Culturing ושמירה

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד c difficile מדגימות צואה כדי לגדל C difficile להכנת מאגרי גליצריול לאחסון לטווח ארוך, ולהכין ולספור מאגרי נבגים עבור מגוון יישומים המשכיים. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד C difficile מדגימות צואה באמצעות זריעה על מצע סלקטיבי. השלב השני הוא גידול של C difficile במצע נוזלי ושמירה של מאגרי C difficile לטווח ארוך בגליצריול.

בשלב הבא, מבודד C difficile ממאגרי גליצרול קפואים ונמרח על צלחות אגר. בשלב הסופי, מוכנים מאגרי נבגי C difficile המצויים בספירה סופית בהתאם לפרוטוקולים אלו. ניתן לגדל C difficile על מצעים שונים כדי לאמת ולאשש את זהותו, ולתרבת ולשמור אותו בהצלחה.

ניתן להשתמש במקלות הגליצרול ובתרביות אלו ביישומים רבם בהמשך, כולל מחקרי בעלי חיים ומחקרי ביולוגיה מולקולרית נוספים. היתרון העיקרי בשימוש בתא אנאירובי מויניל לגידול של c difficile לעומת שיטות אחרות, כגון שימוש בצנצנות נרות, הוא שניתן לשמור על סביבה אנאירובית קפדנית, המאפשרת צמיחה עקבית ואמינה של c difficile. באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בטכניקות אלו עלולים להיתקל בבעיות עקב חוסר בזריזות התנועה בתוך התא בגלל הכפפות, וכן בשל הצורך הקריטי לתכנן את ניסויהם מראש.

טכנאי מהמעבדה שלי, Jose Suarez, ידגים את ההליכים הללו בהתחלה. ניתן לבצע הליך זה בתנאים אירוביים. ראשית, שקלו את דגימת הצואה.

שלב זה נחוץ לצורך ספירת c difficile מהצואה. לאחר מכן, השביה מחדש את דגימת הצואה ב-one XPBS וערבב במכשיר וורטקס (vortex) כדי להבטיח שדגימת הצואה הושביתה באופן מלא. בשלב הבא, בצע דילולים סדרתיים של דגימת הצואה שהושביתה ב-one XPBS לצורך בידוד מתאים או ספירה של יחידות יוצרות מושבות או CFU לגרם צואה מעתה ואילך.

בצע את הפרוצדורה בתנאים אנאירוביים כדי להבטיח שתאים וגטטיביים של C difficile לא ייחשפו לחמצן. התא האנאירובי ששימש בניסוי זה נשמר בטמפרטורה של 37 °C. פעל בטכניקה אספטית.

העבירו 100 µL מכל דילול סדרתי לצלחות Toro collate oxetane, cyclo Seine, fructose agar, או T-C-C-F-A. צלחות אלו עברו רדוקציה מוקדמת למשך שעה עד שעתיים לפחות בתאנאי במבטן אנאירובית כדי להבטיח את הסרת החמצן השארי. זאת כדי לבודד מושבות לצורך ספירה מדויקת או ליישומים המשכיים אחרים.

השתמש בלולאת הזרקה סטרילית כדי לפרוס באופן אחיד את התרבית שיושמה על פני השטח של צלחת ה-T-C-C-F-A. דגרו את הצלחות בתנאים אנאירוביים למשך 48 שעות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius לאחר 48 שעות. זהו מושבות של c difficile על סמך המראה השטוח והבלתי סדיר שלהן, הדומה לזכוכית חלבית, כדי להבטיח שצמיחת c difficile וגטטיבית לא תושמד עקב חשיפה לחמצן.

יש לשמור את המצעים המשמשים לבידוד מושבות עבור יישומים המשכיים בתוך התא האנאירובי בכל עת. לצורך ספירת מושבות, ניתן להוציא את המצעים מחוץ לתא האנאירובי. יש לשים לב שברגע שמצע מוצא מהתא, תאי *C. difficile* וגיטטיביים ייחשפו לחמצן וימותו.

לא ניתן להציל מושבות C difficile אלו גם אם המאגש יוחזר לתא. ספרו את מושבות ה-C difficile של כל מיהול וחשבו את מספר ה-CFU לגרם של דגימת צואה לצורך תרבית והכנת מלאי גליצרול של c difficile. השתמשו בלולאת הזרקה סטרילית כדי לבודד מושבה בודדת ושטחו אותה על מצע pre reduced brain heart infusion.

בצלחות אגר BHIS המועשרות בתמצית שמרים או ב-0.03% cysteine, בצעו מריחה של מושבות בודדות וריבועיות (quadrants), תוך שימוש בלולאת הזרקה סטרילית חדשה עבור כל ריבוע. דגרו את הצלחות בתנאי אנאירובי בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 16 עד 24 שעות. מרגע הופעתן של מושבות מבודדות על צלחות אגר BHIS, בחרו מושבה מבודדת בודדת ותלו אותה מחדש ב-10 milliliters של מצע נוזלי BHIS שעבר חיזור מוקדם והועשר ב-0.03%L cysteine; דגרו למשך לילה.

באופן אנאירובי ב-37 degrees Celsius או עד שהתרבית הופכת עכורה. למחרת, העבירו 333 microliters של 50%glycerol ו-666 microliters של תרבית c difficile למבחנה קריוגנית של 1.8 milliliter. כדי ליצור מאגר 15%glycerol של הזן המבודד, סגרו את המבחנה הקריוגנית היטב וערבבו.

הוצא מיד את המלאי מהתא האנאירובי והנח אותו במקפיא של 80- מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך. כדי להתחיל בהליך זה, הוצא את מלאי הגליצרול הקפוא של c difficile מהמקפיא של 80- מעלות צלזיוס. כדי למנוע הפשרה.

העבירו מיד את מלאי הגליצרול הקפוא למעמד קירור שנשמר בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס לפני השימוש. העבירו את מלאי הגליצרול הקפוא שבמעמד הקירור אל תוך התא האנאירובי באמצעות טכניקה אספטית ולולאת הזרקה סטרילית. הניחו כמות קטנה מהמלאי על הצלחת ובצעו מריחה (streak) על רבע אחד מהצלחת.

סובב את הצלחת ב-90 מעלות ובאמצעות לולאת הזרקה סטרילית חדשה, בצע מריחה על הרביע השני. חזור על הפעולה עבור הרביע השלישי והרביעי כדי להבטיח בידוד של מושבות בודדות. הוצא מיד את מאגר הגליצרול הקפוא מהתא האנאירובי והחזר אותו למקפיא בטמפרטורה של 80- מעלות Celsius.

דגרו את המצע באופן אנאירובי למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C כדי לטהר נבגים מתרבית של c difficile. העבירו זנים ממלאי גליצריל קפוא למצעי BHIS שעברו רדוקציה מוקדמת, בהתאם לנוהל שהודגם בסגמנט הקודם.

דגרו באופן אנארובי למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C. למחרת, העבירו מושבות בודדות למספר צלחות pred reduced 70 30. דגרו באופן אנארובי בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 עד 48 שעות.

לאחר היווצרות הנבגים, הוצא את הצלחות מתא האטמוספררה האנארובי. גרד את הצלחות באמצעות לולאת הזרקה סטרילית והשעה מחדש את התאים ב-10 milliliters של 1X PBS סטרילי. השלך את הצלחות, ורסב את התאים ב-3000 G למשך 15 דקות.

הסר את הנוזל העליון, הוסף מיליליטר אחד של 1 XPBS resus, תלה ומרכז שוב באופן זה. שטוף את התאים פעמיים ב-PBS והדגר בטמפרטורה של 4 °C למשך לילה כדי לסייע בליזיס של תאים וגיטטיביים ותאי אם; ביום למחרת, הדגר בטמפרטורה של 70 °C למשך 20 דקות כדי להשמיד תאים וגיטטיביים שנותרו. כדי לקבוע את ה-CFU למיליליטר, בצע דילולים סדרתיים של כל תכשיר נבגים ב-1 XPBS ופזר על מצע BHIS pre-reduced בתוספת 0.1% Sodium Toro collate; הדגר את הצלחות בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 שעות לפחות לפני ספירת המושבות.

ניתן לאחסן נבגים ב-XPBS אחד, בטמפרטורת החדר לאחסון לטווח קצר או ב-4 °C לאחסון לטווח ארוך. A. דוגמה של *C. difficile* שגודל על מצעי BHIS ו-Columbia anaerobic sheep blood agar מוצגת כאן.

C difficile יוצרת מושבות לא סדירות שהן שטוחות ובעלות מראה של זכוכית חלבית (ground glass) הניכר בשני המצעים. פאנל A מציג בידוד קליני של C difficile 630 E הרגיש לאריתרומיצין, שגודל על אגר BHIS, מצע מועשר שאינו סלקטיבי, למשך 24 שעות. בטמפרטורה של 37 degrees Celsius, מושבות על אגר דם כבשים אנאירובי של Columbia המוצגות בפאנל B נראות דומות לאלו שגודלו ב-BHIS תחת תאורה לבנה.

עם זאת, השימוש במצע זה מאפשר גם זיהוי של הפלואורסצנציה הירוקה או הלימונית המוצגת על ידי C difficile תחת אור על-סגול באורך גל ארוך, כפי שמוצג בלוח C לאחר ביצוע הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון עקומות גדילה במצע נוזלי, בידוד מושבות, DNA ו-RNA, PCR וטכניקות ביולוגיה מולקולרית ומניפולציות אחרות המתאימות ל-C difficile, וכן שימוש בנבגי C difficile למחקרי בעלי חיים, על מנת להשיב על שאלות נוספות בביולוגיה מולקולרית. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו מבודדים, מתרבים ומתחזקים תאים וגטיביים ונבגים של C difficile בתוך סביבה אנרובית.

אל תשכחו ש-c difficile הוא פתוגן של בני אדם ובעלי חיים שעלול לגרום למחלה במערכת העיכול. ניסויים עם c difficile חייבים להתבצע תחת תנאי רמת בטיחות ביולוגית 2 מתאימים.