חקר אינטראקציות של סטפילוקוקוס עם נויטרופילים ידי cytometry זרימה מיקרוסקופית וזמן לשגות

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לחקור את ההשפעות של פנול סטפילוקוקלי, מודלין מסיס או PSMs על נויטרופילים אנושיים. זה מושג על ידי בידוד ראשון של נויטרופילים מדם אנושי לניתוח מבחנה לאחר מכן. לאחר מכן, הנויטרופילים נטענים בצבע פלואורסצנטי ומעורבבים עם סדרת ריכוז של PSMs עם ובלי מעכבים, או שהם מורשים לפגוציטוזה חיידקי S reus המכילים מבנה מדווח GFP של מקדם אלפא PSM.

בסופו של דבר ניתן לנטר את הפעלת הנויטרופילים על ידי גירוי PSM על ידי זרימה ציטומטרית וביטוי של GFP על ידי הפגוציטוזה. ניתן לנתח חיידקים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בשיטה זו. אתה יכול לחקור את ההשפעות של סטפילוקוקלים, פניל, סויה, מולינים או נויטרופילים.

כמובן שניתן ליישם שיטה זו על סוגי תאים רבים אחרים, גירויים ואנטגוניסטים. לראשונה עלה לנו הרעיון לחלק המיקרוסקופיה של שיטה זו כאשר דנו בדרך להתבונן בהשפעות של PSMs בתוך נויטרופילים. שימוש במבנה ביטוי GFP חיידקי ומיקרוסקופ זמן-lapse מאפשר לנו לעשות בדיוק את זה.

לאחר שאיבת חמש שפופרות של דם ורידי הפריני, שפכו 12 מיליליטר של תמיסת פיל בצפיפות של 1.119 גרם למיליליטר לתוך שפופרת של 50 מיליליטר, ולאחר מכן כיסו בזהירות 10 מיליליטר של תמיסת קריאה FI בצפיפות של 1.077 גרם למיליליטר. לאחר מכן, יש לדלל את הדם בנפח שווה של PBS ולשכב 20 עד 25 מיליליטר דם בזהירות על כל שיפוע קריאה דו-שכבתי. צנטריפוגה את השיפועים למשך 20 דקות ב-396 פעמים G ו-22 מעלות צלזיוס מבלי להישבר.

ולאחר מכן השתמש במשאבת ואקום המצוידת בקצה פיפטה סטרילי כדי לשאוב את שכבות הפלזמה הצהובות העליונות ושכבות ה-PBMC. ואז השכבה הלבנה השלישית. כעת השתמש בפיפטה קטנה מפלסטיק כדי להעביר את הנויטרופיל הפולימורפו-גרעיני או שבר ה-PMN מכל צינור לצינור חדש של 50 מיליליטר.

הוסיפו לכל שפופרת את ה-PMI הטרי שלנו בתוספת אלבומין בסרום אנושי או R-P-M-I-H-S-A כדי להביא את הנפח הכולל ל-50 מיליליטר. לאחר מכן סובב את התאים, שאב את הסופרנטנט עם משאבת ואקום ומערבל בעדינות את האריתרוציט האדום והכדור המכיל PMN. לאחר מכן, הוסף תשעה מיליליטר של מים סטריליים נטולי יונים לתאים והפעל טיימר.

הוסף בדיוק 30 שניות. הוסף מיליליטר אחד של PBS מרוכז פי 10 כדי לעצור את ההלם ההיפראוסמוטי. לאחר מכן שטפו את התאים בנפח כולל של 50 מיליליטר R-P-M-I-H-S-A קר.

לאחר הסרת הסופרנטנט, הוסף מיליליטר אחד של R-P-M-I-H-S-A לכל חיך, שכעת הוא לבן עקב ליזה של אריתרוציטים. לאחר מכן החייאה, השעיה על ידי פיפטינג ושלב את הכדורים בצינור אחד. כעת ספור את התאים והתאם את הריכוז לאחד כפול 10 לתאים השביעיים למיליליטר.

עכשיו טען חמש פעמים 10 עד שישי תאים למיליליטר עם שתי שפעת מיקרומולרית, או 3:00 לפנות בוקר ב-R-P-M-I-H-S-A. וכסו את הצינור בנייר אלומיניום כדי להגן עליו מפני אור. לאחר מכן, דגרו את התאים למשך 20 דקות בטמפרטורה תחת תסיסה.

בינתיים, הכינו דילול סדרתי משולש של הגירוי פי 10 מהריכוז הסופי. לאחר מכן דגרו מראש 30 מיקרוליטר מהגירוי בנפח שווה של מעכב או חיץ מרוכז טרי פי 10 למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את התאים ב-10 מיליליטר של R-P-M-I-H-S-A והשעו מחדש את התאים ב-R-P-M-I-H-S-A טריים בחמישה כפול 10 עד שישית תאים למיליליטר.

ממש לפני ניתוח הזרימה, יש לדלל את התאים לשניים פי 10 עד שישי תאים למיליליטר ב-R-P-M-I-H-S-A ולהוסיף 200 מיקרוליטר תאים לכל שפופרת פקס. היזהר לא להפעיל את התאים על ידי ניעור או פיפטינג להעמיס את הצינור הראשון על ציטומטר הזרימה. המתן שלוש שניות ואז התחל את הרכישה לאחר פרק זמן קבוע, למשל, שמונה שניות, הסר את הצינור והוסף במהירות 50 מיקרוליטר מהדילול הנמוך ביותר של הגירוי לדגימה.

טען מחדש מיד את הצינור והמשך ברכישה. בסיום סדרת הדילול, שטפו את מחט ציטומטר הזרימה עם R-P-M-I-H-S-A טרי לפני מדידת סדרה חדשה. לאחר הפעלת הדגימה האחרונה, נתח את הנתונים באמצעות תוכנת ניתוח זרימה ציטומטרית כדי לנתח ביטוי GFP חיידקי.

לאחר שפגוציטוזיס PMN מגדלים זן S ous המכיל את מבנה המדווח המעניין בן לילה במרק, הסר כל GFP המתבטא במהלך תרבית הלילה על ידי דילול התאים ל-OD 6 60 0 0.01. הגדל את התרבות ל-OD 6 60 0 0.1. יש לדלל את התאים מאחד ל-30, ולאחר מכן לעקוב אחר הגידול עד שהתרבית מגיעה שוב ל-OD 60 של 0.1.

לאחר מכן אוספים את החיידקים על ידי צנטריפוגה. שטפו את התאים פעם אחת ב-DPBS וב-Resus. השעו את התרבות.

הוסף 1 עד 10 מהנפח המקורי כדי לקבל OD 60 60 של 1.0 או בערך חמש פעמים 10 ל-CFU השמיני למיליליטר. כעת ערבבו את החיידקים עם ה-PNS הטרי שבודד ב-R-P-M-I-H-S-A ביחס של 10 לאחד. לאחר מכן הוסף סרום אנושי מאוגד לנפח קצה עשירי כולל של סרום אנושי מאוגד בתוך תמיסת התא.

לעורר פגוציטוזיס על ידי ניעור תערובת התאים למשך 10 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן יש לדלל את ה-PMNs הטעונים ל-5 פעמים 10 עד 5 תאים למיליליטר, ולהעביר 250 מיקרוליטר מהתאים לכל באר של תלוש כיסוי בעל שמונה תאים. לבסוף, דמיין את התאים במיקרוסקופ הפוך המצויד באובייקט פי 40 ועטוף בתא סביבה חשוכה ורכוש תמונות במספר מיקומים בתאי החלקת הכיסוי כל חמש עד 10 דקות הן בשדה הבהיר והן בערוץ GFP כדי לעקוב אחר ייצור ה-GFP החיידקי בזמן אמת, דגירה של נויטרופילים עם סדרת ריכוז של PSM אלפא שלוש סינתטי מביאה להפעלה מהירה תלוית מינון של תאים כפי שנמדדו על ידי שטף סידן.

דגירה מוקדמת של פפטיד PSM אלפא 3 עם 0.01%0.1% או 1% סרום אנושי עיכבה באופן משמעותי את יכולת הגירוי לעורר תגובת סידן. שוב באופן תלוי מינון בסרום של 1%. כמעט ולא נראית הפעלה בריכוזים אלה של PSM alpha three.

בתמונות אלה מוצגים שני נויטרופילים המכילים חיידקי פגוציטוז המכילים מבנה מדווח PSM אלפא GFP. החיידקים מתחילים להאיר כשעה לאחר פגוציטוזיס המצביע על ביטוי של GFP ממקדם PSM אלפא. חיידקים מחוץ לנויטרופילים אינם זוהרים, מה שמצביע על כך שביטוי PSM אלפא מופעל במהירות רק כאשר החיידקים עוברים פגוציטוזציה.

כאשר מנסים הליך זה, חשוב לזכור להשתמש תמיד בנויטרופילים טריים לקבלת תוצאות מיטביות. לאחר צפייה בסרטון זה, אני מקווה שיש לכם הבנה טובה כיצד למדוד שטף סידן על ידי זרימה ציטומטרית וכיצד למדוד ביטוי גנים חיידקיים בתוך תאים אוקריוטיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.