Name: Culturing ושמירה Difficile Clostridium בסביבת אנאירובית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-14T21:25:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: למדו לבודד ולגדל Clostridium difficile בסביבה אנאירובית לצורך הכנת מלאי גליצרול ומניות נבגים לטווח ארוך. השיטות הללו חיוניות למחקר על עמידות לאנטיביוטיקה ופתוגניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

ברצוננו להודות למתחנחן מעבדות באדיבות מתן תמונות של חדר אנאירובי. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק DK087763 (SMM) ותכנית לימודים STEP / HHMI פיתוח מלגה (Ane).

<ol><li>Hall, I. C., O'Toole, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+flora+in+new-borin+infants+-+With+a+description+of+a+new+pathogenic+anaerobe%2C+Bacillus+difficilis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Dis.+Child%22%5BJournal%5D)">Intestinal flora in new-borin infants - With a description of a new pathogenic anaerobe, Bacillus difficilis.</a> Am. J. Dis. Child. 49, 390-402 (1935).</li>
<li>Tedesco, F. J., Barton, R. W., Alpers, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clindamycin-Associated+Colitis+-+Prospective+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Intern.+Med%22%5BJournal%5D)">Clindamycin-Associated Colitis - Prospective Study.</a> Ann. Intern. Med. 81, 429-433 (1974).</li>
<li>Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+30+years+on%3A+what+has%2C+or+has+not%2C+changed+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Antimicrob.+Agents%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile 30 years on: what has, or has not, changed and why.</a> Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 2-8 (2009).</li>
<li>Gerding, D. N., Muto, C. A., Owens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+Clostridium+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Treatment of Clostridium difficile infection.</a> Clin. Infect. Dis. 46, Suppl 1. 32-42 (2008).</li>
<li>Dubberke, E. R., Olsen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+Clostridium+difficile+on+the+healthcare+system%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Burden of Clostridium difficile on the healthcare system.</a> Clin. Infect. Dis. 55, 88-92 (2012).</li>
<li>Bouza, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+Clostridium+difficile+infection%3A+understanding+the+healthcare+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Infect%22%5BJournal%5D)">Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden.</a> Clin. Microbiol. Infect. 18, 5-12 (2012).</li>
<li>Peery, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+gastrointestinal+disease+in+the+United+States%3A+2012+update%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update.</a> Gastroenterology. 143, 1171-1173 (2012).</li>
<li>Deakin, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Clostridium+difficile+spo0A+gene+is+a+persistence+and+transmission+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">The Clostridium difficile spo0A gene is a persistence and transmission factor.</a> Infect. Immun. 80, 2704-2711 (2012).</li>
<li>Drasar, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+anaerobic+intestinal+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Cultivation of anaerobic intestinal bacteria.</a> J. Pathol. Bacteriol. 94, 417-427 (1967).</li>
<li>Leach, P. A., Bullen, J. J., Grant, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaerobic+CO+2+cabinet+for+the+cultivation+of+strict+anerobes%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Anaerobic CO 2 cabinet for the cultivation of strict anerobes.</a> Appl. Microbiol. 22, 824-827 (1971).</li>
<li>Killgore, G. E., Starr, S. E., Del Bene,, Whaley, V. E., N, D., Dowell, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+anaerobic+systems+for+the+isolation+of+anaerobic+bacteria+from+clinical+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Comparison of three anaerobic systems for the isolation of anaerobic bacteria from clinical specimens.</a> Am. J. Clin. Pathol. 59, 552-559 (1973).</li>
<li>Bacic, M. K., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+maintenance+and+cultivation+of+bacteroides+species%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Laboratory maintenance and cultivation of bacteroides species.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 13, Unit 13C 11(2008).</li>
<li>Doan, N., Contreras, A., Flynn, J., Morrison, J., Slots, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proficiencies+of+three+anaerobic+culture+systems+for+recovering+periodontal+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Proficiencies of three anaerobic culture systems for recovering periodontal pathogenic bacteria.</a> J. Clin. Microbiol. 37, 171-174 (1999).</li>
<li>Socransky, S., Macdonald, J. B., Sawyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cultivation+of+Treponema+microdentium+as+surface+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Oral.+Biol%22%5BJournal%5D)">The cultivation of Treponema microdentium as surface colonies.</a> Arch. Oral. Biol. 1, 171-172 (1959).</li>
<li>George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+differential+medium+for+isolation+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile.</a> J. Clin. Microbiol. 9, 214-219 (1979).</li>
<li>Wilson, K. H., Silva, J., Fekety, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Clostridium+difficile+by+normal+hamster+cecal+flora+and+prevention+of+antibiotic-associated+cecitis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Suppression of Clostridium difficile by normal hamster cecal flora and prevention of antibiotic-associated cecitis.</a> Infect. Immun. 34, 626-628 (1981).</li>
<li>Wilson, K. H., Kennedy, M. J., Fekety, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+sodium+taurocholate+to+enhance+spore+recovery+on+a+medium+selective+for+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of sodium taurocholate to enhance spore recovery on a medium selective for Clostridium difficile.</a> J. Clin. Microbiol. 15, 443-446 (1982).</li>
<li>Bliss, D. Z., Johnson, S., Clabots, C. R., Savik, K., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cycloserine-cefoxitin-fructose+agar+%28CCFA%29+and+taurocholate-CCFA+for+recovery+of+Clostridium+difficile+during+surveillance+of+hospitalized+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison of cycloserine-cefoxitin-fructose agar (CCFA) and taurocholate-CCFA for recovery of Clostridium difficile during surveillance of hospitalized patients.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 29, 1-4 (1997).</li>
<li>Marler, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+five+cultural+procedures+for+isolation+of+Clostridium+difficile+from+stools%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of five cultural procedures for isolation of Clostridium difficile from stools.</a> J. Clin. Microbiol. 30, 514-516 (1992).</li>
<li>Sorg, J. A., Dineen, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+maintenance+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Laboratory maintenance of Clostridium difficile.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 1(2009).</li>
<li>Bouillaut, L., McBride, S. M., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of Clostridium difficile.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 2(2011).</li>
<li>Lemee, L., Pons, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilocus+sequence+typing+for+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Multilocus sequence typing for Clostridium difficile.</a> Methods. Mol. Biol. 646, 77-90 (2010).</li>
<li>Shanholtzer, C. J., Peterson, L. R., Olson, M. N., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+study+of+gram-stained+stool+smears+in+diagnosis+of+Clostridium+difficile+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Prospective study of gram-stained stool smears in diagnosis of Clostridium difficile colitis.</a> J. Clin. Microbiol. 17, 906-908 (1983).</li>
<li>Smith, C. J., Markowitz, S. M., Macrina, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferable+tetracycline+resistance+in+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Transferable tetracycline resistance in Clostridium difficile.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 19, 997-1003 (1981).</li>
<li>Permpoonpattana, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+layers+of+Clostridium+difficile+endospores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Surface layers of Clostridium difficile endospores.</a> J. Bacteriol. 193, 6461-6470 (2011).</li>
<li>Putnam, E. E., Nock, A. M., Lawley, T. D., Shen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpoIVA+and+SipL+are+Clostridium+difficile+spore+morphogenetic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">SpoIVA and SipL are Clostridium difficile spore morphogenetic proteins.</a> J. Bacteriol. , (2013).</li>
<li>Burns, D. A., Minton, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+studies+in+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sporulation studies in Clostridium difficile.</a> J. Microbiol. Methods. 87, 133-138 (2011).</li>
<li>Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clospore%3A+a+liquid+medium+for+producing+high+titers+of+semi-purified+spores+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC+Int%22%5BJournal%5D)">Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile.</a> J. AOAC Int. 94, 618-626 (2011).</li>
<li>Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+the+initiation+of+Clostridium+difficile+spore+germination+using+analogs+of+chenodeoxycholic+acid%2C+a+bile+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Inhibiting the initiation of Clostridium difficile spore germination using analogs of chenodeoxycholic acid, a bile acid.</a> J. Bacteriol. 192, 4983-4990 (2010).</li>
<li>O'Connor, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+analysis+of+chromosomal+Clostridium+difficile+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction and analysis of chromosomal Clostridium difficile mutants.</a> Mol. Microbiol. 61, 1335-1351 (2006).</li>
<li>Buggy, B. P., Wilson, K. H., Fekety, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+for+recovery+of+Clostridium+difficile+from+an+environmental+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods for recovery of Clostridium difficile from an environmental surface.</a> J. Clin. Microbiol. 18, 348-352 (1983).</li>
<li>Koch, C. J., Kruuv, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+release+of+oxygen+from+polystyrene+Petri+dishes%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Radiol%22%5BJournal%5D)">The release of oxygen from polystyrene Petri dishes.</a> Br. J. Radiol. 45, 787-788 (1972).</li>
<li>Ethapa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+factors+modulate+biofilm+formation+by+the+anaerobic+pathogen+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile.</a> J. Bacteriol. , (2012).</li>
<li>Speers, A. M., Cologgi, D. L., Reguera, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaerobic+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Anaerobic cell culture.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Appendix 4, Appendix 4F(2009).</li>
<li>Lyras, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin+B+is+essential+for+virulence+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile.</a> Nature. 458, 1176-1179 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

השיטות שתוארו כאן לאפשר התאוששות פשוטה ומהירה של ג difficile ממגוון רחב של דגימות צואה, כולל בני אדם, עכברים ואוגרים, כמו גם האחסון לטווח הארוך של ג difficile כמו מניות גליצרול או נבג. ג difficile יכול להיות אורגניזם קשה לעיבוד, אך הקפדה על סביבת אנאירובי והיישום של טכניקות אספטיים יכולים לספק לצמיחה איתנה והפחתה בזיהום. תאים אנאירוביים: שיקולים ותחזוקה <p class="jove_content" style=";...

difficile Clostridium הוא, חיידק יוצר נבג גראם חיובי שהוא anaerobe לחייב והפתוגן במערכת העיכול שעלול להיות קטלני לבני אדם ובעלי חיים. תאר בשנת 1935 תחילה כאורגניזם commensal נמצא בדגימות צואה מיילודים 1, ג difficile מאוחר יותר הוכיח להיות הסוכן סיבתי של קוליטיס pseudomembranous הקשורים לטיפול אנטיביוטי 2. ג זיהומי difficile (CDI) הם קדמו בדרך כלל על ידי טיפול אנטיביוטי שתוצאת שיבוש הפלורה הנורמלית במעי הגס, יצירת נישה לג difficile לשגשג 2. ג difficile מועבר כנבג רדום דרך מסלול הצואה, אוראלי ולאחר מכן נובט בתוך מערכת העיכול, בייצור תאים של צמח מסוגל לייצר כמה רעלים וגורמים למחלת קוליטיס 3 חמורות. CDI הוא לעתים קרובות עקשן לטיפולים קונבנציונליים והן באלהfections לעתים קרובות חוזרים על עצמם 4. כתוצאה מכך, CDI אחראי לעד 4.8 מליארד דולרים בעלויות טיפול רפואי בארצות הברית 5-7. ג difficile רגיש מאוד אפילו לרמות נמוכות של חמצן בסביבה. לג difficile להתמיד בסביבה ולהיות מועבר ביעילות ממארח ​​למארח, היווצרות נבג מטבולית פעיל היא 8 קריטיים. בגלל תחזוקת המעבדה ומניפולציה של ג difficile דורש סביבה מבוקרת, אנאירובי, טכניקות אלה מחייבות שימוש בתא אנאירובי. שימוש בתאים אנאירוביים הביאה התאוששות ובידוד של אנאירוביים לחייב 9-11 מוגבר, ואפשר מספר הטכניקות מולקולריות שיש לבצע באווירה אנאירובית. בנוסף לג difficile, שימוש אנאירובי קאמרי והתחזוקה המתוארת כאן חליםלאנאירוביים לחייב אחרים, כגון מינים אחרים קלוסטרידיאל (למשל perfringens ג), מינים אחרים במערכת העיכול (מינים למשל Bacteroides 12) ופתוגנים חניכיים (למשל מיני Peptostreptococcus 13).

<table><tbody><tr><td>פרוטאוז פפטון מס' 2</td><td>BD</td><td>212120</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher</td><td>S373</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>BP362</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S27</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 (נטול מים)</td><td>Fisher</td><td>M65</td><td></td></tr><tr><td>á'...-פרוקטוז</td><td>פישר</td><td>L96</td><td></td></tr><tr><td>נתרן טאורוכולט</td><td>סיגמא</td><td>T4009</td><td></td></tr><tr><td>á'...-ציקלוסרין</td><td>סיגמא</td><td>C6880</td><td></td></tr><tr><td>Cefoxitin</td><td>Fluka</td><td>C4786</td><td></td></tr><tr><td>עירוי לב מוח בינוני</td><td>BD</td><td>237300</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאוז פפטון</td><td>BD</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>(NH4)2SO4</td><td>Sigma</td><td>A5132</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteine</td><td>Sigma</td><td>C7755</td><td></td></tr><tr><td>BactoPeptone</td><td>BD</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>אגר דם כבשים קולומביאני</td><td>Fisher</td><td>L21928</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S27</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Fisher</td><td>BP2291</td><td></td></tr><tr><td>לולאות חיסון סטריליות</td><td>Fisher</td><td>22363596</td><td></td></tr><tr><td>ספוגיות סטריליות</td><td>Fisher</td><td>1495990</td><td></td></tr><tr><td>Coy ויניל תא אנאירובי ואביזרים</td><td>Coy Laboratory Products, Inc</td><td>שצוין על ידי הלקוח</td><td>פריטים אלה מוזמנים בהתאמה אישית לפי צרכי</td></tr><tr> מעבדה<td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td colspan="4">TCCFA agar proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 גרם NaCl 2 גרם MgSO4 (נטול מים) 0.1 גרם פרוקטוז 6 גרם אגר 20 גרם להביא ל-1 ליטר עם מים נטולי יונים וחיטוי ב-121 & deg; C למשך 20 דקות לעיקור. לאחר החיטוי, הוסף: 10 מ"ל של 10% (w/v) נתרן טאורוכולאט, מעוקר במסנן (מומס במים; ריכוז סופי, 0.1%) 25 מ"ל של 10 מ"ג/מ"ל á'...-ציקלוסרין, מעוקר במסנן (מומס במים; ריכוז סופי, 250 &mu; גרם/מ"ל) 1.6 מ"ל של 10 מ"ג/מ"ל צפוקסיטין, מעוקר במסנן (מומס במים; ריכוז סופי, 16 &mu; גרם/מ"ל) BHIS בינוני</חזק> חליטת לב למוח 37 גרם תמצית שמרים 5 גרם לצלחות, יש להוסיף 15 גרם אגר. הביאו ל-1 ליטר עם מים נטולי יונים וחיטוי ב-121 מעלות; C למשך 20 דקות לעיקור. אופציונלי (להוסיף לאחר חיטוי): 3 מ"ל של 10% (w/v) L-cysteine (מומס במים; ריכוז סופי, 0.03%) 10 מ"ל של 10% (w/v) נתרן טאורוכולט (מומס במים; ריכוז סופי, 0.1%) SMC Sporulation בינוני</חזק> BactoPeptone 90 g פרוטאז פפטון 5 גרם (NH4)2SO4 1 g בסיס Tris 1.5 g Agar 15 g להביא ל-1 ליטר עם מים נטולי יונים וחיטוי ב-121 & deg; C למשך 20 דקות לעיקור. אופציונלי (להוסיף לאחר חיטוי): 3 מ"ל של 10% (w/v) L-ציסטאין (נמס במים; ריכוז סופי, 0.03%) 70:30 בינוני</חזק> בקטופפטון 63 גרם פרוטאז פפטון 3.5 גרם חליטת לב למוח 11.1 גרם תמצית שמרים 1.5 גרם<>> (NH<sub4)2SO4 0.7 g בסיס Tris 1.06 g לצלחות יש להוסיף 15 גרם אגר. הביאו ל-1 ליטר עם מים נטולי יונים וחיטוי ב-121 מעלות; C למשך 20 דקות לעיקור. לאחר החיטוי, יש להוסיף 3 מ"ל של 10% L-ציסטאין (ריכוז סופי, 0.03%). אגר דם מומלץ להשתמש בצלחות אגר דם כבשים אנאירוביות מוכנות מראש של קולומביה (Fisher Scientific, L21928)35. 1X תמיסת מלח בופר פוספט (PBS) NaCl 8.01 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.27 g הביאו ל-1 ליטר עם מים נטולי יונים והתאימו את ה-pH ל-7.4 עם HCl. מסנן יש לעקר לפני השימוש.</td></tr></tbody></table>

culturing ושמירה<em&gt; difficile clostridium</em&gt; בסביבת אנאירובית

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

difficile Clostridium הוא אנאירובי, חיידק גראם חיובי, sporogenic שאחראי בעיקר לשלשולי אנטיביוטיקה משויכים (AAD), והוא הפתוגן nosocomial משמעותי. ג difficile קשה לשמצה לבודד ולטפח והוא מאוד רגיש אפילו רמות נמוכות של חמצן בסביבה. כאן, שיטות לבידוד ג difficile מדגימות צואה ולאחר מכן culturing ג difficile להכנה של מניות גליצרול עבור אחסון לטווח ארוך מוצגים. טכניקות להכנה וספירת מניות נבג במעבדה עבור מגוון רחב של יישומים במורד הזרם כוללים מחקרי מיקרוסקופיה ובעלי החיים גם מתוארות. טכניקות אלו מחייבות תא אנאירובי, אשר שומר על סביבת אנאירובי עקבית על מנת להבטיח תנאים נאותים לג האופטימלי צמיחת difficile. אנו מספקים פרוטוקולים להעברת חומרים בתוך ומחוץ לחדר בלי caבאמצעות זיהום חמצן משמעותי יחד עם הצעות לתחזוקה שוטפת הנדרשת כדי לקיים את סביבת אנאירובי המתאימה לג יעיל ועקבי טיפוח difficile.

דוגמא של ג difficile גדל על BHIS ותקשורת כבשים אנאירובי קולומביה אגר דם שניתן לראות באיור 2. ג difficile יוצר מושבות סדירות שהם שטוחים ובעלי מראה קרקע זכוכית אשר באו לידי ביטוי בשני אמצעי התקשורת. הנה, לבודד קליני אריתרומיצין רגיש של ג difficile, 630E 30, הוא גדל על BHIS אגר, מדיום מועשר, הלא סלקטיבי, ל24 שעות על 37 ° C (איור 2 א). מושבות על אגר דם קולומביה אנאירובי כבשים נראות דומות לאלה שגדלו על BHIS תחת אור...

difficile Clostridium הוא חיידק פתוגניים שהוא anaerobe מחמיר וגורם לשלשול לאנטיביוטיקה קשור (AAD). כאן, שיטות לבידוד, culturing ושמירה על ג תאים של צמח difficile ונבגים מתוארים. טכניקות אלו מחייבות תא אנאירובי, אשר דורשת תחזוקה שוטפת על מנת להבטיח תנאים נאותים לג האופטימלי טיפוח difficile.

Culturing ושמירה<em&gt; Difficile Clostridium</em&gt; בסביבת אנאירובית

Clostridium  difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium  that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד c difficile מדגימות צואה כדי לגדל C difficile להכנת מאגרי גליצריול לאחסון לטווח ארוך, ולהכין ולספור מאגרי נבגים עבור מגוון יישומים המשכיים. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד C difficile מדגימות צואה באמצעות זריעה על מצע סלקטיבי. השלב השני הוא גידול של C difficile במצע נוזלי ושמירה של מאגרי C difficile לטווח ארוך בגליצריול.בשלב הבא, מבודד C difficile ממאגרי גליצרול קפואים ונמרח על צלחות אגר. בשלב הסופי, מוכנים מאגרי נבגי C difficile המצויים בספירה סופית בהתאם לפרוטוקולים אלו. ניתן לגדל C difficile על מצעים שונים כדי לאמת ולאשש את זהותו, ולתרבת ולשמור אותו בהצלחה.ניתן להשתמש במקלות הגליצרול ובתרביות אלו ביישומים רבם בהמשך, כולל מחקרי בעלי חיים ומחקרי ביולוגיה מולקולרית נוספים. היתרון העיקרי בשימוש בתא אנאירובי מויניל לגידול של c difficile לעומת שיטות אחרות, כגון שימוש בצנצנות נרות, הוא שניתן לשמור על סביבה אנאירובית קפדנית, המאפשרת צמיחה עקבית ואמינה של c difficile. באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בטכניקות אלו עלולים להיתקל בבעיות עקב חוסר בזריזות התנועה בתוך התא בגלל הכפפות, וכן בשל הצורך הקריטי לתכנן את ניסויהם מראש.טכנאי מהמעבדה שלי, Jose Suarez, ידגים את ההליכים הללו בהתחלה. ניתן לבצע הליך זה בתנאים אירוביים. ראשית, שקלו את דגימת הצואה.שלב זה נחו

culturing-maintaining-clostridium-difficile-an-anaerobic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: Li, J., et al., פיתוח מודל זיהום של דג זברה זחל עבור Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים את הבידוד והתרבות של חיידקי Clostridioides difficile מהמעי של דג הזברה הזחל. המעי הנגוע מנותח, הומוגני ומודגר במדיה אנאירובית סלקטיבית המכילה אנטיביוטיקה. תנאים אלה מדכאים חיידקים מתחרים ומקדמים צמיחה של תאים ברי קיימא.

בידוד ותרבית של חיידקי Clostridioides difficile ממעי זחל דג הזברה

מקור: Anwar, Z., et al. העשרה וזיהוי של רעלנים של קלוסטרידיום פרפרינגנס בדגימות מזון קמעונאיות. J. Vis. Exp. (2019).בסרטון זה, חיידקים מפחיתי סולפיט מתורבתים במדיום אגר המכיל סולפיט, שם הם גדלים בצורה אנאירובית ומפחיתים סולפיט למימן גופרתי, ויוצרים משקעים שחורים עם יוני ברזל. מושבות שחורות מבודדות מעומק האגר בטכניקות אספטיות ומועברות למדיום טרי להמשך דגירה אנאירובית.

תת-תרבית של חיידקים אנאירוביים מפחיתי סולפיט מתרבית אגר

פרוטוקול זה מתאר את מודל עכבר cefoperazone של זיהום difficile Clostridium (CDI) באמצעות זן קליני רלוונטי וגנטי-צייתן, R20291. דגש על ניטור מחלה קליני, פקידת חיידקי C. difficile, cytotoxicity רעלן, ושינויי histopathological ברחבי CDI במודל של עכברים מפורטים בפרוטוקול.

Cefoperazone שטופל עכבר דגם של קליני רלוונטי<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; R20291 הזנים

יעילות האנטיביוטיקה נקבעת לרוב על ידי ביצוע מחקרים קינטיים להרג ומדידת יחידות יוצרות מושבה (CFUs). על ידי שילוב מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) עם שיטות סטנדרטיות אלה, אנו יכולים להבחין בין ההשפעות הפרמקולוגיות של הטיפול בין אנטיביוטיקות שונות.

פרוטוקול לאפיין את השינויים המורפולוגיים של<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; בתגובה לטיפול אנטיביוטי

כמו אורגניזמים אנאירובית מחייב אינם מסוגלים לצמוח על החשיפה לחמצן, השימוש של טכניקות culturing אנאירובית הוא הכרחי. כאן, אנו להדגים שיטה פשוטה ויעילה לטפח תרבות מעורבת נגזר צמח ביוגז מפני התקשורת הכנה גז וכימות חומצות שומן נדיף.

הכנה בינונית לטיפוח מיקרואורגניזמים בתנאים אנאירובית/אנקסימית בלבד

המוקד של מאמר זה הוא לפרט שיטות עבודה מומלצות להכנת מדיה עבור מיקרואורגניזמים אנאירוביים מהירים שנרכשו מסביבה. שיטות אלה מסייעות בניהול תרביות אנאירוביות וניתן ליישם אותן כדי לתמוך בצמיחה של מיקרואורגניזמים חמקמקים ולא מתורבתים, "החומר האפל המיקרוביאלי".

קבוצה של פורמטים מדומים מדומים באתרם לטיפוח מיקרואורגניזמים אנאירוביים שנרכשו בסביבה

הפרוטוקול מציג שתי מתודולוגיות לשיפור הבידוד של חיידקי מעיים אנאירוביים. הראשון מתמקד בבידוד של מגוון רחב של חיידקים באמצעות אמצעי תרבית שונים. השני מתמקד בשלבי הטיפוח של קבוצת חיידקים מסוימת, אולי הטמעת מיו-אינוסיטול, כדי להבין באופן מלא את משמעותה האקולוגית.

אסטרטגיות לשיפור טיפוח חיידקים אנאירוביים ממערכת העיכול של עוף

אנו מתארים שיטות לבידוד היעילה ומהיר / התרבות של microglia קיימא מקליפת המוח וחוט השדרה בילוד מבוגר. הנתיחה והציפוי של microglia קליפת המוח יכולים להיות מושלמת תוך 90 דקות, עם קציר microglial שלאחר מכן מתקיים ~ 10 ימים לאחר הנתיחה הראשונית.

Microglia culturing ממערכת העצבים המרכזי וילודים למבוגרים

אנו מתארים כאן הקרינה פשוטה בשיטת הכלאה באתר (FISH) ללוקליזציה של וירוסים וחיידקים ברקמות חרקים וצמחים. פרוטוקול זה יכול להתארך להדמיה של ה-mRNA בהר שלם וחתכים מיקרוסקופיים.

פלואורסצנציה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאות (דגים) ללוקליזציה של וירוסים וחיידקים Endosymbiotic בצמח ורקמות חרקים

בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות להעברה יעילה של קווי תאי מקרופאגים של עכברים עם siRNAs באמצעות מערכת המעבורת Amaxa Nucleofector 96-well, לעורר את המקרופאגים עם ליפופוליסכריד ולנטר את ההשפעות על ייצור ציטוקינים דלקתיים.

באמצעות RNA-התערבות לחקר התגובה החיסונית המולדת בהמקרופאגים עכבר

למדו לבודד ולגדל Clostridium difficile בסביבה אנאירובית לצורך הכנת מלאי גליצרול ומניות נבגים לטווח ארוך. השיטות הללו חיוניות למחקר על עמידות לאנטיביוטיקה ופתוגניות.

Culturing ושמירה

גלה סרטונים נוספים