Name: אלקטרו הקלטה בו זמנית ובסידן הדמיה של suprachiasmatic גרעין נוירונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: למדו שיטה לאלקטרופיזיולוגיה ודמיית סידן בו זמנית בנוירוני גרעין suprachiasmatic. השיטה מאפשרת למדוד שינויים במתח ובסידן תוך תאי בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

העבודה מומנה על ידי מענק מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (GM096972).

1. הכנת פרוסות מוח היפותלמוסיות
<ol>
	<li>השג, מראש, אישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) לכל הליך הקשור לבעלי חיים. ההליכים בבעלי חיים המתוארים כאן עולים בקנה אחד עם הנחיות AVMA להמתת חסד של בעלי חיים 2013 ואושרו מראש על ידי IACUC של אוניברסיטת אורגון לבריאות ומדע.</li>
	<li>הכן 500 מ"ל ממאגר החיתוך ללא MgCl2 ו-CaCl2 (טבלה 1). מבעבעים את התמיסה עם 95% O2 ו-5% CO2 בטמפרטורת החדר ואז מוסיפים את MgCl2 ו-CaCl2 תוך כדי המשך אוורור. התאם את האוסמולריות ל -300 mOsm עם סוכרוז. האוסמולריות נמדדת באמצעות אוסמומטר לחץ אדים.</li>
	<li>הכן 1 ליטר של מדיית ההקלטה ללא MgCl2 ו-CaCl2 (טבלה 2). מבעבעים את התמיסה עם 95% O2 ו-5% CO2 ואז מוסיפים את MgCl2 ו-CaCl2 תוך כדי המשך אוורור. התאם את ה-pH ל-7.2-7.4 עם NaOH (10 N) ואת האוסמולריות ל-300 mOsm עם סוכרוז. התוספת של מאגר HEPES היא אופציונלית ושימשה לייצוב נוסף של ה-pH.</li>
	<li>ניתן לאחסן את פתרונות החיתוך וההקלטה במקרר מספר ימים לפני השימוש.</li>
	<li>מכינים 3% אגרוז ויוצקים לצלחת פטרי סטרילית (בעומק 6 מ"מ) ומקררים.</li>
	<li>חותכים שלוש קוביות אגרוז בערך 6 מ"מ x 6 מ"מ x 6 מ"מ</li>.
	<li>הרדמה עמוקה של חולדת ספראג-דולי בת ארבעה עד שמונה שבועות עם איזופלורן. בדיקת עומק ההרדמה. עומק ההרדמה נחשב מתאים כאשר אין רפלקס נסיגה של הגפה האחורית לאחר צביטה של כרית כף הרגל. לאחר הרדמה מתאימה, החולדה מורדמת על ידי עריפת ראש מהירה. </li>
	<li>הסר במהירות את המוח תוך הקפדה לחתוך תחילה את עצבי הראייה, והניח בתמיסת חיתוך קרה כקרח רוויה ב-5% CO2 ו-95% O2 והניח להתקרר למשך 2-3 דקות.</li>
	<li>חתוך את המוח. הניחו את המוח בעזרת מלקחיים על נייר סינון עגול לח (עם תמיסת חיתוך) המונח על צלחת פטרי מזכוכית המונחת על קרח.</li>
	<li>חתכו את המוח בצורה קורונלית כדי להסיר את המוח הקטן וגזע המוח שנותרו, ואז את קליפת המוח הרוסטרלית ואת הצדדים, כדי להשאיר גוש מוח המכיל את ההיפותלמוס תוך שמירה קפדנית על הצד המכיל SCN, עצבי ראייה וכיאזמה אופטית.</li>
	<li>מורחים שכבה דקה של דבק ציאנואקרילי גדול מספיק כדי לחבר את המוח ואת גושי האגרוז בתא חיתוך מיקרוטום קר כקרח אך יבש.</li>
	<li>העבירו את הצד הזנבי של גוש המוח הקר כקרח כלפי מטה אל הדבק כאשר הצד המכיל את ה-SCN ממוקם לחיתוך ראשון כאשר עצבי הראייה יוצרים "V" מצביע כלפי מעלה.</li>
	<li>מניחים את קוביות האגרוז בשלושת הצדדים האחרים. מלאו את החדר במאגר חיתוך קר כקרח מבעבע ברציפות עם 5% CO2 ו-95% O2. הדבק הציאנואקרילי יתמצק עם לחות המחזיקה את המוח ואת גושי האגרוז במקומם.</li>
	<li>חותכים פרוסות היפותלמוס עטרה (בעובי 220-250 מיקרומטר) המכילות את ה-SCN עם מיקרוטום הלהב הרוטט. בדרך כלל נבחרת פרוסה שבה הכיאזמה האופטית היא בקוטר של כ-2-4 מ"מ, והיא נראית כמו פס לבן עם SCN רק גבי שמופיע כשתי "חריצות" קטנות בכיאזמה האופטית משני צדי החדרהשלישי (איור 1A).</li>
	<li>הנח את הפרוסות בתא ההקלטה (36 מעלות צלזיוס) המותקן על הבמה של מיקרוסקופ Leica DMLFS. החדר מלא בתמיסת הקלטה זורמת ברציפות (2 מ"ל לדקה) מאווררת עם 95% O2 ו-5% CO2 ומחוממת מראש עם תנור חימום מוטבע.</li>
	<li>בצע מהדק תיקון של תא שלם והקלטות הדמיית סידן בתאי עצב SCN 0.5-8 שעות לאחר הכנת הפרוסה.</li>
</ol>
2. תיקון מהדק הקלטה
<ol>
	<li>הכן את תמיסת האלקטרודה (תוך-תאית) במחצית מנפח המים הסופי הכולל.</li>
	<li>התאם את התמיסה ל-pH 7.3 עם KOH (1 N).</li>
	<li>מוסיפים את יתרת המים. האוסמולריות הסופית של התמיסה צריכה להיות בטווח של 280-290 mOsm.</li>
	<li>העבירו את תמיסת האלקטרודה דרך מסנן של 0.2 מיקרומטר, הכניסו (0.5 מ"ל) לצינורות מיקרופוגה, ואחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הכן את תמיסת מלאי מלח ההקספוטלסיום bis-fura-2 (10 מ"מ) על ידי ערבוב של 1 מ"ג מלח הקספוטלוגים bis-fura-2 עם 99.29 מיקרוליטר של 0.2 מיקרומטר מים מסוננים.</li>
	<li>מכניסים לצינורות נפרדים (2-5 מיקרוליטר כל אחד) ומקפיאים (-20 מעלות צלזיוס).</li>
	<li>הפשירו כמות גדולה של תמיסה פנימית ואת הגשושית Ca2+ זמן קצר לפני השימוש. הוסף 2 מיקרוליטר מתמיסת מלאי ביס-פורה-2 ל-400 מיקרוליטר של התמיסה הפנימית לריכוז סידן סופי של 50 מיקרומטר. טריטואט בקצרה כדי לערבב את הפתרונות. ריכוז בדיקת הסידן (10-250 מיקרומטר) משתנה בהתאם לתכנון הניסוי ולמערכת ההדמיה. שימו לב שביס-פורה-2 מורכב משתי מולקולות פורה-2 מקושרות.</li>
	<li>משוך אלקטרודות תיקון של תא שלם, בשני שלבים לקוטר קצה חיצוני של כ-1 מיקרומטר והתנגדות של 7-10 MΩ כאשר הם מלאים בתמיסה התוך-תאית.</li>
	<li>מלא מחדש את האלקטרודה בכמה מיקרוליטר מהתמיסה הפנימית המכילה את בדיקת הסידן המסוננת במסנן מזרק 4 מ"מ (0.2 מיקרומטר) לדגימות בנפח נמוך דרך צינור מיקרופיל.</li>
	<li>הפעל כמות קטנה של לחץ חיובי על האלקטרודה כשהיא מונחית לתוך תא ההקלטה תחת תאורת אור אדום תוך כדי צפייה על צג וידאו. </li>
	<li>הנח את המיקרו-אלקטרודה מעל ה-SCN באמצעות יעד הספק נמוך (4X). ה-SCN מזוהה כשני אזורים שקופים משני צידי החדר השלישי והגב לכיאזמה האופטית (איור 1A).</li>
	<li>העבר את המיקרוסקופ להגדלה בעוצמה גבוהה (40X או 63X). ניתן למקד תת-אזורים של ה-SCN ונוירוני SCN בודדים לרישום בהגדלה גבוהה יותר.</li>
	<li>הפעל לחץ חיובי עדין על המיקרואלקטרודה כשהיא מתקדמת על פני השטח של נוירון.</li>
	<li>הפעל לחץ שלילי עדין על המיקרו-אלקטרודה ליצירת אטימה עם התנגדות של 3-10 GΩ.</li>
	<li>כוונן את מתח הממברנה ל-60 mV עם המגבר הנשלט באמצעות תוכנת רכישה.</li>
	<li>הפעל לחץ שלילי נוסף על האלקטרודה כדי לקרוע את קרום התא למצב תא שלם.</li>
	<li>עם הכניסה למצב תא שלם, הנוירונים של SCN, סומה ודנדריטים מתמלאים בבדיקה פלואורסצנטית.</li>
	<li>מתח הממברנה נמדד במצב מהדק זרם או זרם במצב מהדק מתח בזמן שנתוני תמונת בדיקת הסידן מנוטרים ומאוחסנים (מתואר להלן). צפה בתמונות שנרכשו יחד עם גרף של נתוני פלואורסצנציה ביחס של 340 ננומטר/380 ננומטר במהלך הניסוי.</li>
</ol>
3. מדידת Ca2+ תוך-תאי
<ol>
	<li>מדידות Ca2+ כמותיות מתקבלות על ידי הקלטת זוג תמונות על ידי ריגוש מהיר של הרקמה עם אור UV ב-340 ננומטר ו-380 ננומטר באמצעות מונוכרונומטר עם רוחב פס של 10 ננומטר ומועברות דרך מסנן אופטי UG11 כדי להגביל אורכי גל הרמוניים מעל 400 ננומטר, 400 ננומטר DCLP דיכרואי ונפלט אור דרך מסנן פליטה של 510±40 ננומטר.</li>
	<li>התמונות נרכשות באמצעות מצלמת CCD מקוררת עם זמן רכישה ו-binning מותאמים כדי למזער את ההלבנה ולמקסם את מהירות ההקלטה.</li>
	<li>תוכנת הדמיה כמותית משמשת לרכישה והצגה של התמונות.</li>
	<li>בחר אזורי עניין מהתמונה הראשונית להמרה לנתוני יחידת עוצמת פלואורסצנטיות יחסית (כלומר סומה, דנדריט וכו'). בחרו גם אזור למדידת הקרינה ברקע (איור 1B).</li>
	<li>תמונות גולמיות ונתונים אופטיים כמותיים נשמרים ללא הרף במהלך הניסוי. לאחר הניסוי התמונות השמורות בדרך כלל מנותחות מחדש כאשר ניתן להקדיש זמן רב יותר לבחירה מדויקת יותר של אזורי העניין שיש לכמת.</li>
	<li>ניתן להציג את הנתונים כריכוז הסידן התוך תאי המשוער (Est[Ca2+]i). היחס (R) של האור הנפלט בעקבות עירור וחיסור רקע ב-340 ננומטר חלקי 380 ננומטר יחד עם הקרינה המקסימלית והמינימלית ב-340 ננומטר ו-380 ננומטר משמש לחישוב ריכוז הסידן4. חיסור רקע וחישובים אחרים מבוצעים באמצעות תוכנת ניתוח נתונים.</li>
	<li>ניתן לבצע קביעה במבחנה של פלואורסצנציה מקסימלית ומינימלית של ביס-פורה-2 באמצעות 10 מ"מ CaCl2 עבור Ca2+ קשור ו-10 מ"מ EGTA עבור תנאים חופשיים של Ca2+. קבוע הניתוק Ca2+, Kd של הגשושית נחשב ל-370 ננומטר עבור ביס-פורה-2 (Invitrogen).</li>
</ol>

<ol><li>Bading, H., Ginty, D. D., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+gene+expression+in+hippocampal+neurons+by+distinct+calcium+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of gene expression in hippocampal neurons by distinct calcium signaling pathways.</a> Science. 260, 181-186 (1993).</li>
<li>Ghosh, A., Ginty, D. D., Bading, H., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+regulation+of+gene+expression+in+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Calcium regulation of gene expression in neuronal cells.</a> J. Neurobiol. 25, 294-303 (1994).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high+resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).</li>
<li>Higley, M. J., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+dendrites+and+spines%3A+practical+and+functional+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in dendrites and spines: practical and functional considerations.</a> Neuron. 59, 902-913 (2008).</li>
<li>Colwell, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+modulation+of+calcium+levels+in+cells+in+the+suprachiasmatic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Circadian modulation of calcium levels in cells in the suprachiasmatic nucleus.</a> Eur. J. Neurosci. 12, 571-576 (2000).</li>
<li>Ikeda, M., Yoshioka, T., Allen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+circadian+changes+in+Ca2%2B+mobilization+mediated+by+GABAA+and+NMDA+receptors+in+the+suprachiasmatic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Developmental and circadian changes in Ca2+ mobilization mediated by GABAA and NMDA receptors in the suprachiasmatic nucleus.</a> Eur. J. Neurosci. 17, 58-70 (2003).</li>
<li>Irwin, R. P., Allen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+signaling+induces+divergent+neuronal+Ca2%2B+responses+in+the+suprachiasmatic+nucleus+network%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABAergic signaling induces divergent neuronal Ca2+ responses in the suprachiasmatic nucleus network.</a> Eur. J. Neurosci. 30, 1462-1475 (2009).</li>
<li>Berson, D. M., Dunn, F. A., Takao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+by+retinal+ganglion+cells+that+set+the+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phototransduction by retinal ganglion cells that set the circadian clock.</a> Science. 295, 1070-1073 (2002).</li>
<li>Hattar, S., Liao, H. W., Takao, M., Berson, D. M., Yau, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin-containing+retinal+ganglion+cells%3A+architecture%2C+projections%2C+and+intrinsic+photosensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Melanopsin-containing retinal ganglion cells: architecture, projections, and intrinsic photosensitivity.</a> Science. 295, 1065-1070 (2002).</li>
<li>Hartwick, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Evoked+Calcium+Responses+of+Isolated+Melanopsin-Expressing+Retinal+Ganglion+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Light-Evoked Calcium Responses of Isolated Melanopsin-Expressing Retinal Ganglion Cells.</a> J. Neurosci. 27, 13468-13480 (2007).</li>
<li>Castel, M., Belenky, M., Cohen, S., Ottersen, O. P., Storm-Mathisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate-like+immunoreactivity+in+retinal+terminals+of+the+mouse+suprachiasmatic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate-like immunoreactivity in retinal terminals of the mouse suprachiasmatic nucleus.</a> Eur. J. Neurosci. 5, 368-381 (1993).</li>
<li>Card, J. P., Moore, R. Y. The organization of visual circuits influencing the circadian activity of the suprachiasmatic nucleus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCard%2C+JP+%22In+Suprachiasmatic+Nucleus+-+The+Mind%27s+Clock%22">In Suprachiasmatic Nucleus - The Mind's Clock</a>. Reppert, S. M., Klein, D. C., Moore, R. Y. , Oxford University Press. Oxford. 51-76 (1991).</li>
<li>Shigeyoshi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+resetting+of+a+mammalian+circadian+clock+is+associated+with+rapid+induction+of+the+mPer1+transcript%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Light-induced resetting of a mammalian circadian clock is associated with rapid induction of the mPer1 transcript.</a> Cell. 91, 1043-1053 (1997).</li>
<li>Albrecht, U., Sun, Z. S., Eichele, G., Lee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differential+response+of+two+putative+mammalian+circadian+regulators%2C+mper1+and+mper2%2C+to+light%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A differential response of two putative mammalian circadian regulators, mper1 and mper2, to light.</a> Cell. 91, 1055-1064 (1997).</li>
<li>Yan, L., Silver, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+induction+and+localization+of+mPer1+and+mPer2+during+advancing+and+delaying+phase+shifts%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential induction and localization of mPer1 and mPer2 during advancing and delaying phase shifts.</a> Eur. J. Neurosci. 16, 1531-1540 (2002).</li>
<li>Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+the+mammalian+circadian+system%3A+Photic+entrainment%2C+circadian+pacemaker+mechanisms%2C+and+posttranslational+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetics of the mammalian circadian system: Photic entrainment, circadian pacemaker mechanisms, and posttranslational regulation.</a> Annu. Rev. Genet. 34, 533-562 (2000).</li>
<li>Ding, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resetting+the+biological+clock%3A+Mediation+of+nocturnal+circadian+shifts+by+glutamate+and+NO%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resetting the biological clock: Mediation of nocturnal circadian shifts by glutamate and NO.</a> Science. 266, 1713-1717 (1994).</li>
<li>Ding, J. M., Fairman, L. E., Hurst, W. J., Kuriashkina, L. R., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resetting+the+biological+clock%3A+mediation+of+nocturnal+CREB+phosphorylation+via+light%2C+glutamate%2C+and+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Resetting the biological clock: mediation of nocturnal CREB phosphorylation via light, glutamate, and nitric oxide.</a> J. Neurosci. 17, 667-675 (1997).</li>
<li>Ding, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neuronal+ryanodine+receptor+mediates+light-induced+phase+delays+of+the+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A neuronal ryanodine receptor mediates light-induced phase delays of the circadian clock.</a> Nature. 394, 381-384 (1998).</li>
<li>Bollmann, J. H., Helmchen, F., Borst, J. G., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+Ca2%2B+influx+mediated+by+three+different+pathways+during+synaptic+transmission+at+a+calyx-type+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic Ca2+ influx mediated by three different pathways during synaptic transmission at a calyx-type synapse.</a> J. Neurosci. 18, 10409-10419 (1998).</li>
<li>Irwin, R. P., Allen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Response+to+Retinohypothalamic+Tract+Synaptic+Transmission+in+Suprachiasmatic+Nucleus+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium Response to Retinohypothalamic Tract Synaptic Transmission in Suprachiasmatic Nucleus Neurons.</a> J. Neurosci. 27, 11748-11757 (2007).</li>
<li>Smetters, D., Majewska, A., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+action+potentials+in+neuronal+populations+with+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting action potentials in neuronal populations with calcium imaging.</a> Methods. 18, 215-221 (1999).</li>
<li>Spruston, N., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforated+patch-clamp+analysis+of+the+passive+membrane+properties+of+three+classes+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Perforated patch-clamp analysis of the passive membrane properties of three classes of hippocampal neurons.</a> J. Neurophysiol. 67, 508-528 (1992).</li>
<li>Horn, R., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+activation+of+ionic+currents+measured+by+a+new+whole-cell+recording+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method.</a> J. Gen. Physiol. 92, 145-159 (1988).</li>
<li>Marty, A., Neher, E. Tight-seal whole-cell recording. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarty%2C+A+%22Single-channel+recording%22">Single-channel recording</a>. Sakmann, B., Neher, E. 2, Plenum Press. New York. 31-52 (1995).</li>
<li>Sarantopoulos, C., McCallum, J. B., Kwok, W. M., Hogan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-escin+diminishes+voltage-gated+calcium+current+rundown+in+perforated+patch-clamp+recordings+from+rat+primary+afferent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Beta-escin diminishes voltage-gated calcium current rundown in perforated patch-clamp recordings from rat primary afferent neurons.</a> J. Neurosci. Methods. 139, 61-68 (2004).</li>
<li>Hatae, J., Fujishiro, N., Kawata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectroscopic+properties+of+fluorescence+dye+fura-2+with+various+divalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Jap.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Spectroscopic properties of fluorescence dye fura-2 with various divalent cations.</a> Jap. J. Physiol. 46, 423-429 (1996).</li>
<li>Poenie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+intracellular+Fura-2+fluorescence+by+viscosity%3A+a+simple+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Alteration of intracellular Fura-2 fluorescence by viscosity: a simple correction.</a> Cell Calcium. 11, 85-91 (1990).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

השיטות שתוארו לעיל מספקות כלי רב עוצמה לרישום בו זמנית של הקשר בין הפעילות החשמלית של קרום הנוירונים לריכוז הסידן התוך תאי. לשיטה מספר חוזקות בכך שהיא משלבת שתי שיטות מאופיינות היטב - הקלטת מהדק תיקון תא שלם ומדידת סידן תוך תאי באמצעות צבעים פלואורסצנטיים. הגישה שלנו דומה לאלה שתוארו על ידי חוקרים אחרים6,23.
יש לקחת בחשבון מספר פריטים בעת השימוש בשיטה. הראשון הוא השימוש בכל תצורת תיקון התא, מה שמוביל לדיאליזה של התוכן הסלולרי עם תמיסת המיקרואלקטרודה התוך-תאית. הדיאליזה יכ...

ידוע ששינויים בביטוי גנים מתרחשים בתאי עצב כתוצאה מהאיתות הסינפטי. איתות על ידי המוליך העצבי המעורר גלוטמט יכול לדה-פולריזציה של פוטנציאל הממברנה העצבית ולהוביל בסופו של דבר לשעתוק ותרגום גנים1,2. הפעלת קולטנים יונוטרופיים על ידי גלוטמט מאפשרת ליוני סידן חוץ-תאיים להיכנס לתא, אשר נחשב כממלא תפקיד קריטי כשליח שני בהפעלת שעתוק גנים. הערכת הקשר בין פעילות חשמלית של הממברנה, כגון תדירות ירי פוטנציאלית פעולה, ושינויים בריכוז הסידן התוך תאי דורשת שילוב של שתי שיטות - הידוק טלאי תא שלם והדמיה כמותית של בדיקות סידן פלואורסצנטיות3-5, מה שמאפשר לחקור את הקשר בנוירונים בודדים. טכניקת ההקלטה של תא בודד מאפשרת להקליט את הפעילות של נוירונים בודדים בחלקים הניתנים לזיהוי של המוח. טכניקת הקלטת התא השלמה מאפשרת לשלוט במתח או בזרם הממברנה ומאפשרת מניפולציה ניסיונית של זרמי תעלת יונים ספציפיים. שימוש במיקרופיפטות מלאות בבדיקות סידן פלואורסצנטיות מבטיח גם שהנוירון מלא היטב בבדיקת סידן. לטכניקה זו יש יתרון ברור בעבודה עם תכשירי פרוסות מוח מתכשירי פרוסות בוגרים, מכיוון שקשה במיוחד לטעון נוירונים אלה באמצעות בדיקות פרמונדסצנטיות נפוצות יותר של תאים ומפחיתים בעיות פלואורסצנטיות פוטנציאליותברקע 6-8.
אור הוא הדרך העיקרית שבה יונקים מכוונים את השעון הביולוגי שלהם, הממוקם בגרעין ההיפותלמי הסופרכיאזמטי (SCN). מידע אור המועבר ברשתית מועבר 9-11 דרך מערכת הרטינו-היפותלמוס (RHT) שם משתחרר גלוטמט ב-SCN12,13. גלוטמט פותח קולטנים יונוטרופיים NMDA ו-AMPA הממוקמים על נוירוני SCN המייצרים זרם של סידן ונתרן, ויוזמים מפל איתות תוך-תאי שמוביל בסופו של דבר לשינוי הביטוי של משפחה של גני שעון14-17 ושינויים בפאזה של השעון הביולוגי18-20. עם זאת, סידן יכול להיכנס לתאי עצב ישירות דרך קולטני גלוטמט יונוטרופיים או דרך דה-פולריזציה של הממברנה והפעלה של תעלות סידן תלויות מתח (VDCC)21. לכן פיתחנו פרוטוקול ניסיוני כדי לחקור את הקשר בין ריכוז הסידן התוך-תאי לפעילות החשמלית של הממברנה בתאי עצב SCN, כמו שקורה עם ירי פוטנציאלי פעולה ומקלט סינפטי22.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>פישר סיינטיפיק ושות'</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>פישר סיינטיפיק ושות'</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&bull; H2O</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>S-9638</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&bull; 6H2O</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&bull; 2H2O</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>D-גלוקוז</td><td>פישר סיינטיפיק ושות'</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>פישר סיינטיפיק ושות'</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן D-גלוקונאט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>אדנוזין 5&פריים;-טריפוספט מלח דיפוטסיום דיהידרט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>גואנוזין 5&פריים;-טריפוספט מלח טריס</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G9002</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז (אולטרה-טהור)</td><td>לייף טכנולוגיות</td><td>15510-027</td><td>ג'ל נקבוב לתוך צלחת פטרי סטרילית שכבה בעובי 6 מ"מ</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6310</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-5881</td><td></td></tr><tr><td>Bis-fura-2, מלח הקספוטגן</td><td>Invitrogen</td><td>B6810</td><td>תא Impermean</td></tr><tr><td>שם</td><td>הציוד מספר</td><td>קטלוגי</td><td>החברה תגובות</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td>חיתוך רקמות</td></tr><tr><td>דבק ציאנואקרילי (Roti-Coll1)</td><td>Carl Roth GmbH+Co</td><td>Art-Nr. 0258.1</td><td></td></tr><tr><td>חולץ מיקרואלקטרודות</td><td>Narshige International ארה"ב</td><td>PP-83</td><td></td></tr><tr><td>מיקרואלקטרודות צינורות נימיים</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופיל 34 גרם</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>מסנן מזרק</td><td>Corning</td><td>#431212</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>DM LFS</td><td>עם מטרות 4X, 40X UV ו-63X UV, ואפיפלואורסצנטי</td></tr><tr><td>מצלמת CCD</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA ER</td><td>12 סיביות CCD</td></tr><tr><td>Fura-2 קוביית מסנן</td><td>Chroma</td><td>71500A</td><td>סט עם מסנן UG11</td></tr><tr><td>פוליכרום IV</td><td>Till Photonics GmBH</td><td></td><td>מונוכרונומטר</td></tr><tr><td>משקפי בטיחות חוסמים אולטרה סגול</td> מוצרים <td></td><td></td><td>אולטרה סגולים</td></tr><tr><td>מגבר EPC-9</td><td>HEKA Eletronik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metafluor</td> מכשירים <td></td><td>מולקולריים</td><td>תוכנת הדמיה</td></tr><tr><td>Patchmaster</td><td>HEKA Eletronik</td><td></td><td>תוכנת רכישת נתונים</td></tr><tr><td>איגור גרסה 6</td><td></td><td></td> גל <td>אלקטרופיזיולוגיה & Ca2+ ניתוח נתונים</td></tr><tr><td>VAPRO 5520</td><td>Westcor</td><td></td><td>אוסמומטר לחץ אדים</td></tr></tbody></table>

אלקטרו הקלטה בו זמנית ובסידן הדמיה של suprachiasmatic גרעין נוירונים

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

נעשה שימוש בשיטות הקלטת הדמיה אלקטרופיזיולוגיות ופלואורסצנטיות סימולטניות כדי לחקור את תפקידם של שינויים בפוטנציאל או בזרם הממברנה בוויסות ריכוז הסידן התוך תאי. תנאים סביבתיים משתנים, כגון מחזור האור-חושך, יכולים לשנות את פעילות הרשת העצבית והעצבית ואת הביטוי של משפחה של גנים של שעון ביולוגי בתוך הגרעין הסופרכיאזמטי (SCN), מיקומו של השעון הביולוגי הראשי במוח היונקים. העברה סינפטית מעוררת מובילה לעלייה בריכוז Ca2+ הפוסט-סינפטי שמאמינים כי הוא מפעיל את מסלולי האיתות שמשנים את הביטוי הקצבי של גנים של שעון ביולוגי. פרוסות היפותלמוס המכילות את ה-SCN הוצמדו באמצעות מיקרו-אלקטרודות מלאות בתמיסה פנימית המכילה את מחוון הסידן ביס-פורה-2. לאחר שנוצר אטימה בין המיקרואלקטרודה לממברנה העצבית SCN, הממברנה נקרעה באמצעות יניקה עדינה ובדיקת הסידן התפזרה לתוך הנוירון ומילאה גם את הסומה וגם את הדנדריטים. מדידות רציומטריות כמותיות של ריכוז הסידן התוך-תאי נרשמו במקביל לפוטנציאל או זרם הממברנה. באמצעות שיטות אלה ניתן לחקור את תפקידם של שינויים בריכוז הסידן התוך תאי המיוצר על ידי פעילות סינפטית וירי פוטנציאלי פעולה של נוירונים בודדים. במצגת זו אנו מדגימים את השיטות לרישום בו זמנית של פעילות אלקטרופיזיולוגית יחד עם סידן תוך תאי מנוירונים בודדים של SCN הנשמרים בפרוסות מוח.

באמצעות פרוסות מוח מההיפותלמוס, ביצענו רישום סימולטני של שינויים בסידן תוך-תאי במצב whole cell תחת תנאי voltage clamp ו-current clamp. המיקרו-אלקטרודה המוצגת ב-Figure 1A מורדת למיקומה תחת הגדלה גבוהה (עדשות UV של 40X או 63X) תוך הפעלת לחץ חיובי קטן. לאחר מגע עם הנוירון, נוצר seal של gigaohm באמצעות שאיבה עדינה. במצב voltage-clamp, לאחר קביעת פוטנציאל ממבব্রত התא ל-60- mV, שאיבה נוספת שוברת את הממבברת ויוצרת את תצורת ה-whole cell. ניתן לראות על המסך כי הנוירון מתמלא במהירות בסימן (probe). ניתן להדמיא שלוח...

מתוארים נהלים לביצוע הקלטות בו זמנית של פוטנציאל הממברנה או זרם ושינויים בריכוז הסידן התוך תאי. נוירוני גרעין סופרכיאזמטיים ממולאים במחוון הסידן ביס-פורה-2 באמצעות אלקטרודת מהדק טלאי בכל תצורת מהדק התיקון של התא.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון את האינטראקציה בין שינויים במתח או בזרם, כגון שינויים בפעולה, תדירות ירי פוטנציאלית וריכוז הסידן התוך תאי בנוירונים של גרעין על-תאי. זה מושג על ידי הכנת פרוסת המוח לרישום נוירונים של גרעין SMA באמצעות מיקרו-אלקטרודה מלאה בבדיקה הרגישה לסידן. כשלב שני, המיקרו אלקטרודה אטומה בקרום העצבי.לאחר מכן, הממברנה העצבית האטומה במיקרו אלקטרודה נקרעת כדי להכניס את בדיקת הסידן הפלואורסצנטית לנוירונים בודדים וכדי להקליט יחד עם הממברנה מתקבלות תוצאות המציגות מדידות של מתח או זרם ותמונות של פלואורסצנציה של בדיקת סידן בשני אורכי גל שינוי ביחס הקרינה באורכי גל אלה משקף את השינוי של הסידן התוך-תאי בתוך הנוירון. ניתן לבצע ניתוח לאחר מכן כדי לקבוע את ריכוז הסידן של התא. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן למדוד בו זמנית את השינויים בפעילות החשמלית של הממברנה ובסידן התוך-תאי המיוצר על ידי הפעלה סינפטית בתאי עצב בודדים של גרעין על-קוסמטי.מי שידגים את הטכניקה הזו יהיה עמיתי ד"ר רוברט אירווין. התחל בהליך זה על ידי הנחת מוח החולדה על נייר סינון עגול שהורטב בתמיסת חיתוך על צלחת פטרי מזכוכית, נח על קרח, חתך את עטרת המוח רק כדי להסיר את המוח הקטן וגזע המוח, וחתוך חלקים מהצד הימני והשמאלי של קליפת המוח, השארת גוש מוח המכיל את ההיפותלמוס ושימור זהיר של הצד הגחוני של המוח המכי

simultaneous-electrophysiological-recording-calcium-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פיתחנו שיטת הדמיה בתהודה מגנטית תפקודית זמנית הקלטה אלקטרו במוח מכרסם, המספקת פלטפורמה חקירת הקשר בין הפעילות העצבית ואת רמת חמצון הדם תלוי אות (BOLD) MRI.

FMRI Electrophysiology סימולטני במוח מכרסמים

הבנת התפקוד של מערכת העצבים מרכזי החוליות דורשת הקלטות מנוירונים רבים בגלל תפקוד קליפת המוח מתעורר ברמה של אוכלוסיות של נוירונים. כאן אנו מתארים שיטה אופטית להקלטת פעילות עצבית suprathreshold עם רזולוצית תא בודד ויחיד ספייק, התלבטה סריקה בגישה אקראית. זה מסמל שיטה רשום סומטיות קרינת סיד מעד 100 נוירונים עם רזולוציה גבוהה זמנית. אלגוריתם מקסימאלי סבירות deconvolves הפעילות העצבית suprathreshold הבסיסית מאותות סיד הקרינה סומטיות. שיטה זו אמינה מזהה קוצים עם איתור יעיל גבוהים ושיעור נמוך של תוצאות...

הקלטה אופטית של פעילות עצבית suprathreshold עם רזולוצית תא בודד ויחיד ספייק

ההכנה של פרוסות חריפות מוח מhippocampi המבודד, כמו גם את ההקלטות אלקטרו סימולטני של האסטרוציטים ונוירונים...

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

אנו מתארים את ההכנה של פרוסות רשתית דקות ממימיות נמר סלמנדרות...

כל תא הקלטות בו זמנית מקולטני אור ועל נוירונים מסדר שני בהכנה פורסים רשתית אמפיבי

הקלטות ארוכות טווח תאיים בו זמנית משני neuropiles המוח שונה או שני קטעים אנטומיים שונים הוקמו בדבורי דבש. הקלטות אלה מאפשרות החקירה של היבטים זמניים של עיבוד עצבי על פני אזורים שונים במוח בנוירון הבודד, כמו גם ברמת ההרכב בבעלי חיים מתנהגים.

הקלטות ארוכות טווח בו זמנית בשני שלבים עצביים עיבוד במתנהגים דבורי דבש

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה עבור הקלטה בו זמנית של שותף מקומי אלקטרואנצפלוגרם (EEG) ו- multi-למינריות שדה מקומי פוטנציאל עכברוש anesthetized. חור burr בתלמידים הגולגולת עבור הכניסה של microelectrode מוצג לייצר עיוות זניח של האות EEG.

הקלטה בו זמנית של שותף מקומי אלקטרואנצפלוגרם ופוטנציאל שדה מקומי במכרסם

פרוטוקול זה מתאר את השימוש Ca2 + כתבים מקודדים גנטית כדי לרשום שינויים בפעילות העצבית מתנהג Caenorhabditis elegans תולעים.

סידן רציומטרי הדמיה של נוירונים בודדים ב מתנהג Caenorhabditis Elegans

מחקר זה מציג שיטה עבור ההקלטה סימולטני של שדה מקומי פוטנציאל המוח, electrocardiograms, electromyograms, ונשימה אותות של חולדה נעה בחופשיות. טכניקה זו, אשר מפחית את עלויות ניסיוני ומפשטת את ניתוח הנתונים, יתרום להבנה של אינטראקציות בין המוח לבין איברים היקפיים בגוף.

הקלטות סימולטני של פוטנציאל קורטיקלית שדה מקומי, רל, Electromyogram נושם קצב מעכברוש נעה בחופשיות

תותבות רשתית יש את היכולת ליצור תפיסות חזותיות. כדי לקדם את הפיתוח של תותבות חדשות, יש צורך בשיטות ex vivo כדי לבדוק מכשירים לפני ההשתלה. מאמר זה מספק פרוטוקול מקיף לחקר פעילות הסידן בשכבת תאי גנגליון הרשתית כאשר הוא נתון לגירוי חשמלי.

הדמיית סידן ברשתית שטוחה עם גירוי חשמלי

פרוטוקול זה מספק תיאור מקיף של שיטה לרישום סימולטני של אותות סידן מנוירונים ואסטרוציטים באזורים מוחיים רבים הקשורים לזיכרון ומדגים את יישומו במהלך פרדיגמת התנהגות למידה וזיכרון.

שיטת פוטומטריית סיבים דו-צבעונית לתיעוד פעילות אסטרוציטים-נוירונים באזורים שונים במוח במהלך התנהגויות למידה וזיכרון

למדו שיטה לאלקטרופיזיולוגיה ודמיית סידן בו זמנית בנוירוני גרעין suprachiasmatic. השיטה מאפשרת למדוד שינויים במתח ובסידן תוך תאי בזמן אמת.

אלקטרו הקלטה בו זמנית ובסידן הדמיה של suprachiasmatic גרעין נוירונים

גלה סרטונים נוספים