אלקטרו הקלטה בו זמנית ובסידן הדמיה של suprachiasmatic גרעין נוירונים
8 בדצמבר 2013
מתוארים נהלים לביצוע הקלטות בו זמנית של פוטנציאל הממברנה או זרם ושינויים בריכוז הסידן התוך תאי. נוירוני גרעין סופרכיאזמטיים ממולאים במחוון הסידן ביס-פורה-2 באמצעות אלקטרודת מהדק טלאי בכל תצורת מהדק התיקון של התא.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון את האינטראקציה בין שינויים במתח או בזרם, כגון שינויים בפעולה, תדירות ירי פוטנציאלית וריכוז הסידן התוך תאי בנוירונים של גרעין על-תאי. זה מושג על ידי הכנת פרוסת המוח לרישום נוירונים של גרעין SMA באמצעות מיקרו-אלקטרודה מלאה בבדיקה הרגישה לסידן. כשלב שני, המיקרו אלקטרודה אטומה בקרום העצבי.
לאחר מכן, הממברנה העצבית האטומה במיקרו אלקטרודה נקרעת כדי להכניס את בדיקת הסידן הפלואורסצנטית לנוירונים בודדים וכדי להקליט יחד עם הממברנה מתקבלות תוצאות המציגות מדידות של מתח או זרם ותמונות של פלואורסצנציה של בדיקת סידן בשני אורכי גל שינוי ביחס הקרינה באורכי גל אלה משקף את השינוי של הסידן התוך-תאי בתוך הנוירון. ניתן לבצע ניתוח לאחר מכן כדי לקבוע את ריכוז הסידן של התא. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן למדוד בו זמנית את השינויים בפעילות החשמלית של הממברנה ובסידן התוך-תאי המיוצר על ידי הפעלה סינפטית בתאי עצב בודדים של גרעין על-קוסמטי.
מי שידגים את הטכניקה הזו יהיה עמיתי ד"ר רוברט אירווין. התחל בהליך זה על ידי הנחת מוח החולדה על נייר סינון עגול שהורטב בתמיסת חיתוך על צלחת פטרי מזכוכית, נח על קרח, חתך את עטרת המוח רק כדי להסיר את המוח הקטן וגזע המוח, וחתוך חלקים מהצד הימני והשמאלי של קליפת המוח, השארת גוש מוח המכיל את ההיפותלמוס ושימור זהיר של הצד הגחוני של המוח המכיל את עצבי הראייה SCN וכיאזמה אופטית. לאחר מכן, מורחים שכבה דקה של דבק אקרילי סנו, גדול מספיק כדי לחבר את המוח ואת גושי הארוס בתא חיתוך מיקרוטום קר כקרח.
העבירו את בלוק המוח הקר כקרח כלפי מטה על הדבק כאשר הצד המכיל את ה-SCN ממוקם לחיתוך ראשון ועצבי הראייה היוצרים V המצביע כלפי מעלה מניחים את גושי ה-aros בשלושה צדדים אחרים. לאחר מכן מלאו את החדר במאגר חיתוך קר כקרח, ומבעבעים ברציפות עם קרבוגן. הדבק האקרילי של סנו יתמצק בלחות ומחזיק את המוח ואת בלוקי הארוס במקומם.
לאחר מכן חותכים את פרוסות ההיפותלמוס העטרה המכילות את ה-SCN בעובי של 220 עד 250 מיקרון. שימו לב שבלוק הארוס השמאלי התנתק במהלך החיתוך. זה יכול לקרות אם מורחים דבק לא מספיק.
לאחר מכן, זהה את הפרוסה המכילה את ה-SCN. בדרך כלל, פרוסה נבחרת כאשר הכיאזמה האופטית היא ברוחב של שניים עד ארבעה מילימטרים ונראית כמו פס לבן כאשר ה-SCN רק הגב מופיע כשני חריצים קטנים בכיאזמה האופטית משני צידי החדר השלישי. העבירו פרוסה לתא ההקלטה של 36 מעלות צלזיוס המותקן על במת המיקרוסקופ.
החדר מלא בתמיסת הקלטה זורמת ברציפות במהירות של שני מיליליטר לדקה. מאוורר עם 95% קרבוגן ומחומם מראש עם תנור חימום מוטבע. זהה את ה-SCN על ידי התבוננות בשני גרעיני ה-SCN השקופים משני צידי החדר השלישי, הגבי לכיאזמה האופטית שנראית כמו פס שחור כאשר היא מוארת על ידי אור מועבר.
כדי להכין את המיקרו אלקטרודה להקלטה, מלאו אותה בתמיסה הפנימית המכילה את בדיקת הסידן המסוננת במסנן מזרק של ארבעה מילימטר דרך צינור מיקרופיל. לאחר מכן הנח את המיקרו אלקטרודה לתוך מחזיק המיקרו אלקטרודה. לאחר מכן, הפעל כמות קטנה של לחץ חיובי רציף על האלקטרודה.
הורד את המיקרו אלקטרודה לתא ההקלטה בהנחיית תאורת אור אדום. לאחר מכן הנח את המיקרו אלקטרודה מעל ה-SCN באמצעות יעד הספק נמוך. לאחר מכן, העבר את המיקרוסקופ להגדלה בעוצמה גבוהה לבחירת תת-אזור של SCN ותא עצב SCN בודד.
המשך להפעיל לחץ חיובי עדין על המיקרו אלקטרודה כשהיא מתקדמת על פני התא. ברגע שהוא על פני השטח, הפעל לחץ שלילי עדין ליצירת אטימה עם התנגדות של שלושה עד 10 ג'יגה אוהם. לאחר מכן, התאם את מתח הממברנה למינוס 60 מילי-וולט.
לאחר מכן הפעל לחץ שלילי נוסף על האלקטרודה כדי לקרוע את קרום התא על מנת ליצור את כל הידוק תיקון התא. עם הכניסה למצב התא כולו, סומה והדנדריטים של נוירון SCN יתמלאו בבדיקה הפלואורסצנטית. מדוד את מתח הממברנה במצב מהדק זרם או את הזרם במצב מהדק מתח.
בזמן שנתוני תמונת בדיקת הסידן מנוטרים ומאוחסנים, ניתן לצפות בתמונות שנרכשו יחד עם גרף של נתוני פלואורסצנציה ביחס של 340 ננומטר ו-380 ננומטר. במהלך הניסוי, נעשה שימוש בכרונומטר מונו כדי להשיג את מדידות הסידן באופן כמותי על ידי חשיפה מהירה של ה-SCN לאור UV. ב-340 ננומטר ו-380 ננומטר, אור העירור עובר דרך מסנן אופטי UG 11 כדי להגביל אורכי גל הרמוניים מעל 400 ננומטר ומראה דיכרואית DCLP של 400 ננומטר מחזירה את האור על הרקמה.
האור הנפלט עובר דרך מסנן פליטה של 510 ננומטר ונלכד על ידי המצלמה. כדי לנתח את התוצאה, בחר אזור עניין מהתמונה הראשונית ואזור רקע להמרה ליחידות עוצמת פלואורסצנטיות יחסית. נתוני אזור העניין נראים בזמן אמת במהלך הניסוי.
הרקע משמש מאוחר יותר בניתוח הנתונים שלאחר מכן. הנה תמונת שדה בהירה של פרוסת עטרה של היפותלמוס המכילה את ה-SCN וכיאזמה אופטית. מיקרו אלקטרודה מזכוכית מלאה בתמיסה פנימית המכילה BISRA two אטומה על נוירון יחיד.
מוצגות כאן תגובות הסידן לסדרה של 50 שלבי מתח שנרשמו מתא עצב SCN מהודק מתח. זרמי הנתרן המגודרים במתח עוכבו עם 0.5 מיקרו-מולרי TTX, וזוהי תמונת לכידת מסך של אזורי עניין סומטיים ודנדריטיים המתאימים לתגובות הסידן. אלו הן הדוגמאות לתגובות סידן למספר משתנה של שלבי מתח.
איור זה מציג את הרישום בו זמנית של מתח הממברנה והסידן התוך תאי. בתא עצב SCN, ניסוי המהדק הנוכחי בוצע בנוכחות 50 ריטוקסין מיקרו-מולרי. דה-פולריזציה קטנה של פוטנציאל הממברנה גרמה למספר התקפי פעולה, ירי פוטנציאלי עם עלייה מקבילה וירידה לאחר מכן של סידן תוך תאי.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין פרוסות מוח בריאות של גרעין על-קוסמטי, ולבצע ניסויים אלקטרופיזיולוגיים והדמיה בו זמנית. אל תשכח שעבודה עם אור אולטרה סגול עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת מגן עיניים מתאים בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוצדורות להקלטות סימולטניות של פוטנציאל ממברנה או זרם ושינויים בריכוז הסידן התוך-תאי בנוירונים של הגרעין על-כיאסמטי (suprachiasmatic nucleus). באמצעות אלקטרודת patch clamp, הנוירונים מומלאים במדד הסידן bis-fura-2 כדי לאפשר מדידות אלו.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- דימוי סידן
רקע
- הבנת הפעילות הנוירונלית היא קריטית למחקר בתחום מדעי המוח.
- יוני סידן ממלאים תפקיד משמעותי באותות נוירונליים.
- מדידה סימולטנית של פעילות חשמלית וריכוז סידן מספקת תובנות לגבי תפקוד נוירונלי.
- הגרעין על-הכיאסמטי (suprachiasmatic nucleus) חשוב למקצבים צירקדיים.
מטרת המחקר
- לבחון את האינטראקציה בין שינויים בפוטנציאל הממברנה לבין ריכוז הסידן התוך-תאי.
- לפתח שיטה להקלטות סימולטניות בנוירונים בודדים.
- להעמיק את ההבנה של השפעות הש activates סינפטיות על הפעילות הנוירונלית.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הכנת פרוסות מוח להקלטה.
- שימוש במיקרואלקטרודה מלאה בחומר בדיקה (probe) רגיש לסידן.
- איטום המיקרואלקטרודה עם ממברנת הנוירון.
- פריצת הממברנה להחדרת חומר הבדיקה לסידן ולהקלטת פעילות חשמלית.
תוצאות עיקריות
- התבצעו מדידות סימולטניות של מתח/זרם ושל פלואורסצנציית סידן.
- שינויים ביחסי הפלואורסצנציה העידו על שינויים ברמות הסידן התוך-תאיים.
- התוצאות הדגימו את היכולת למדוד השפעות של הפעלה סינפטית על נוירונים בודדים.
- הניתוח סיפק תובנות לגבי שינויים בריכוז הסידן בתוך הנוירון.
מסקנות
- טכניקה זו מאפשרת מחקר מפורט של פעילות נוירונלית ודינמיקת סידן.
- ניתן להשתמש בה כדי לחקור את תפקידו של הסידן בהעברה סינפטית.
- השיטה מעמיקה את הבנתנו לגבי התפקוד הנוירונלי בגרעין הסופרכיאסמטי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימות סימולטני של פעילות אלקטרופיזיולוגית ורמות סידן בתוך נוירונים של הגרעין הסופראכיאזמטיק (suprachiasmatic nucleus) מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של תיקוף מטרות לצמירי השעון הביולוגי, על ידי קישור עירור ממברנה לדינמיקה של איתות תוך-תאי. גישה זו תומכת בביטחון חיזוי בשלבים מוקדמים של הגילוי, באמצעות כימות האופן שבו דפוסי פריקה של נוירונים מושפעים ממסלולים תלויי סידן המעורבים בוויסות הקצב. השיטה מספקת מערכת רלוונטית למחלה לסריקת תרכובים המשפיעים על ביטוי גנים של השעון הביולוגי באמצעות קריאות בזמן אמת של שני פרמטרים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי קורלציה בין פריקת פוטנציאל פעולה לבין תנודות סידן בנוירונים של ה-SCN.
- ערך תפעולי: מאפשר הפחתת סיכונים ביולוגיים של מטרות צירקודיאניות באמצעות מדידה ישירה של הצימוד בין עירור להפרשה.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי כימות האופן שבו שינויים בפוטנציאל הממברנה מניעים את ביטוי הגנים של השעון התלוי בסידן.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנה של מערכות נוירונליות עוברות תיקוף לצורך סטנדרטיזציה של בדיקות המשך באמצעות דימות סידן רציומטרי.
- ערך תפעולי: אספקת פלטים כמותיים וניתנים לשחזור באמצעות מדידות של יחס פלואורסצנציה ב-340/380 nm.
- ערך של יכולת הרחבה: תמיכה בשימוש חוזר בפלטפורמה להערכת השפעות של תרכובות על עירור נוירונלי וזרימת סידן.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על הרלוונטיות למחלה באמצעות בחינה של מנגנוני השעון הצירקדי בגרעין קוצב מרכזי.
- ערך תפעולי: מבטיח רציפות תרגומית משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני באמצעות צימוד אלקטרופיזיולוגי-סידן שמור.
- הפחתת סיכונים: מספק בסיס להחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי זיהוי תרכובות המשבשות את האינטגרציה העצבית ב-SCN.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי מתן אפשרות לבחינת השערות לגבי מטרות צירקדיות באמצעות קריאות סימולטניות של מתח וסידן, ובכך היא תומכת בזיהוי מובילים (leads) באמצעות סריקה תפקודית של פעילות נוירונלית.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבירור נתיבים על ידי קישור הפעלה סינפטית לאיתות תלוי סידן בנוירונים של ה-SCN.
- סריקה: מאפשר מוכנות לבדיקה באמצעות הקלטות יציבות של שני פרמטרים בהכנות של פרוסות מוח.
- אנליטיקה: מספק מדדי סידן רציומטריים ומדדים אלקטרופיזיולוגיים המאפשרים השוואה כמותית של תגובות נוירונליות.
- מחקר תרגומי: מקשר להמשכיות פרה-קלינית על ידי מידול של ויסות צירקדי במעגל עצבי הרלוונטי למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס יכולת הניתנת לשימוש חוזר להערכת תרכובות כרונוביוטיות לאורך קמפיינים של גילוי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי בתיקוף המטרה באמצעות תובנה מכניסטית לגבי ויסות צירקדי תלוי סידן.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה וסבירות לשחזור באמצעות הדמיה רציומטרית ואלקטרופיזיולוגיה של patch clamp.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות go/no-go על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בבקרת המסלול הצירקדי.
- השפעה על פורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכון המבוסס על השפעות פונקציונליות על אינטגרציה נוירונלית ב-SCN ודינמיקה של גני השעון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באלקטרופיזיולוגיה בשיטת patch clamp ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- תלוי במיכשור לסינון עירור ופליטה באורך גל כפול.
- מחייב סטנדרטיזציה של טעינת אינדיקטור סידן וניתוח רציומטרי בין צוותים שונים.
- שיקולי התאמה כוללים סוגים שונים של תת-סוגי נוירונים וספציפיות של אזורי מוח.
- מגבלות מעשיות כוללות סיכוני קרינת UV ומגבלות חיוניות של הפרוסות במהלך הקלטות ממושכות.
