Name: חקר אינטראקציות של סטפילוקוקוס עם נויטרופילים ידי cytometry זרימה מיקרוסקופית וזמן לשגות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: חקור את השפעת חלבוני PSM מ-Staphylococcus aureus על נויטרופילים אנושיים באמצעות ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופיית פלואורסצניה. שיטה זו מאפשרת ניטור הפעלת תאי חיסון ותיעוד בליעת חיידקים בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<p class="jove_content"&gt; RN מומן בחלקו על ידי מענקי Marie Curie שילוב מחדש אירופי (ERG) מתכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי, מספר פרויקט 268,324.</p&gt;

1. בידוד של PMNs דם אנושי על ידי צנטריפוגה הצפיפות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר 5 9 צינורות מ&quot;ל של דם ורידי heparinized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן Ficoll הדרגתיים שכבה כפולה (4 הדרגתיים לדם 5 צינורות) באופן הבא: יוצקים 12 מ&quot;ל של פתרון צפיפות 1.119 גרם / מיליליטר Ficoll בצינור 50 מ&quot;ל ובזהירות שכבה 10 מ&quot;ל של פתרון צפיפות 1.077 גרם / מיליליטר Ficoll על העליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הדם עם נפח שווה של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכבת הדם המדולל בזהירות על שיפוע Ficoll השכבה הכפול; 20-25 מ&quot;ל לשיפוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 20 דקות ב 396 XG ברוטור נדנוד דלי, 22 ° C ללא בלימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן RPMI קר המכיל 0.05% אנוש סרום אלבומין (RPMI-HSA). כמו כן להכין מיליליטר סטרילי deionized H 2 O. 9 טרום מגניב גם RPMI וH 2 O על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את השכבה העליונה המכילה Ficoll פלזמה (בצבע צהוב) וPBMC, והשכבה השנייה של Ficoll (בצבע לבן) עם השימוש במשאבת ואקום (לשים על קצה פיפטה סטריליתפיפטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את PMNs בצינורות 50 מ&quot;ל באמצעות פיפטה פלסטיק קטנה (צינור 1 לשברי PMN של כל 2 הדרגתיים), ומניח אותם על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף קר RPMI-HSA להיקף כולל של 50 מ&quot;ל ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 249 XG ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את supernatant עם השימוש במשאבת ואקום ומערבולת גלולה בעדינות (אריתרוציטים וPMNs). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף H 2 O deionized סטרילי מ&quot;ל 9 ולהתחיל את הטיימר. לעצור את ההלם האוסמוטי Hyper אחרי 30 שניות בדיוק, על ידי הוספת 1 מ&quot;ל 10 פעמים PBS המרוכז. הערה: 30 שניות הן קריטיות מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף קר RPMI-HSA להיקף כולל של 50 מ&quot;ל ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 249 XG ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את supernatant עם השימוש במשאבת ואקום ולאסוף את כדור PMN בצינור 1 עם נפח מוגדר (1-2 מ&quot;ל) RPMI-HSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הכמות של תאים ולהתאים את הריכוז ל1.10 7 תאים / מ&quot;ל. בהתאם לתורם, התשואה של PMNs מבודד תהיה betwex 10 6 ו 3 10 7 PMNs en 5 x מצינור כל מ&quot;ל של דם 9 </li></ol> 2. Assay תזרים cytometric להערכה של גיוס הסיד בPMNs אדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי עומס (5 x 10 6 תאים / מ&quot;ל) עם 2 מיקרומטר Fluo-3-AM בRPMI-HSA ודגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר נדנדה לאט, באמצעות למשל נדנדה פלטפורמה שייקר, מוגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים להכין דילול סדרתי (למשל פי 3) של הגירוי בריכוז הסופי 10x. PSMα3 נעשה שימוש בפרוטוקול זה, אך כל גירוי GPCR הפועל על נויטרופילים מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מעכב מרוכז 10x של הקולטן בRPMI-HSA. כאשר המעכב פועל על הגירוי (HDL למשל בPSMα3) גירוי μl מראש דגירה 25 עם נפח שווה של מעכב למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים על ידי הוספת 10 מ&quot;ל של RPMI-HSA ו צנטריפוגות במשך 249 XG בטמפרטורת חדר. תאי Resuspend עד 5 X10 6 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רגע לפני הניסוי, לדלל את התאים ל2x10 6 תאים / מ&quot;ל בRPMI-HSA ולהוסיף 200 תאי μl לכל צינור FACS. PMNs המדולל הם מאוד שבירים. שמירה על אותם זמן רב מדי בריכוז זה תוביל להפעלה אוטומטית; אותו מחזיק לטלטול נמרץ או pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את הצינור לcytometer הזרימה, לחכות 3 שניות ולהתחיל רכישה. לאחר פרק זמן קבוע (לדוגמא 8 שניות), תוריד את הצינור במהירות ולהוסיף 50 גירוי μl למדגם. מייד לצרף מחדש את הצינור על בעל המדגם ולהמשיך ברכישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל עם סוף הנמוך ביותר ועם הריכוז הגבוה ביותר של גירוי. שטוף את מחט זרימת cytometer באופן קבוע אחרי כל סיבוב עם RPMI-HSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח נתונים עם תוכנת ניתוח cytometry זרימה. השווה את אות הקרינה הממוצעת לפני תוספת של הגירוי לכי לאחר תוספת של הגירוי ולהשתמש בפקדים החיוביים ושליליים המתאימים כדי לחשב את ACכוח tivation עבור כל דילול שנמדד. </li></ol> לחלופין, כאשר המעכב פועל על קולט מראש דגירה תאים עם המעכב. 3. ניתוח מיקרוסקופ פלואורסצנטי של הביטוי של GFP חיידקים לאחר phagocytosis ידי PMNs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול ס זני סטפילוקוקוס המכילים מבנה כתב עניין במשך הלילה במרק (עם אנטיביוטיקה כאשר נדרשים לשמור על כתב פלסמיד). במקרה זה מתח MW2 המכיל משמש מבנה כתב GFP PSMα 10, גדל בצינור פלסטיק 50 מ&quot;ל עם 5 מ&quot;ל של מדיום תרבות LB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את כל GFP מביטוי O / N, לדלל את התרבויות לOD 660 0.01 ולגדול לקוטר חיצוני 0.1 660. Redilute 01:30 תרבות זו, ולעקוב אחר צמיחה עד התרבות מגיעה OD 660 של 0.1. לאסוף את החיידקים על ידי צנטריפוגה ולשטוף פעם בDPBS. Resuspend ב1:10 הנפח המקורי כדי להשיג 660 OD של 1.0 או rקירוב 5.10 8 CFU / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את החיידקים (1.10 7 / מ&quot;ל) עם PMNs המבודדים טרי (1.10 6 / מ&quot;ל) בRPMI-HSA (יחס 10:01) בmicrotube 1.5 מ&quot;ל ולהוסיף סרום אנושי ונקווה לריכוז סופי של 10%. לנער על פלטפורמה רועדת במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי לעורר phagocytosis. לדלל את PMNs עמוסי חיידקים ל5.10 5 PMNs / מ&quot;ל וμl פיפטה 250 לתוך באר של להחליק את מכסה קבורים גם 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תדמית PMNs עם חיידקים במיקרוסקופ. מיקרוסקופ ההפוכה מצוידות אובייקטיבי NA 40X/0.85 עובדת טוב וצריכה להיות עטוף בתא סביבה חשוך כדי לשמור על הסביבה ביציבות על 37 ° C. לרכוש תמונות למספר התפקידים מוגדרים מראש באמצעות המצלמה בכל 5-10 דקות בשניהם בשדה הבהיר וערוץ ה-GFP לעקוב ייצור ה-GFP בזמן. </li></ol>

<ol><li>Rigby, K. M., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+innate+host+defense+against+Staphylococcus+aureus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in innate host defense against Staphylococcus aureus infections.</a> Semin. Immunopathol. 34, 237-259 (2012).</li>
<li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+Mechanisms+Used+by+Staphylococcus+aureus+to+Avoid+Destruction+by+Human+Neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Insights into Mechanisms Used by Staphylococcus aureus to Avoid Destruction by Human Neutrophils.</a> The Journal of Immunology. 175, 3907-3919 (2005).</li>
<li>Kobayashi, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+neutrophil+destruction+following+phagocytosis+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Rapid neutrophil destruction following phagocytosis of Staphylococcus aureus.</a> J. Innate Immun. 2, 560-575 (2010).</li>
<li>DeLeo, F. R., Otto, M., Kreiswirth, B. N., Chambers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community-associated+meticillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> The Lancet. 375, 1557(2010).</li>
<li>David, M. Z., Daum, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community-Associated+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus%3A+Epidemiology+and+Clinical+Consequences+of+an+Emerging+Epidemic%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: Epidemiology and Clinical Consequences of an Emerging Epidemic.</a> Clinical Microbiology Reviews. 23, 616-687 (2010).</li>
<li>Kretschmer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Formyl+Peptide+Receptor+2+Senses+Highly+Pathogenic+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Human Formyl Peptide Receptor 2 Senses Highly Pathogenic Staphylococcus aureus.</a> Cell Host & Microbe. 7, 463(2010).</li>
<li>Prat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homolog+of+formyl+peptide+receptor-like+1+%28FPRL1%29+inhibitor+from+Staphylococcus+aureus+%28FPRL1+inhibitory+protein%29+that+inhibits+FPRL1+and+FPR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A homolog of formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) inhibitor from Staphylococcus aureus (FPRL1 inhibitory protein) that inhibits FPRL1 and FPR.</a> J. Immunol. 183, 6569-6578 (2009).</li>
<li>Prat, C., Bestebroer, J., de Haas, C. J. C., van Strijp, J. A. G., van Kessel, K. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Staphylococcal+Anti-Inflammatory+Protein+That+Antagonizes+the+Formyl+Peptide+Receptor-Like+1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A New Staphylococcal Anti-Inflammatory Protein That Antagonizes the Formyl Peptide Receptor-Like 1.</a> The Journal of Immunology. 177, 8017-8026 (2006).</li>
<li>de Haas, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+inhibitory+protein+of+Staphylococcus+aureus%2C+a+bacterial+antiinflammatory+agent%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus, a bacterial antiinflammatory agent.</a> The Journal of Experimental Medicine. 199, 687-695 (2004).</li>
<li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Staphylococcal+Phenol+Soluble+Modulins+by+Serum+Lipoprotein+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Staphylococcal Phenol Soluble Modulins by Serum Lipoprotein Particles.</a> PLoS Pathog. 8, e1002606(2012).</li>
<li>Kubica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Potential+New+Pathway+for+Staphylococcus+aureus+Dissemination%3A+The+Silent+Survival+of+S.+aureus+Phagocytosed+by+Human+Monocyte-Derived+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Potential New Pathway for Staphylococcus aureus Dissemination: The Silent Survival of S. aureus Phagocytosed by Human Monocyte-Derived Macrophages.</a> PLoS ONE. 3, e1409(2008).</li>
<li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcal+alpha-phenol+soluble+modulins+contribute+to+neutrophil+lysis+after+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Staphylococcal alpha-phenol soluble modulins contribute to neutrophil lysis after phagocytosis.</a> Cellular Microbiology. , In Press (2013).</li>
<li>Queck, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAIII-Independent+Target+Gene+Control+by+the+agr+Quorum-Sensing+System%3A+Insight+into+the+Evolution+of+Virulence+Regulation+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RNAIII-Independent Target Gene Control by the agr Quorum-Sensing System: Insight into the Evolution of Virulence Regulation in Staphylococcus aureus.</a> Molecular Cell. 32, 150(2008).</li>
<li>Baban, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+Bacterial+Imaging+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo.</a> J. Vis. Exp. (69), e4318(2012).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

בשיטות שתוארו כאן כמה צעדים הם מאוד קריטיים. אנו ידגישו אלה כאן. לבידודה של נויטרופילים ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות זה חשוב לא להפריע לשכבות במהלך או לאחר את צעדי צנטריפוגה. כאשר aspirating את הנויטרופילים באמצעות פיפטה פלסטיק, לוודא שלא לסחוט את הבלון ואילו בשכבה של תאים, כמו הנוזל להוציא יפריע את השכבות. כמו כן, מבחינה ויזואלית לבדוק גלולה של נויטרופילים אחרי ההלם האוסמוטי וצעד צנטריפוגה. אם גלולה עדיין תמוגה הכ...

נויטרופילים (PMNs) הם phagocytes המקצועי שמשחקים תפקיד מפתח בתגובה החיסונית המולדת נגד Staphylococcus aureus 1. המאבק המתמיד בין מארח והחיידק הוביל למירוץ חימוש של שניהם. לאחרונה, קהילה הקשורים (CA) זנים של meticillin עמיד ס aureus (MRSA) צמחו נראה שכדי להיות יעיל מאוד בעקיפה של נויטרופילים הרג 2,3. ייצור יתר פנול מסיס modulin (PSMs) של CA-MRSA נקשר עם ארסיות גבוהה יותר 4,5. נויטרופילים אדם יכולים לזהות PSMs אלה באמצעות FPR2 אשר להוביל להפעלה של ה-G-חלבון זה יחד 6 קולט. אחד האירועים הראשונים הוא ההתגייסות של חנויות תאיות של סידן (Ca 2 +). Ca 2 + משמש כשליח משני עבור מגוון רחב של פונקציות, כולל מפעיל של PMNs degranulation וphagocytosis 7. לכן Ca 2 + הוא אינדיקטור רגיש מאוד שליכולת התפקודית של PSMs להפעיל PMNs. כדי לחקור את ההשפעות של PSMs על נויטרופילים, נויטרופילים טריים מבודדים ועמוסים בצבע, כי מאיר על גיוס סיד. בניסוי זרימת cytometry ניתן למדוד התגייסות מהירה זה. באמצעות שיטה זו, ניתן ללמוד את ההשפעות הישירות של רעילים ורכיבים אחרים על נויטרופילים, ולקבוע את הריכוז הנמוך ביותר שבם הם פעילים. עבורנו, זה הוא כלי שימושי מאוד כדי לחקור את ההשפעה של חלבונים רבים המיוצרים על ידי ס aureus מעורב בהעלמה חיסונית, כגון חלבון מעכב FPR2 (FLIPr) 8, FLIPr כמו 7, וחלבון מעכב Chemotaxis של סטפילוקוקוס (שבבים) 9. כל החלבונים האלה הוכחו לעכב את גיוס הסיד בנויטרופילים באמצעות קשירה לקולט הכרת אגוניסט. לאחרונה, הקבוצה שלנו שתארה PSMs תפקודי מעוכבת על ידי יפופרוטאין בסרום 10 &lt;/ Sup&gt;. יפופרוטאינים אלה הם שפע נוכחי בתוך הדם והרקמה אנושית, מה שמעיד שPSMs להפעיל את תפקידם בעיקר בסביבה תאית. הזמינות של assay גיוס הסיד אפשרה לנו למדוד את ההשפעה של ליפופרוטאין בסרום דווקא על הפעלה של נויטרופילים ידי PSMs, שמסומנת על ידי העיכוב הניכר בריכוזים נמוכים מאוד של סרום. מאז PSMs תפקודי מעוכבים על ידי סרום, שערנו כי יש תפקיד חשוב לPSMs כרעלים תאיים. לכן אנו מבקשים לקבוע את תפקידו של PSMs לאחר phagocytosis. כדי לחקור את הביטוי של PSMs במרחב אינטר, בנינו fusions הכתב של האמרגן של אופרון psmα ל-GFP. כשכתב זנים אלה של ס &#39; aureus היה phagocytosed ידי נויטרופילים, האינדוקציה של ביטוי הייתה להבחין באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 10. ברור, זה טקhnique מאפשר הלימוד של הביטוי של מספר רב של גנים בס aureus או פתוגנים אחרים לאחר phagocytosis. מאחר לס aureus לשרוד בנישה בין התאית הוא מאוד חשוב כדי להתגבר על מערכת החיסון המולדת 11 10 12, לומד את התפקיד של גנים מופעלים בנישה זו היא רלוונטי ביותר להבנת ביטוייה שונים.

<table><tbody><tr><td>Fluo-3, AM</td><td>בדיקות מולקולריות / Life Technologies</td><td>F-1241</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td>צפיפות 1.077 גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>צפיפות 1.119 גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>52400-025</td><td>מכיל 25 מ"מ HEPES ומיקרוסקופ L-גלוטמין</td></tr><tr><td>Leica TCS SP5</td><td>Leica מיקרוסיסטמס, הולנד</td><td>TCS SP5</td><td>מטרה: HCX PL APO 40x/0.85 </td></tr><tr><td>FACSCalibur</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSקליבור</td><td>חשוב מאוד שניתן יהיה להסיר ולהחליף את הצינור במהלך תהליך המדידה</td></tr></tbody></table>

חקר אינטראקציות של<em&gt; סטפילוקוקוס</em&gt; עם נויטרופילים ידי cytometry זרימה מיקרוסקופית וזמן לשגות

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

אנו מציגים שיטות כדי לחקור את ההשפעה של modulins פנול מסיס (PSMs) ורעלים אחרים המיוצר ומופרש על ידי סטפילוקוקוס על נויטרופילים. כדי לחקור את ההשפעות של PSMs על נויטרופילים אנחנו מבודדים נויטרופילים טריים באמצעות צנטריפוגה שיפוע צפיפות. נויטרופילים אלה נטענים עם צבע שמאיר על גיוס סיד. ההפעלה של נויטרופילים ידי PSMs יוזמת גידול מהיר וחולף בריכוז הסידן התוך התאי ללא תשלום. בניסוי זרימת cytometry התגייסות מהירה זו ניתן למדוד על ידי ניטור הקרינה של צבע טעון מראש שמגיב לריכוז המוגבר של Ca 2 + ללא תשלום. באמצעות שיטה זו אנו יכולים לקבוע את ריכוז PSM הצורך להפעיל נויטרופילים, ולמדוד את ההשפעות של מעכבים ספציפיים וכלליים של הפעלת נויטרופילים. כדי לחקור את הביטוי של PSMs במרחב תאי, Wדואר בנה fusions הכתב של האמרגן של אופרון PSMα ל-GFP. כשכתב זנים אלה של ס &#39; aureus הם phagocytosed ידי נויטרופילים, יכולה להיות שנצפה האינדוקציה של ביטוי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

assay תזרים cytometric להערכה של גיוס הסיד בPMNs אדם דוגרים נויטרופילים עם סדרת ריכוז PSMα3 סינטטי וכתוצאה מההפעלה מהירה כפי שהיא נמדדת על ידי שטף סידן, המוצג על ידי גידול באות בFL-1. טרום דגירה של PSMα3 הסינטטי עם 0.01%, 0.1% או 1% בסרום אנושי עכבות היכולת לעורר נתיבי סיד (איור 1) באופן משמעותי. ניתוח של הביטוי של GFP בחיידקים לאחר p...

אנו מציגים שיטות כדי לחקור את ההשפעה של PSMs ורעלים אחרים המופרשים על ידי<em&gt; סטפילוקוקוס</em&gt; בנויטרופילים באמצעות cytometry הזרימה ומיקרוסקופ פלואורסצנטי.

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לחקור את ההשפעות של פנול סטפילוקוקלי, מודלין מסיס או PSMs על נויטרופילים אנושיים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי בידוד נויטרופילים מדם אנושי לצורך אנליזה המשכית in vitro. לאחר מכן, הנויטרופילים טוענים צבע פלואורסצנטי ומעורבבים עם סדרת ריכוזים של PSMs עם ובלי מעכבים, או שהם מאפשרים פגוציטוזה של חיידקי S reus המכילים מבנה דותק (reporter construct) של GFP תחת פרומוטור של PSM alpha.בסופו של דבר, ניתן לנטר את הפעלת הנויטרופילים על ידי גרייה של PSM באמצעות ציטומטריה של זרימה, ואת ביטוי ה-GFP על ידי החיידקים שנבלעו ניתן לנתח באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. בשיטה זו ניתן לחקור את ההשפעות של פניל-סויה-מולין סטפילוקוקליים, או של נויטרופילים.כמובן שניתן להחיל שיטה זו על סוגי תאים, גירויים ואנטגוניסטים רבים אחרים. הרעיון לחלק המיקרוסקופי של שיטה זו עלה לראשונה בעת דיון על דרך לצפייה בהשפעות של PSMs בתוך נויטרופילים. שימוש בבנייה (construct) של ביטוי GFP חיידקי ומיקרוסקופיה של צילום רצף (time-lapse) מאפשרים לנו לעשות בדיוק זאת.לאחר שאיבת חמישה מבחנות של דם ורידי עם הפרין, שפו 12 מיליליטר של תמיסת Ficoll בצפיפות של 1.119 גרם למילו ליטר למבחנה של 50 מיליליטר, ולאחר מכן הוסיפו בזהירות שכבה של 10 מיליליטר של תמיסת Ficoll בצפיפות של 1.077 גרם למילו ליטר. לאחר מכן, דללו את הדם בנפח שווה של PBS והניחו בזהירות 20 עד 25 מיליליטר של דם על כל מדרג Ficoll כפול השכבות. סובבו את המדרגים בצנטריפוגה למשך 20 דקות ב-396 ×g ובטמפרטורה של 22 °C ללא בלימה.לאחר מכן, השתמשו במשאבת ואקום המצוידת בקצה פיפטה סטרילי כדי לשאוב את שכבות הפלסמה הצהובה וה-PBMC העליונות, ולאחר מכן את השכבה הלבנה השלישית. כעת, השתמשו בפיפטה פלסטית קטנה כדי להעביר את פראקציית התאי הנוטרופילים פולימורפוניקליים (polymorphonuclear neutrophil) או ה-PMN מכל מבחנה למבחנה חדשה של 50 מיליליטר.הוסיפו לכל מבחנה RPMI מקורר מראש שהוכן טרי ותומס ב albumin של בן אדם, או R-P-M-I-H-S-A, כדי להביא את הנפח הכולל ל-50 milliliters. לאחר מכן, סבבו את התאים במערך צנטריפוגה (spin down), שאבו את הנוזל העליון (supernatant) באמצעות משאבת ואקום, וערבבו בעדינות במכשיר וורטקס (vortex) את המשקע המכיל Erythrocytes ו-PMN. לאחר מכן, הוסיפו לתאים תשעה milliliters של מים סטריליים דה-יוניים והפעילו טיימר.הוסיפו בדיוק 30 שניות. הוסיפו מיליליטר אחד של PBS בריכוז פי 10 כדי לעצור את ההלם ההיפרו-אוסמוטי. לאחר מכן, שטפו את התאים בנפח כולל של 50 מיליליטר של R-P-M-I-H-S-A קר.לאחר הסרת הנוזל העליון, הוסיפו מיליליטר אחד של R-P-M-I-H-S-A לכל משטח, שהפך כעת ללבן עקב ליזיס של האריתרוציטים. לאחר מכן, השביו את התאים על ידי פיפטינג ואיחדו את המשקעים במבחנה אחת. כעת ספרו את התאים וכוון את הריכוז ל-1 × 10⁷ תאים למיליליטר.כעת טענו 5 × 10⁶ תאים למיליליטר עם 2 µM Fluo-3 AM ב-RPMI-HSA. כסו את המבחנה בנייר אלומיניום כדי להגן עליה מפני אור. לאחר מכן, דגרו את התאים למשך 20 דקות בטמפרטורה רלוונטית תחת ערבוב.בינתיים, הכינו דילול סדרתי פי שלושה של המעורר בריכוז הגבוה פי 10 מהריכוז הסופי. לאחר מכן, דגרו מראש 30 µL של המעורר עם נפח שווה של מעכב בריכוז פי 10 או בופר שהוכנו טריים, למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את התאים ב-10 mL של R-P-M-I-H-S-A והשעיקו אותם מחדש ב-R-P-M-I-H-S-A טרי בריכוז של 5×10⁶ תאים למל'.ממש לפני ניתוח הזרימה, לדלל את התאים לריכוז של 2x10⁶ תאים למיליליטר ב-R-P-M-I-H-S-A ולהוסיף 200 µL תאים לכל מבחנת fax. יש להימנע מהפעלת התאים על ידי ניעור או פיפוט, ולהטעין את המבחנה הראשונה בציטומטר הזרימה. המתן שלוש שניות ולאחר מכן התחל את הרכישה; לאחר פרק זמן קבוע, למשל שמונה שניות, הסר את המבחנה והוסף במהירות 50 µL מהדילול הנמוך ביותר של המעורר לדגימה.טענו מחדש את המבחנה באופן מיידי והמשיכו ברכישת הנתונים. עם סיום סדרת המיהולים, שטפו את מחט הציטומטר עם R-P-M-I-H-S-A טרי לפני מדידת סדרה חדשה. לאחר הרצת הדגימה האחרונה, נתחו את הנתונים באמצעות תוכנה לניתוח ציטומטריה של זרימה כדי לבחון את ביטוי ה-GFP הבקטריאלי.לאחר הפגוציטוזה של PMN, גדלו בן לילה במצע נוזלי זן של S ous המכיל את מבנה הדוח (reporter construct) הרלוונטי; הסירו GFP שהובע במהלך תרבית הלילה על ידי דילול התאים ל-OD 6 60 0 0.01. גדלו את התרבית עד ל-OD 6 60 0.1. דללו את התאים ביחס של 1 ל-30, ולאחר מכן עקבו אחר הגדילה עד שהתרבית תגיע שוב ל-OD six 60 של 0.1.לאחר מכן, אספו את החיידקים באמצעות סרימרגציה. שטפו את התאים פעם אחת ב-DPBS והשעיו אותם מחדש. השעיו את התרבית.הוסיפו פי 1 עד 10 מהנפח המקורי כדי להגיע ל-OD₆₀₀ של 1.0 או לכ-5×10⁸ CFU למיליליטר. כעת ערבבו את החיידקים עם ה-PNS שבודד טרי ב-RPMI-HSA ביחס של 10 ל-1. לאחר מכן הוסיפו סרום אנושי מאוחד כך שיהווה 1/10 מהנפח הסופי של תמיסת התאים.עוררו פגוציטוזה על ידי ניעור תערובת התאים למשך 10 דקות ב-37 °C. לאחר מכן, דללו את ה-PMNs הטעונים בחיידקים לריכוז של 5 × 10⁵ תאים למילליליטר, והעבירו 250 µL מהתאים לכל באער של כיסוי זכוכית בעל שמונה תאים. לבסוף, דמיינו את התאים באמצעות מיקרוסקופ הפוך המצויד בעדשה אובייקטיבית 40x ומוגנה בתא סביבה חשוך, ורכשו תמונות ממספר מיקומים בתאי כיסוי הזכוכית בכל 5 עד 10 דקות, הן בערוץ השדה המואר (bright field) והן בערוץ ה-GFP, כדי לעקוב אחר ייצור ה-GFP החיידקי בזמן אמת; הדגרת נויטרופילים עם סדרת ריכוזים של PSM α3 סינתטי גורמת להפעלה מהירה של התאים התלויה במינון, כפי שנמדד על ידי זרימת סידן.דגירה מוקדמת של הפפטיד PSM alpha three עם 0.01%, 0.1% או 1% Human serum עיכבה באופן משמעותי את יכולתו של הגירוי לעורר תגובת סידן. שוב, הדבר קרה בצורה התלויה במינון בריכוז של 1% serum. בקושי ניתן להבחין בהפעלה בריכוזים אלו של PSM alpha three.בתמונות אלו מוצגים שני נויטרופילים המכילים חיידקים שעברו פגוציטוזה, המכילים מבנה דגלי GFP של PSM alpha. החיידקים מתחילים להפגין פלואורסצנציה כשעה לאחר הפגוציטוזה, מה שמעיד על ביטוי של GFP מהפרומוטור של PSM Alpha. חיידקים מחוץ לנויטרופילים אינם פולטים פלואורסצנציה, דבר המצביע על כך שביטוי PSM alpha מופעל במהירות רק כאשר החיידקים עוברים פגוציטוזה.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשתמש תמיד בנייטרופילים טריים כדי להשיג תוצאות אופטימליות. לאחר צפייה בסרטון זה, אני מקווה שקיבלתם הבנה טובה על האופן שבו מודדים זרימת סידן באמצעות ציטומטריה של זרימה, וכיצד מודדים ביטוי של גנים חיידקיים בתוך תאים אוקריוטים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

studying-interactions-staphylococcus-aureus-with-neutrophils-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מאמר זה מתאר 1 נוהל בידוד לתאי אנדותל אנושיים מן הוורידים הטבור ולאחר מכן מראה כיצד להשתמש בתאים אלו כדי לבחון גלגול נויטרופילים בתנאי זרימה. באמצעות תא בנפח נמוך זרימת עשוי פולימר עם מאפיינים אופטיים של הזכוכית, חי תאים הדמיה הניאון של אוכלוסיות תאים נדירות הוא גם אפשרי.

בידודו של האדם וריד טבורי תאים אנדותל והשימוש בהם לחקר גלגול נשמות נויטרופילים בתנאי זרימה

Source: Barbero, A. M., et al. Fluorescence Assays for the Study of Mycobacterium tuberculosis Interaction with the Immune Receptor SLAMF1. J. Vis. Exp. (2025)This video demonstrates the procedure for labeling host immune receptors that bind bacterial surface antigens, enabling their detection through flow cytometry.

Analysis of Macrophage Receptor Interactions with Pathogenic Bacteria Using Flow Cytometry

סרטון זה מדגים בדיקת מבחנה לחקר אינטראקציה בין נויטרופילים לביופילם. החיידקים הפתוגניים המשובצים בביופילם ובנויטרופילים המבודדים סומנו באמצעות תוויות פלואורסצנטיות, והתגובה החיסונית של הנויטרופילים והתחמקות התגובה החיסונית על ידי החיידקים הוערכו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

בדיקת מבחנה לחקר האינטראקציה בין נויטרופילים וביופילם

הסרטון מדגים שיטה לחקר ההשפעה של תאי סטרומה על גיוס לויקוציטים. במודל מקביל של תא זרימת לוחות, ציטוקינים מעודדי דלקת גורמים לביטוי קולטני הידבקות על ידי תאי אנדותל, מה שמקל על גיוס נויטרופילים ונדידה. ההצלבה בין תאי סטרומה לתאי אנדותל מפחיתה את גיוס הנויטרופילים לתאי האנדותל.

מחקר זרימה חוץ גופית של השפעת תאי סטרומה על גיוס לויקוציטים

כדוריות דם לבנות לחצות את monolayer אנדותל באמצעות paracellular או מסלול transcellular. פיתחנו assay פשוט כדי לעקוב אחר חלוקת junctional אנדוגני VE-cadherin וPECAM-1 במהלך נדידת transendothelial יקוציט תחת זרימה פיזיולוגית להפלות בין שני מסלולי הגלגול.

הדמיה בזמן אמת של תאי תאי צומת האנדותל במהלך נויטרופילים גלגול תחת פיזיולוגית זרימה

היכולת של האנדותל מודלק לגייס leukocytes מזרימה מוסדרת על ידי תאי סטרומה mesenchymal. אנו מתארים שני מודלים במבחנה בשילוב תאים אנושיים עיקריים שיכול לשמש כדי להעריך גיוס נויטרופילים מזרימה ולבחון את התפקיד שתאי סטרומה mesenchymal לשחק בויסות התהליך הזה.

ניתוח ההשפעות של תאי סטרומה על הגיוס של לויקוציטים מתזרים

מחקר זה מתאר את הניטור המיקרוסקופית של הדבקות הפנקוקוס על מחרוזות וויללרנד של פון וילבלאנד המיוצר על פני השטח של תאים אנושיים מובחנים ראשוניים תחת לחץ הטיה בתנאי זרימה מוגדרים. פרוטוקול זה יכול להיות מורחב להדמיה מפורטת של מבני תאים ספציפיים וכימות חיידקים על ידי החלת הליכי חיסוני דיפרנציאלי.

זיהום פנאומטי של תאים אנושיים ראשוניים של האדם בזרימה קבועה

פרוטוקול הדמיה זה של תאים חיידקיים חיים מאפשר הדמיה של אינטראקציות בין מינים חיידקיים מרובים ברמת תא יחיד לאורך זמן. הדמיה של זמן-לשגות מאפשרת להתבוננות של כל מין חיידקי במונוקולטורה או coculture לחקור אינטראקציות בין מינים בקהילות חיידקים מרובי מינים, כולל תנוענות תאים בודדים וכדאיות.

הדמיה קינטית של אינטראקציות חיידקים בין-מינים חד-תאיים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את המחקר של אינטראקציות נויטרופיל-ביופילם. ביופילמים של Staphylococcus aureus מבוססים במבחנה ודוגרים עם נויטרופילים אנושיים שמקורם בדם היקפי. תגובת פרץ החמצון של נויטרופילים ניתנת לכימות, ולוקליזציה של הנויטרופילים בתוך הביופילם נקבעת על ידי מיקרוסקופיה.

בדיקות סטנדרטיות במבחנה כדי להמחיש ולכמת אינטראקציות בין נויטרופילים אנושיים לבין סטפילוקוקוס אאורוס ביופילמים

פרוטוקול זה מתאר גישה כמותית למדידת צבירה עצמית מיקרוביאלית באמצעות ציטומטריית זרימת הדמיה.

ציטומטריית זרימה של הדמיה לחקר צבירה עצמית מיקרוביאלית

בכתב יד זה, אנו מספקים פרוטוקול מקיף להערכת הישרדות אנטיביוטיקה עבור Pseudomonas aeruginosa ו - Staphylococcus aureus, הפיכת פלסמידים ל - P. aeruginosa ו- S. aureus כדי ליצור זני כתב ולדמיין וריאנטים פנוטיפיים, כגון מתמידים, על ידי מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי בהילוך מהיר.

הדמיית מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי בהילוך מהיר של Pseudomonas aeruginosa ו - Staphylococcus aureus פנוטיפים הטרוגניים

חקור את השפעת חלבוני PSM מ-Staphylococcus aureus על נויטרופילים אנושיים באמצעות ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופיית פלואורסצניה. שיטה זו מאפשרת ניטור הפעלת תאי חיסון ותיעוד בליעת חיידקים בזמן אמת.

חקר אינטראקציות של

גלה סרטונים נוספים