יחיד לטוס Assay עבור התנהגות שיחור מזון ב דרוזופילה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת שינויים התנהגותיים המופעלים על ידי מחסור במזון בזבוב הבוגר Salala Melanogaster. זה מושג על ידי זבובים מורעבים ראשונים במשך 18 עד 24 שעות. השלב השני הוא העמסת זבובים בודדים לתאי התנהגות, שכל אחד מהם מכיל מקור ריח אטרקטיבי במרכזו.

לאחר מכן, מערכת מחשב עם מצלמה דיגיטלית עוקבת אחר מיקומו של כל זבוב לאורך זמן ומתעדת. הקואורדינטות שלו לניתוח נתונים מאוחר יותר. השלב האחרון הוא לקבוע את זמן ההשהיה של כל זבוב כדי להגיע למקור הריח באמצעות תוכנה מותאמת אישית.

בסופו של דבר, ניתן להשתמש בבדיקת התנהגות חיפוש מזון בתפוקה גבוהה זו כדי לחקור את הקשר בין תפקוד המעגל העצבי לתגובות התנהגותיות. היתרון העיקרי של בדיקה זו על פני השיטה הקיימת, כמו חברי הצוות, הוא שהיא מכמתת התנהגות כימוטקטית בזבובים בודדים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות בנוירוביולוגיה כגון אילו מעגלים נוירולוגיים חשובים להתנהגות כימוטקטית וכיצד מעגלים נוירולוגיים אלה ממתנים על ידי המצב הפיזיולוגי הפנימי של החיה.

המטרה של שיטה זו היא להשיג מערכי נתונים גדולים של התנהגות בזמן קצר. למרות ששיטה זו נתנה לנו תובנות לגבי התנהגות ליקוט מזון, ניתן להשתמש בה גם כדי לחקור התנהגויות אחרות כגון ביצוע לוקליזציה. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית.

טיפול נכון בזבובים וביצוע תוכנת המחשב חיוניים להצלחת ניסוי זה. בדרך כלל, אדם חדש בשיטה זו עשוי להיאבק מעט בהתחלה מכיוון שלוקח קצת זמן וסבלנות ללמוד כיצד לטפל בזבובים בעדינות להדגים שההליך יעורר את המחט. להגיע לטכנאי למעבדה שלי לפני איסוף הזבובים.

החזר את זבובי הניסוי בתנאי טמפרטורה ולחות מבוקרים במחזור חושך בהיר של 12 שעות. ביום הפיצוץ של EEC, יש להרדים את הזבובים תחת פחמן דו חמצני לפני ביצוע יחסי מין תחת מיקרוסקופ. ניתן להשתמש במספר קריטריונים בסיסיים כדי להבדיל בין זכרים לנקבות.

לזכרים יש כתם של זיפים שחורים על ארבע רגליהם הנקראים מסרקי מין שאין לנקבות. כמו כן, קצה הבטן הזכרית מכוסה בציפורן כהה ואיברי מין מוצגים שאינם נראים אצל נקבות, אוספים נקבות זבובים ומניחים אותם יחד עם ארבעה עד חמישה זכרים לבני עיניים בקבצי מזון חדשים עם מקסימום 30 זבובים לגיל בקבוקון. הזבובים מכינים במשך יומיים עד חמישה ימים את התאים להרעבת זבובים על ידי דחיפה של רקמה בודדת לתחתית בקבוקון פלסטיק ריק, ומשרים לחלוטין את הטישו במים מזוקקים.

לאחר מכן השתמש בחפץ כדי לדחוף כלפי מטה את הטישו ולסחוט בעדינות את עודפי המים. הפוך את הבקבוקון כדי להשליך את המים העודפים. צריכים להיות מספיק מים כדי לשמור על לחות הזבובים ותא הרעב לח, אך לא מספיק כדי להטביע את הזבובים.

כ-18 עד 24 שעות לפני תחילת הניסוי, העבירו את הזבובים מבקבוקון המזון לתא הרעבה וסתמו את הבקבוקון. אחסן את הבקבוקונים בתנאי טמפרטורה ולחות מבוקרים למשך הלילה עד לתחילת הניסוי. הכן תמיסה אגרו של 1% על ידי הוספת 100 מיליגרם של טמפרטורת התכה נמוכה ל -10 מיליליטר מים מזוקקים.

בבקבוק זכוכית. מחממים את תמיסת האגרו במיקרוגל רק עד שהיא מתחילה לרתוח, אך לפני שהיא רותחת, עצרו את המיקרוגל וסובבו את הבקבוק פעם אחת. חזור על שלב זה פעמיים נוספות עד שהארוס נמס לחלוטין.

שמור על תמיסת Aros במצב נוזלי על ידי שמירה על חום הבקבוק על צלחת חמה. מוגדר על 50 מעלות צלזיוס, הוסף 990 מיקרוליטר מתמיסת 1% ארו ו -10 מיקרוליטר חומץ תפוחים לצינור DF הפוך של 1.5 מיליליטר. להכנת תמיסת חומץ תפוחים של 1%, מערבלים את התמיסה עד לערבוב לפני שמכניסים לאינקובטור אמבטיה יבש המכוון ל-50 מעלות צלזיוס, מכוונים את חדר הבדיקה לתנאים הרצויים כמו טמפרטורה ולחות.

הפעל את לוח ה-LED בגודל 660 ננומטר. שוטפים את המסננות וצלחות הבדיקה במים חמים ומחממים אותם בתנור ייבוש עד שכל הלחות מתאדה. קריר. המסננות והצלחות עד לטמפרטורת חדר הבדיקה.

לפני תחילת הניסויים, הניחו צלחת רדודה על גבי צלחת המפזר ומלאו אותה במים כדי להגביר את הלחות המקומית ולהסוות את המים בטיפת הארוס. לבסוף, מקם את המסננות מעל צלחת המים. לוחית הבדיקה עשויה אקריליק שקוף ומורכבת משש זירות בדיקה.

המחוון מכיל תאי החזקה המאפשרים העמסת זבובים, בלימה זמנית ושחרור בו זמנית של שישה זבובים לתאים שלהם. בתחילת הניסוי, שערות צולבות חרוטות במרכז כל זירה בצלחת מצביעות על כך שיש לזרוק ריחות. הכנס את המחוונים ללוחית הבדיקה האקרילית.

החלק בעדינות את השואב לתוך הבקבוקון מעבר לפקק הכותנה ואפשר לכשישה זבובים להיכנס לתוך השואב. זה קריטי להיות עדין ככל האפשר בטיפול בהם. אפשר לנצל את טקטיקת הצילום, התנהגות זבוב כדי לגרום לזבובים, ללכת לכיוון השואב על ידי הפניית פתח הבקבוקון לעבר מקור אור עמום.

במידת הצורך ניתן להפעיל יניקה עדינה כדי לשאוב כשש נקבות זבובים. הימנע מבחירת זבובים זכרים לבני עיניים. הכנס את קצה השואב לחור הראשון של לוחית הבדיקה.

אפשרו לזבוב בודד לעבור לתא ההחזקה וקדמו בעדינות את המחוון קדימה כדי לטעון זבוב נוסף לתוך החור הבא. ממשיכים עד שזבובים. תפוס את כל ששת תאי האחיזה של הצלחת.

לאחר מכן פיפטה חמישה מיקרוליטר של תמיסת אגרו חומץ תפוחים 1% ישירות על מרכז הכוונת בפנים הפנימיות של צלחת הבדיקה. כדי למרכז את לוחית הבדיקה, פתח את הקובץ בשם Positioning tool vi. הפעל את הקובץ על ידי לחיצה על החץ הלבן בפינה השמאלית העליונה של המסך.

הנח את לוחית הבדיקה על גבי האב כך שפתח הזירה פונה לרצפת ה-SIV ויעד הריח נמצא על תקרת הצלחת. יישר את שערות הצלב של לוחית הבדיקה עם האוויר הצולב על מסך הצג לאחר השלמת היישור. בטל את הביצוע על ידי לחיצה על הנקודה האדומה הממוקמת ליד הפינה השמאלית העליונה של הצג כדי לעקוב ולתעד את הקואורדינטות של הזבוב.

במהלך כל ניסיון חיפוש מזון, פתח את קובץ תוכנת הרכישה. מעקב אחר זבובים שש vi. הפעל את הקובץ על ידי לחיצה על החץ הלבן בפינה השמאלית העליונה של הצג.

הקצה שם לקובץ ולאחר מכן לחץ על אישור. קדם את המחוונים בתאי הבדיקה כדי לשחרר את הזבובים לזירות הבדיקה. היזהר לא להזיז את תאי הבדיקה מכיוון שהדבר יוביל לרישום לא נכון של הקואורדינטות.

לחץ על התחל וודא שמקור האור היחיד בתא הבדיקה הוא לוח ה-LED. בסיום הניסוי, הסר את המסננת ואת תא ההתנהגות. הרם את לוחית הבדיקה מהמסננת והסר את הזבובים על ידי טבילת הצלחת בקרח.

נקו בעדינות את הצלחת במים חמים והסירו כל פסולת אגרו. הכניסו את צלחות הבדיקה לתנור ייבוש כדי להסיר לחות. אווררו את אזור הבדיקה על ידי הפעלת מאוורר קטן למשך כשתי דקות.

כבה את המאוורר וטען את קבוצת הזבובים הבאה לצלחת הבדיקה הבאה. המשך לבצע ניתוח נתונים באמצעות תוכנה מותאמת אישית כמתואר בפרוטוקול הטקסט. תוכנת ניתוח הנתונים והפריסה משמשות להערכת ביצועיו של כל זבוב במהלך 10 דקות הניסוי שלו על פי סט של קריטריוני ניתוח.

קריטריונים אלה משמשים כדי לקבוע אם נתונים מכל זבוב ישמשו לניתוח נתונים ונועדו לחסל את אותם זבובים שאינם מסוגלים לבצע את משימת חיפוש המזון עקב פציעה, מחלה, מתח או חוסר מוטיבציה, זבובים שאינם פעילים יותר מ-300 שניות נחשבים לא פעילים ונדחים ממערך הנתונים אלא אם כן הם כבר הצליחו לאתר את מקור המזון או התצוגה. מהירות ממוצעת גדולה מ-10 מילימטרים לשנייה למשך 100 שניות לפחות לאחר התקופה הלא פעילה כדי לבחור רק את הזבובים שמציגים מהירויות בריאות בשלבים המוקדמים של ריח פעיל. חיפוש רק זבובים שנעים בטווח מסוים של מהירויות במשך 50 השניות הראשונות של הניסוי מתקבלים לניתוח נתונים זבובים שאינם עוברים את כל ארבעת הרבעים בזירה ופונים ישר למקור המזון לאחר תחילת הניסוי נדחים.

זבובים שמתרחקים ממקור המזון ברדיוס של 10 מילימטר למשך 50 שניות לפחות נחשבים כמי שמצאו בהצלחה את מקור המזון. ניתן להשתמש בעלילה המתארת את המרחק של הזבוב ממקור הריח לאורך זמן כדי להעריך את זירות המקרה הנדיר הזה עם חפצים גלויים במצב זבוב. גם עקבות נדחות.

חפצים יכולים להיווצר על ידי כל אירוע שבו תוכנת רכישת הנתונים מזהה אובייקט שאינו הזבוב. לעתים קרובות הם מופיעים כקווים ישרים ארוכים המשתרעים על פני הזירה או קורנים ממרכזה. זבובים בוגרים מורעבים 18 עד 24 שעות מפגינים רגישות גבוהה יותר לריחות הקשורים למזון מאשר עמיתיהם הניזונים.

תרשים גרפי של האחוז המצטבר של זבובים שמצליחים לאתר מקור ריח מזון מראה ש-30% מכל הזבובים המורעבים מצליחים בתוך חלון של 10 דקות. לעומת זאת, רק 7% מכלל הזבובים המוזנים עושים זאת. זבובים מורעבים צריכים להפגין משיכה גדולה יותר באופן משמעותי לחומץ מאשר לרכב אגרוס בלבד, וניתן להשתמש בתצפית זו כדי לפתור בעיות בתנאי הבדיקה.

לדוגמא, כאשר ניסוי חיפוש מזון זה שבוצע ב-32 מעלות צלזיוס עם לחות סביבתית של 35% באמצעות זבובי בר, לא התגלה הבדל משמעותי בין משיכת הזבובים לחומץ לבין בקרת הארוס, סביר להניח שהדבר נובע ממשיכה גוברת למים המצויים בטיפת האגרוס בטמפרטורות בדיקה חמות יותר. על ידי הגדלת לחות הבדיקה בין 50 ל-60% שינוי התנהגותי זה תוקן וההבדל המשמעותי בין המשיכה לחומץ לרכב האגרוס שוחזר. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו ב-12, כולל ניסוי ניסיוני של 10 דקות אם הוא מבוצע כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לטפל בזבובים בעדינות רבה כדי להימנע מפציעה או הפרעה להם. אנא זכרו כי צלחות הבדיקה והמסננות יכולות להיות חמות במיוחד בתנור הייבוש, ולכן יש להסירן בעת לבישת כפפות לתנור לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הנוירוביולוגיה לחקור התנהגויות כימוטקטיות.

ניתן להתאים טכניקה זו גם כדי לחקור את יכולתו של הזבוב לאתר אובייקטים ריחניים אחרים. לדוגמה, ניתן ליישם אותו לחקר התנהגות לוקליזציה של בני זוג בזבובים זכרים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להתכונן לניסוי, להתאים את תנאי הניסוי, להריץ את הניסוי ולנתח את הביצועים של כל זבוב, מה שבסופו של דבר יספק לך תרשים מצטבר המציג את אחוז הזבובים שאיתרו בהצלחה את מקור הריח.