת הדמית neurites, שני אקסונים ודנדריטים בקנה המידה ננומטרי. במיקרוסקופ אלקטרונים מסורתי דורש שימוש בממס אורגני במהלך התייבשות והטבעת שרף, אשר יכולה לגרום לעיוותים בדגימות ממצבם האמיתי. עד כה, רוב האפיונים מבניים בקנה המידה ננומטרי מבוססים על תאים גדולים יותר או רקמות שנחשפים לכימיקלים קשים כגון - ובכך להגביל את הפרשנות של הממצאים 4,9,25. יתר על כן, לחדירת קרן אלקטרונים, חתך נדרש לאורגניזמים או בליטות סלולריות מציגים עובי גדול מ 1 מיקרומטר 12. לבסוף, מחולק או הסתובב תוצאות רקמות באוסף של ערכות נתונים פרוסה ספציפית בדידות, מה שהופך מסורבלת להגדרת התכונה המוארכת של neurites. אפילו לcryo-EM, שבו חתך דגימה קפוא התייבשות הוא אפשרי, השיטה מציגה artif דחיסהפועל 1. בשנים האחרונות, חוקרים למדו איך לגדל תאי עצב בהיפוקמפוס ישירות על רשתות EM ו באתאן הנוזלי כדי לחזות בהמשך neurites באמצעות cryo-ET 8,10,18,23 הקפאת הבזק. עם זאת, מחקרים כאלה או להשתמש בהתקן מותאם אישית 10,23, או פרטי חוסר בצעד הסופג ליצירת קרח זגוגי מספיק דק להדמיה שגרתית 8,18. לדוגמא, מחקר אחד ממליץ על השימוש של 30-40 שניות לסופגים רשת EM 10, עם זאת, ערך זה הוא מותאם לא לשימוש כללי, אלא הוא ספציפי לאותו מכשיר ההקפאה לצלול בהזמנה אישית. שימוש במכשיר בהזמנה אישית ולא אחד 17 זמינים מסחרי לשמירה על לחות לפני מדגם ההקפאה לצלול יכול להוות מכשול לשחזור נרחב. בעוד שמחקרים אלה היו פורץ באופן חזותי neurites ידי cryo-ET, נקטנו צעד נוסף כדי לחקור את applicability של cryo-ET למגוון רחב של דגימות עצביות (נוירונים בהיפוקמפוס וגנגליון השורש הגבי). בנוסף, אנו דנים בשתי תוצאות אופטימליות והכי מוצלחות, כמו גם חפצים הפוטנציאליים שאפשר להיתקל באמצעות cryo-ET לדגימות מסוג זה. הגדרת טכניקה מפורטת לשימור באופן חזותי כל neurites בקנה המידה ננומטרי במצב כמעט טבעי היה לשפר את היכולת ליותר חוקרים לבצע מחקרי ultrastructural. לשם כך, אנו מתארים פרוטוקול יעיל ומפורט תוך שימוש בציוד זמין מסחרי כדי להכין נוירונים מבולבל, בלא כתם לדמיין neurites. זהו צעד ראשון חשוב לקראת המפרט את ultrastructure של neurites בריאה וכדי להניח את היסודות להבנה מה הבדלים מבניים קיימים בדגמי מחלה של מערכת עצבים. מאז cryo-ET יכול לפתור את תכונות neurite מבולבל, בלא כתם ב 3-D בקנה המידה ננומטרי, השיטה תגרום אפשרי כפי שמעולם לא יהיה זהביטוי להגדרת ארכיטקטורה מדלקת עצבים 12.

<table><tbody><tr><td>Dumont #7 פינצטה</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>72803-01</td><td>לטיפול ברשתות EM</td></tr><tr><td>כלי תחתית מזכוכית</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-10C</td><td>לגידול</td></tr><tr><td>מדגם רשתות מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>Quantifoil</td><td>Holey Carbon, Au 200, R 2/2</td><td>לגידול</td></tr><tr><td>מדגם נייר סינון נטול סידן</td><td>Whatman</td><td>1541-055</td><td>לדוגמא ספיגה</td></tr><tr><td>פינצטה ארוכה גדולה עם נקודה שטוחה</td><td>Excelta Corporation</td><td>E003-000590, 25-SA</td><td>לדוגמא ספיגה&nbsp;</td></tr><tr><td>מכשיר ויטריפיקציה ופינצטה</td><td>FEI</td><td>Vitrobot Mark III</td><td>להקפאת מדגם</td></tr><tr><td>קופסאות אחסון Minigrid</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>160-40</td><td>לאחסון רשתות EM</td></tr><tr><td>מחזיק העברת קריו</td><td>Gatan</td><td>626 מחזיק העברת קריו חנקן נוזלי הטיה אחת</td><td>לדוגמאות הדמיה</td></tr><tr><td>תוכנת רכישה סדרת הטיה למחצה</td><td>אוטומטית SerialEM</td><td>http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td> <td>לדוגמאות הדמיה</td></tr><tr><td>תוכנה לעיבוד תמונה</td><td>IMOD eTomo</td><td>http://bio3d.colorado.edu/imod/</td> <td>לעיבוד תמונה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אלקטרונים שידור ל-cryoEM</td><td>JEOL, טוקיו</td><td>200-kV JEM2100 LaB6 מיקרוסקופ אלקטרונים</td><td>להדמיה</td></tr><tr><td>4k x 4k CCD מצלמה</td><td>Gatan</td><td>N/A</td><td>להדמיה</td></tr><tr><td>תוכנת הערות תלת מימד</td><td>Visage Imaging GmbH</td><td>Amira/Avizo</td><td>לעיבוד נתונים תלת מימדיים</td></tr><tr><td>תוכנה לתפירה דיגיטלית של תמונות דו-ממדיות</td><td>Adobe</td><td>Adobe Photoshop</td><td>לעיבוד נתונים דו-ממדיים</td></tr><tr><td>DMEM, גלוקוז גבוה</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td>לתרבית היפוקמפוס</td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>B-0252</td><td>לתרבית היפוקמפוס</td></tr><tr><td>נתרן טטרבוראט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>B-9876</td><td>לתרבית היפוקמפוס</td></tr><tr><td>פולי-L-ליזין&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P2636-500MG</td><td>לתרבית היפוקמפוס</td></tr><tr><td>מערכת סינון</td><td>קורנינג</td><td>430758</td><td>לתרבית ההיפוקמפוס</td></tr><tr><td>מדיום נוירובזאלי</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td>לתרבית DRG</td></tr><tr><td>תוסף B-27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>לתרבית DRG</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>לתרבית DRG</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>לתרבית DRG</td></tr><tr><td>חולדה רקומביננטית b-NGF</td><td>R& D Systems</td><td>556-NG</td><td>לתרבית DRG</td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma</td><td>U3003-5G</td><td>לתרבית DRG</td></tr><tr><td>5'-Fluoro-2'-deoxyuridine</td><td>Sigma</td><td>F0503-100MG</td><td>לתרבית DRG</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td>לתרבית DRG</td></tr></tbody></table>

הכנת ראשונית לנוירונים חזותי neurites במצב קפוא-התייבשות באמצעות cryo-אלקטרונים טומוגרפיה

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Neurites, גם דנדריטים ואקסונים, הם תהליכים תאיים עצביים המאפשרים ההולכה של דחפים חשמליים בין תאי עצב. הגדרת המבנה של neurites היא קריטית להבנה כיצד תהליכים אלה להעביר חומרים ואותות שתומכים בתקשורת הסינפטי. במיקרוסקופ אלקטרונים (EM) כבר משמש באופן מסורתי כדי להעריך את תכונות ultrastructural בתוך neurites, עם זאת, החשיפה לממס אורגני במהלך התייבשות והטבעת שרף יכולה לעוות מבנים. מטרה שלא סופקו חשובה היא גיבוש נהלים המאפשרים להערכות מבניות אינם מושפעות מממצאים כאלה. הנה, הקמנו פרוטוקול מפורט ולשעתק לגידול וneurites כל הקפאה-הבזק של נוירונים עיקרי שונה ברשתות במיקרוסקופ אלקטרונים ואחרי הבדיקה שלהם עם טומוגרפיה האלקטרונים cryo-(cryo-ET). טכניקה זו מאפשרת להדמיה 3-D של neurites הקפואה, התייבשות ברזולוציה ננומטר, בהנחיית assessment של ההבדלים מורפולוגיים שלהם. הפרוטוקול שלנו מניב תצוגה חסרת תקדים של הגנגליון הגבי שורש neurites (DRG), ויזואליזציה של neurites בהיפוקמפוס במדינה הקרובה למולדתם. ככזה, שיטות אלה ליצור בסיס למחקרים עתידיים בneurites של שני נוירונים נורמלים ואלה מושפעים מהפרעות נוירולוגיות.

לפני הקפאה והדמיה באמצעות cryo-ET, יש לנקוט בתמונות מיקרוסקופ אור של רשת EM שבו נוירונים גדלים. Neurites צריכה להיות לעין בלי חפיפה משמעותית אחד עם השני. קופסא צבעונית באיור 3A מייצגת אזור זה זנק ב להראות בהגדלה גבוהה יותר באיור 3 ב, שבי neurites משתרעת על פני סריג של הרשת. כל רשת מרובע מורכב מסרט פחמן מחורר התומך בתאי העצב וneurites. חורים אלה הם לכאורה בתמונת cryo-EM במינון נמוך שנלקחה ב4k הגדלה, אשר מציגה את גוף תא העצב כאובייקט גדול יחסית, כהה...

כדי לשמר את התהליכים עצביים לניתוח ultrastructural, אנו מתארים פרוטוקול לציפוי של נוירונים העיקרי ברשתות במיקרוסקופ אלקטרונים ואחרי הבזק הקפאה, מניב דגימות טהורים בשכבה של קרח זגוגי. ניתן לבחון דגימות אלה עם מיקרוסקופ אלקטרונים cryo-לדמיין מבנים בקנה המידה ננומטרי.

הכנת ראשונית לנוירונים חזותי neurites במצב קפוא-התייבשות באמצעות Cryo-אלקטרונים טומוגרפיה

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לגדל נוירונים ראשוניים של חולדה באופן שיהיה מתאים לוויזואליזציה באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית קריוגנית (cryo-electron microscopy). הדבר מושג תחילה על ידי הכנת צלחות עם רשתות EM להזרעת הנוירונים הראשוניים. השלב השני הוא הכנה והזרעה של הנוירונים הראשוניים על רשתות ה-EM.בשלב הבא, מבוצע ויטריפיקציה של נוירונים על גריד EM. השלב הסופי הוא איסוף תמונות באמצעות מיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים, ולאחריה עיבוד נתונים ואנוטציה. בסופו של דבר, נעשה שימוש במיקרוסקופיה וטומוגרפיה של קריו-אלקטרונים כדי להציג את המבנה העל של נוריטים במצב של הידרטציה קפואה.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שניתן להשתמש בה להדמיה תלת-ממדית של נוריטים הידרטfrozen ברזולוציה ננומטרית ללא שימוש במקבעים כימיים. በዚህ אופן, היא מאפשרת הערכה של מאפיינים מורפולוגיים הקרובים יותר למצב הטבעי. התחל את הפרוצדורה בבדיקת השלמות של ה-holy carbon על רשתות ה-EM מזהב.בעזרת מיקרוסקופ אור בהגדלה של לפחות 25 פעמים, ודאו שהחורים בפחמן שלמים בשיעור של לפחות 98%. להעברת נוירונים ראשוניים, השתמשו במבער בונסן כדי לעקר בלהבה את רשמי ה-EM ובמקביל להפוך אותם להידרופיליים. העבירו מיד את הרשמי, כאשר צד הפחמן פונה למעלה, למרכז הזכוכית.בצלחת תחתונה, הניחו רשת EM אחת לכל צלחת והשתמשו אך ורק בצלחות עם תחתית זכוכית שעברו עיקור מראש. לאחר מכן, השתמשו במיקרוסקופ אור כדי לבדוק את שלמות הרשת בעוד רשת ה-EM נשארת בתוך הצלחת בעלת תחתית הזכוכית בתוך מנדף לתרבית רקמות, והחילו 250 µl של חומר הציפוי המתאים לאזור הזכוכית המרכזי של צלחת הפטרי. לאט ובזהירות, ודאו שחומר הציפוי המתאים מכסה את כל רשת ה-EM.לאחר מכן, כסו את צלחת הפטרי במכסה שלה והדגירו את הדגימות למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. בשלב הבא, שאבו את כל תערובת ה-polyol lysine מהצלחות באמצעות טיפ פטה סטרילי המחובר לצינור הוואקום במנדף. הימנעו ממגע ישיר עם רשת ה-E EM.לאחר מכן, השתמש בפיפטה בעלת ת VON-air displacement מתכווננת כדי להניח בזהירות 250 µL של PBS סטרילי לכיסוי מלא של רשת ה-EM באזור הזכוכית המרכזי של כל צלחת פטרי. לאחר מכן, שאב את ה-PBS מכל צלחת. חזור על הפעולה שלוש פעמים נוספות.הניחו לצלחות עם רשמי ה-EM להתייבש במכסה של תא תרבית למשך 15 דקות. בדקו תחת מיקרוסקופ אור. ודאו שהם יבשים לחלוטין ושאין בועות לחות ברשת.לחלופין, יש לשאוב בזהירות לצד רשת ה-EM כדי להסיר את הלחות העודפת; יש להשתמש ברשת המצופה באופן מיידי לזריעת הנוירונים. בהליך זה, חשב את נפח התאים המתאים לכל צלחת על מנת להגיע לריכוז של 50,000 תאים למיליליטר לצלחת. הכמות המקסימלית להחלה צריכה להיות 250 microliters, כך שיתמלא רק אזור הזכוכית המרכזי ולא הצלחת כולה.בשלב הבא, דגרו את הצלחות למשך 30 דקות באינקובטור CO2 בטמפרטורה של 37 °C כדי לאפשר לתאים להתאושש ולהיצמד; לאחר 30 דקות, הוסיפו באיטיות 1.5 milliliters של מצע גידול תאים מחומם לכל צלחת, והימנעו ממגע עם רשת ה-EM עבור נוירונים של ההיפוקמפוס. החליפו את מצע הגידול למחרת, ולאחר מכן החליפו חצי מכמות המצע בכל יומיים למשך 14 ימים. בהליך זה, הכינו את הציוד ואת כל החומרים להקפאה ואחסון של רשתי EM מזהב בטמפרטורה קריוגנית, הכוללים מכשיר ויטריפיקציה עם תא לחות, נייר סינון נטול סידן, זוג פינצטות בעלות קצה שטוח וארוך, זוג פינצטות ייעודיות בעלות קצה דק עבור מכונת הויטריפיקציה, מכל חנקן נוזלי, מיכל קירור וקופסת אחסון לרשמי EM.כעת הפעילו את מכשיר הוויטריפיקציה. הגדירו את הלחות ל-100% ואת הטמפרטורה ל-32 degrees celsius. בחלק של האפשרויות, הגדירו את זמן החסימה (block time) לאפס שניות.פעולה זו מאפשרת ספיגה ידנית דרך החלון הצדדי של תא הלחות. לאחר מכן, ערמו שלושה דפי סינון נטולי סידן. חתכו את הערימה לרצועות ברוחב 0.5 centimeter ובאורך של כ-שני סנטימטרים; לאחר מכן, כופפו אותן בזווית של 90 מעלות כך שחלק אחד מהנייר יהיה בגודל 0.5 centimeters על 0.5 centimeters.חלק זה ישמש לייבוש הדגימה. הסירו את הנייר האמצעי והניחו אותו על נייר סינון אחר נטול סידן עד לשימוש. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה המיועדת לוויטריפיקציה כדי להרים בזהירות את רשת ה-EM מהצלחת.שימו לב לצד של רשת ה-EM שבו גדלים הנוירונים, שכן המיקום יהיה משמעותי לשלב הבא. לאחר מכן, השתמשו בנעילה השחורה המגלישה שעל הפינצטה כדי לנעול אותה בבטחה על רשת ה-EM. כעת הכניסו את הפינצטה למכשיר הוויטריפיקציה כך שהצד של רשת ה-EM שבו דבקו הנוירונים פונה שמאלה והרחק מחור הפתח המעגלי שבדופן מכשיר הוויטריפיקציה.לאחר מכן, החזיר את הפינצטה המחזיקה את רשת ה-EM אל תוך מכונת הוויטריפיקציה. לאחר מכן, הנח את מיכל הקירור המלא ב-LN2 ובאתאן נוזלי בכמות מספקת במחזיק המתאים של מכונת הוויטריפיקציה, באמצעות פקודת המסך המתאימה של המכונה. הרם את תא הקירור כלפי מעלה בעזרת פינצטה בעלת קצה שטוח, עד שיהיה הוא בקו אחד עם תחתית תא הלחות.אחזו בקצה אחד של נייר הסינון כך שהצד הקצר יהיה מאונך לפינצטה. פני זה יבואו במגע ישיר עם סריג ה-EM לצורך הספיגה (blotting). כעת, הכניסו בזהירות ובביטחון את נייר הסינון לחור הצדדי של תא הלחות. החזיקו את הנייר כנגד סריג ה-EM למשך 10 שניות, השליכו את הנייר ובצעו מיד את השקיעה (plunge).הקפיאו את הדגימה באתאן נוזלי באמצעות האוטומציה של מכונת הוויטריפיקציה. לאחר מכן, העבירו בזהירות את רשת ה-EM ההידרטטית הקפואה לאחד החריצים באחסון הרשתות. זוהי תמונת מיקרוסקופ אור המראה את האזור המרכזי של רשת EM בהגדלה של 10 פעמים, עליה גדלו נוירונים ראשוניים של חולדה במשך שבועיים.להלן מבט מוגדל על התיבה התכלת שבה נצפים הנוירונים והבליטות העצביות (neurite projections) שלהם. זוהי מיקרוגרפיה אלקטרונית של בליטה עצבית הבולטת החוצה מגוף הנוירון בהגדלה של 4K. התיבה הכחולה מוצגת כאן בתקריב, כאשר המאפיינים הפנימיים של הבליטות העצביות נראים בבירור בהגדלה של 20K.סרטון זה מציג ערימה משוחזרת בתלת-ממד של מיקרוגרפים של נוריט מתרבית ראשונית של נוירונים מההיפוקמפוס של חולדה. הוא photographed באמצעות טומוגרפיה, ולאחריה מופיע סימון צבעי תלת-ממדי תואם. כאן מוצג סרטון נוסף המראה ערימה משוחזרת בתלת-ממד של תמונות של אקסון מנוירון של גנגליון שורש אחורי של חולדה שנאספו באמצעות קריו-אלקטרון טומוגרפיה, ולאחריהם סימון צבעי תלת-ממדי תואם; כאן מוצגת מונטאז' של ארבע תמונות קריו-EM דו-ממדיות של אקסון נפרד מגנגליון שורש אחורי של חולדה, שצולמו בהגדלה של 20 K.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הכנת נוירונים ראשוניים על רשתות למיקרוסקופיה אלקטרונית באופן המתאים להדמיית הנוירונים במצב הידרטציה קפוא באמצעות טומוגרפיה אלקטרונית קריוגנית (cryo-electron tomography).

preparation-primary-neurons-for-visualizing-neurites-frozen-hydrated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מקור: Schönherr, S., et. al. תיוג אימונולוגי משולב של העתק אופטוגנטי ושבר הקפאה כדי לבחון סידור ספציפי לקלט של קולטני גלוטמט באמיגדלה של העכבר. J. Vis. exp. (2016)סרטון זה מדגים את התיוג החיסוני של העתקים שבורים בהקפאה של רקמת מוח עכבר למיקרוסקופ אלקטרונים. ההעתקים השבורים והמצופים מתעכלים כדי לחשוף קולטנים. נוגדנים משניים ראשוניים ובעלי תווית זהב מתווספים כדי לסמן קולטנים ספציפיים של ממברנה עצבית. ההעתק מותקן על רשת ומוצג תחת מיקרוסקופ אלקטרונים.

תיוג חיסוני של חלבוני ממברנה עצבית בדגימה שסועה בהקפאה של רקמת מוח של עכבר

אנו מציגים פרוטוקול בשיטת מכתים גולגי-קוקס בסעיפי מוח עבים, כדי להמחיש נוירונים עם עצי דנדריטים ארוכים בתוך דגימות רקמה אחת. שתי גרסאות של פרוטוקול זה גם מוצגים שכוללות counterstaining סגול cresyl, והקפאת המוח מעובד עבור אחסון לטווח ארוך.

נוירונים הדמיה בתוך חלקים במוח עבים שימוש בשיטת גולגי-קוקס

כאן, אנו מספקים קלה, בעלות נמוכה, וזמן חסכוני פרוטוקול לתקן כימי רקמת מוח הפרימטים עם מקבע אקרולאין, המאפשר שימור לטווח ארוך התואמת טרום הטבעה אימונוהיסטוכימיה עבור במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים.

הכנה של רקמת מוח הפרימאטים לא-אנושית עבור טרום הטבעת אימונוהיסטוכימיה ו מיקרוסקופי אלקטרונים

בהתבסס על הנדסת חוץ גופית ויראלי של מראש עצבי, שיתוף ההשתלה שלהם למוח פראי סוג ולזווג הערכה מורמטרית של "מבחן" ו "שליטה" נגזרים, שיטה זו מאפשרת דוגמנות מדויקת של בקרת vivo gene של הנאוקורטילית עצב מורפולוגיה בדרך פשוטה ובמחיר סביר.

השתלת השתלות מהונדסים של הנדסה עצבית בVivo לימודי נוירוארכיטקטורה

כאן, מוצג פרוטוקול המתאר את שלבי הכנת הדגימה ואיסוף הנתונים הנדרשים בטומוגרפיה של קרני רנטגן רכות של cryo (SXT) כדי לדמות את מבנה האולטרה-מבנה של תאים שלמים שהשתמרו בקריו ברזולוציה של 25 ננומטר חצי גובה.

תיאור קרטוגרפי תלת-ממדי של התא על ידי טומוגרפיה של קרני רנטגן רכות של Cryo

שימוש בכרסום קרן יונים ממוקדת כדי לייצר זגוגית על הרשת מדגימות ביולוגיות קפואות עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונית.

הכנת Lamellae מדגימות ביולוגיות זגוגית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קרן כפולה עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונים

אנו מציגים פרוטוקול להכנת lamella של דגימות ביולוגיות קפואות לצלול על ידי מיקרו-מכונות קרן יונים ממוקדות קריו למחקרים מבניים ברזולוציה גבוהה של מקרומולקולולים במקום עם טומוגרפיה קריו-אלקטרונית. הפרוטוקול המוצג מספק קווים מנחים להכנת lamellae באיכות גבוהה עם רבייה גבוהה לאפיון מבני של macromolecules בתוך cerevisiae Saccharomyces.

הכנה ומיקרו-מכונות קריו-FIB של סרביסיה Saccharomyces עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרון

מטרת פרוטוקול זה היא לכוון הידבקות תאים וצמיחה לאזורים ממוקדים של רשתות למיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית. זה מושג על ידי החלת שכבה נגד עכירות כי הוא ablated בדפוסים שצוינו על ידי המשתמש ואחריו תצהיר של חלבוני מטריצה חוץ תאית באזורים בדוגמת לפני זריעת התא.

רשתות מיקרוסקופיות אלקטרוניות של שידור מיקרו-מפזרנינג למיקום תאים ישירים בתהליכי עבודה של טומוגרפיה קריו-אלקטרונים של תאים שלמים

טומוגרפיה Cryo-STEM מספקת אמצעי לדמיין אברונים של תאים שלמים ללא הטבעה, חתך או תכשירים פולשניים אחרים. הרזולוציה התלת-ממדית המתקבלת נמצאת כיום בטווח של ננומטרים בודדים, עם שדה ראייה של מספר מיקרומטרים ועובי נגיש בסדר גודל של 1 מיקרומטר.

הדמיה של אברונים באתרם על ידי טומוגרפיה Cryo-STEM

פרוטוקול וידאו זה ממחיש כיצד לבצע טומוגרפיה של מיקרוסקופ אלקטרונים של שידור סריקה של דגימות וירולוגיה. לקבלת תוצאות מיטביות, הדגימות מוכנות על ידי הקפאה בלחץ גבוה והחלפת הקפאה לאחר מכן.

סריקת טומוגרפיה של מיקרוסקופ אלקטרונים שידור בווירולוגיה: הדמיה תלת מימדית של דגימות קפואות בלחץ גבוה, שהוחלפו בהקפאה

פרוטוקול זה מתקן את טומוגרפיית הקריו-אלקטרון (קריו-ET) לרקמות עבות על ידי שילוב הקפאה בלחץ גבוה (HPF) עם שיטת הוופל, הרמת קרן יוני מוקד קריוגנית (crio-FIB), ורכישה מקבילה סימטרית במינון, מה שמניב למלות דקות ודגימות מזגוגות לניתוח שכפול בשטח בהיפוקמפוס העכבר.

תהליך עבודה של טומוגרפיית קריו-אלקטרון לרקמות עבות שהודגם בהיפוקמפוס של עכבר

למדו הכנת נוירונים ראשוניים מחולדות לצפייה במיקרוסקופ אלקטרונים קריו. השיטה כוללת ייבוש קפוא של נויטריטים לניתוח מבני ברזולוציה גבוהה.

הכנת ראשונית לנוירונים חזותי neurites במצב קפוא-התייבשות באמצעות Cryo-אלקטרונים טומוגרפיה

גלה סרטונים נוספים