Name: מדידה של סידן סהכ בנוירונים על ידי אלקטרונים רנטגן Microanalysis Probe (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-20T17:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: למד כיצד למדוד סידן סה"כ בנוירונים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים רנטגן וניתוח קריו. שיטה זו חושפת שינויים בריכוזי סידן שמכריעים לסיגנלים תוך-תאיים במיטוכונדריה נוירונליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לגב &#39;כריסטין א ינטרס לקבלת סיוע טכני מעולה. עבודה זו נתמכה על ידי התכנית למדעי המוח הבסיסית של תכנית NINDS המחקר העירונית, NIH (Z01 NS002610).

<ol><li>Aronova, M. A., Kim, Y. C., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+EFTEM+mapping+of+near+physiological+calcium+concentrations+in+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Quantitative EFTEM mapping of near physiological calcium concentrations in biological specimens.</a> Ultramicroscopy. 109, 201-212 (2009).</li>
<li>Aronova, M. A., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elemental+mapping+by+electron+energy+loss+spectroscopy+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Elemental mapping by electron energy loss spectroscopy in biology.</a> Methods Mol. Biol. 950, 209-226 (2013).</li>
<li>Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling and neurodegenerative diseases.</a> Trends Mol. Med. 15, 89-100 (2009).</li>
<li>Fernandez-Segura, E., Warley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+probe+X-ray+microanalysis+for+the+study+of+cell+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Electron probe X-ray microanalysis for the study of cell physiology.</a> Methods Cell Biol. 88, 19-43 (2008).</li>
<li>Gibson, G. E., Starkov, A., Blass, J. P., Ratan, R. R., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cause+and+consequence%3A+Mitochondrial+dysfunction+initiates+and+propagates+neuronal+dysfunction%2C+neuronal+death+and+behavioral+abnormalities+in+age-associated+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Cause and consequence: Mitochondrial dysfunction initiates and propagates neuronal dysfunction, neuronal death and behavioral abnormalities in age-associated neurodegenerative diseases.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 122-134 (2010).</li>
<li>Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+techniques+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Novel techniques in electron microscopy.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 14, 591-598 (2004).</li>
<li>LeFurgey, A., Bond, M., Ingram, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frontiers+in+electron+probe+microanalysis%3A+application+to+cell+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Frontiers in electron probe microanalysis: application to cell physiology.</a> Ultramicroscopy. 24, 185-219 (1988).</li>
<li>Newbury, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+X-ray+mapping%3A+X-ray+spectrum+imaging+above+100+kHz+output+count+rate+with+the+silicon+drift+detector%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">The new X-ray mapping: X-ray spectrum imaging above 100 kHz output count rate with the silicon drift detector.</a> Microsc. Microanal. 12, 26-35 (2006).</li>
<li>Pierson, J., Vos, M., McIntosh, J. R., Peters, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+electron+cryotomography+of+vitreous+cryo-sections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc%22%5BJournal%5D)">Perspectives on electron cryotomography of vitreous cryo-sections.</a> J. Electron Microsc. 60, S93-S100 (2011).</li>
<li>Pivovarova, N. B., Hongpaisan, J., Andrews, S. B., Friel, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depolarization-induced+mitochondrial+Ca+accumulation+in+sympathetic+neurons%3A+spatial+and+temporal+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Depolarization-induced mitochondrial Ca accumulation in sympathetic neurons: spatial and temporal characteristics.</a> J. Neurosci. 19, 6372-6384 (1999).</li>
<li>Pivovarova, N. B., Nguyen, H. V., Winters, C. A., Brantner, C. A., Smith, C. L., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitotoxic+calcium+overload+in+a+subpopulation+of+mitochondria+triggers+delayed+death+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons.</a> J. Neurosci. 24, 5611-5622 (2004).</li>
<li>Ritchie, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrum+simulation+in+DTSA-II%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Spectrum simulation in DTSA-II.</a> Microsc. Microanal. 15, 454-468 (2009).</li>
<li>Stanika, R. I., Winters, C. A., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+NMDA+receptor-dependent+calcium+loading+and+mitochondrial+dysfunction+in+CA1+vs.+CA3+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Differential NMDA receptor-dependent calcium loading and mitochondrial dysfunction in CA1 vs. CA3 hippocampal neurons.</a> Neurobiol. Dis. 37, 403-411 (2010).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+receptor+arrays+in+frozen-hydrated+sections+and+plunge-frozen+specimens+of+E.+coli+engineered+to+overproduce+the+hemotaxis+receptor+Tsr%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the hemotaxis receptor Tsr.</a> J. Microsc. 216, 76-83 (2004).</li>
</ol>

המחברים מדווחים על היעדר ניגוד עניינים.

שיטת האלקטרונים המבוסס על מיקרוסקופ האנליטיות שהוצגה כאן מאפשרת לגילוי, זיהוי והכימות של כמה אלמנטים של עניין ביולוגי, כוללים Na, K, P, ובמיוחד Ca. ניתן לבצע ניתוחים אלה יצאו בsubcellular, כלומר, תוך אברון, רזולוציה בשל היכולת לאתר ולזהות מבנים של עניין בתמונות באיכות גבוהה של cryosections הוכן מדגימות מוקפאות במהירות. שים לב שאין צורך בצביעה להקליט תמונות אלקטרונים דומות באיכות מבנית להכנות קבועות כמקובל, משובץ פלסטיק, אפילו בזמן שהמיקום של אלמנטי רקמה נשמר כמותית. <...

יוני סידן הוא ללא ספק ישות תא איתות החשובה והמגוונים ביותר בביולוגיה, ששיחק תפקיד חיוני בתהליכים נורמלים מגוון כמו שידור סינפטי וביטוי גנים. מצד השני, סידן חשוב באותה מידה במוות של תאים. בפרט, הסרת הפיקוח סידן הוא גורם מפתח בפגיעה עצבית בשבץ מוחי, פרקינסון, אלצהיימר ומחלות ניווניות אחרות 3,5. לכן, חשוב באופן קריטי להבנת כמותית כמה סידן מופץ בתוך תאים, ואיך זה משתנה בעקבות גירויים פיסיולוגיים או pathophysiological. מטרה זו היא מסובכת בשל העובדה כי סידן מופץ באופן דינמי בין שתי מדינות פיזיות - חופשיות בפתרון או קשורה למצע - וכי ריכוזי סידן תאי לשנות פני כמה סדרי הגודל כתוצאה מגירוי. אמנם יש מספר שיטות מתקדמות זמינות עבור הניתוח של free סידן תוך תאי, קביעת ריכוזי סידן הכולל בתאים תאיים מוגדרים מוגבלת באופן מציאותי לגישה אחת, כלומר, microanalysis אלקטרון הבדיקה (EPMA). EPMA היא טכניקה שזוגות ספקטרומטר X-ray למיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM). תותח האלקטרונים TEM מתמקד אלקטרון בדיקה נייחת, submicron באזור subcellular של ריבית וקרן ה-X האלמנט ספציפי הנפלטת כתוצאה מהפגזת אלקטרונים שנאספו ונותח (ראה אזכור 7, 4 לביקורות טכניות מפורטות). יתרונותיו של EPMA כוללים רזולוציה ברמת אברון אחת ורגישות submillimolar. בפועל, עם זאת, דורשת EPMA cryotechniques מיוחד ומכשור להכנת דגימה וניתוח. הנה, את הכלים, הטכניקות והמכשירים מתאימים למידות של סידן תוך שימוש בEPMA מתוארות. סידן הוא Intramitochondrial של i המיוחדתnterest על חשבון התפקיד הקריטי שמחזות עומס יתר סידן המיטוכונדריה במחלות ניווניות.

<table><tbody><tr><td colspan="4" ><חזק>ריאגנטים/חומרים</חזקים></td></tr><tr><td>Thermanox כיסויי פלסטיק</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>72280</td><td></td></tr><tr><td>מוסיף תרבית</td><td>BD Falcon</td><td>353090</td><td>לצלחות 6 בארות</td></tr><tr><td>Cryopins</td><td>Leica Microsystems</td><td>16701952</td><td></td></tr><tr><td>יישומי עץ</td> מחורץ <td>EM Sciences</td><td>72300</td><td></td></tr><tr><td>רשתות EM מתקפלות</td><td>טד פלה</td><td>4GC100/100</td><td>100 רשת</td></tr><tr><td>רדיד אינדיום</td><td>אלפא Aesar</td><td>13982</td><td>0.25 מ"מ עובי</td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>ציוד</חזק>צלילה</td></tr> <tr><td>מכשיר הקפאה</td><td>Leica Microsystems</td><td>KF-80</td><td></td></tr><tr><td>Slam מכשיר הקפאה</td><td>LifeCell</td><td>CF-100</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica Microsystems</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>Cryoattachment עבור microtome</td><td>Leica Microsystems</td><td>FC6</td><td></td></tr><tr><td>יהלום cryotrimming כלי</td><td>דיאטומת</td><td>Cryotrim 45</td><td></td></tr><tr><td>יהלום cryoknife</td><td>דיאטום</td><td>Cryo 35</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר אנטי סטטי</td><td>Diatome</td><td>Hauf קו</td><td></td>סטטי</tr><tr><td>Cryo מיקרוסקופ אלקטרונים</td><td>קרל זייס מיקרוסקופיה</td><td>EM912 אומגה</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק דגימת קריו EM</td><td>Gatan</td><td>CT3500</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת CCD בסריקה איטית, 2k x 2k</td><td>Troendle (TRS)</td> <td>תוכנה</td> לרכישת תמונה Sharpeye <td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus SIS</td><td>iTEM חבילת</td><td></td></tr><tr><td>גלאי רנטגן ED Oxford</td><td>Instruments</td><td>Linksystem מעבד דופק Pentafet</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Oxford Instruments</td><td>XP-3</td><td></td></tr><tr><td>PCI לוח אחורי כרטיס</td><td>4pi Systems</td><td>Spectral Engine II</td><td></td></tr><tr><td>מחשב שולחני</td><td>Apple</td><td>כל דגם</td><td></td>תואם OS9</tr><tr><td>תוכנת ניתוח רנטגן</td><td>NIST</td><td>DTSA, DTSA II</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת גיליון אלקטרוני</td><td>Microsoft</td><td>Excel</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> <ol> <li>ה-CF100 כבר לא נמכר מסחרית, למרות שהמכונה זמינה במתקנים אקדמיים רבים, ו ניתן למצוא מכונות או חלקים שלמים באינטרנט.</li> <li>מדריך וידאו למחזיק ה-cryotransfer CT3500 זמין בכתובת <a href="http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4" target="_blank">http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4</a>.</li> <li>ה-SEII מיושן; המנוע הספקטרלי האוניברסלי הוא מוצר מאוחר יותר, תואם למחשב עם פונקציונליות דומה. 4pi הפסיקה את הייצור והמכירות אך עדיין מספקת תמיכת לקוחות טכנית. מערכות משומשות נמצאות לעתים קרובות באינטרנט.</li> <li>ה-DTSA המקורי מיושן כעת. NIST מציע ברשות הציבור יורש מעודכן, DTSA II 12 (<a href="http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm" target="_blank">http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm</a>)</li> </ol> </td></tr></tbody></table>

מדידה של סידן סה&quot;כ בנוירונים על ידי אלקטרונים רנטגן microanalysis probe

Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

במאמר זה את הכלים, טכניקות, והכלים מתאימים למדידות כמותיות של תוכן יסודות תאיים באמצעות הטכניקה המכונה microanalysis אלקטרון הבדיקה (EPMA) מתוארים. סידן הוא Intramitochondrial דגש מיוחד בגלל התפקיד הקריטי שעומס יתר סידן המיטוכונדריה משחק במחלות ניווניות. השיטה מבוססת על הניתוח של קרני ה-X שנוצר במיקרוסקופ אלקטרונים (EM) על ידי אינטראקציה של אלומת אלקטרונים עם הדגימה. על מנת לשמור על הפצת יליד אלמנטי diffusible בדגימות מיקרוסקופית אלקטרונים, EPMA דורשת &quot;cryofixation&quot; של רקמה אחרי הכנת cryosections Ultrathin. הקפאה מהירה של תאים בתרבית או תרבויות הפרוסה organotypic מתבצעת על ידי הצעד ההקפאה באתאן הנוזלי או על ידי הקפאת טריקה נגד גוש מתכת קר, בהתאמה. Cryosections נומינלי 80 ננומטר העבה נחתכים יבש עם סכין יהלום בCA. -16076, C, רכוב על פחם / רשתות נחושת מצופה pioloform, וcryotransferred לcryo-EM באמצעות בעל cryospecimen מיוחד. לאחר סקר חזותי ומיפוי מיקום ב≤ -160 מעלות צלזיוס ומינון אלקטרונים נמוכים, cryosections קפוא התייבשות הם ב-100 מעלות צלזיוס במשך ~ 30 דקות מיובשים בהקפאה. תמונות ברמת אברון של cryosections המיובש נרשמות, גם במינון נמוך, באמצעות מצלמת CCD איטית סריקה ואזורי subcellular של העניין נבחר לניתוח. קרני ה-X הנפלטת מROIs ידי ממוקדת, אלקטרון בדיקה נייחת, בעוצמה גבוהה נאספות על ידי רנטגן באנרגיה נפיצה ספקטרומטר (edx), מעובד על ידי האלקטרוניקה קשורה, ומוצג כספקטרום ה-X, כלומר, עלילה של עוצמת קרני ה-X לעומת אנרגיה. תוכנה נוספות מאפשרת: 1) זיהוי של מרכיבים יסודיים על ידי האנרגיות שלהם &quot;האופייניות&quot; לשיא וטביעת אצבע; ו2) ניתוח כמוני על ידי מיצוי של אזורי שיא / רקע. מאמר זה מסכם בשתי דוגמאות הממחישות טיפוסייישומי EPMA, אחד שבו ניתוח סידן המיטוכונדריה סיפק תובנה קריטית לתוך מנגנונים של פגיעת יתר רעילה ועוד, שחשפו את הבסיס של התנגדות איסכמיה.

תאים במוח בדרך כלל לקיים פציעת יתר רעילה כתוצאה משחרור הנוירוטרנסמיטר פתולוגיים המתרחש בתנאי איסכמי. EPMA הייתה קריטית כדי לגלות כיצד היכולת של המיטוכונדריה העצבית כדי לעקל כמויות אדירות של סידן עומדת בבסיס המנגנון של פציעה. מיקרוסקופ האלקטרונים באיור 3 ממחיש את המראה של המיטוכונדריה בcryosections המיובש בהקפאה של תאי עצב בהיפוקמפוס בתרבית הוקפא במהירות לאחר 30 חשיפת דקות לגירוי יתר רעיל (100 מיקרומטר NMDA). רוב מיטוכונדריה מופיעה להיפגע מבחינה מבנית, כפי שהם נפוח...

מאמר זה מתאר את היישום של מיקרוסקופיה האלקטרונית cryoanalytical למדידת כמותית של תוכן הכולל סידן והפצה ברזולוציה subcellular בדגימות ביולוגיות מוגדרות מבחינה פיזיולוגית.

מדידה של סידן סה&quot;כ בנוירונים על ידי אלקטרונים רנטגן Microanalysis Probe

In this article the tools, techniques, and instruments appropriate for quantitative measurements of intracellular elemental content using the technique ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש במיקרוסקופ אלקטרונים אנליטי כדי למדוד כמותית את הריכוז של יסודות חשובים מבחינה ביולוגית כגון סידן ברזולוציה תת-תאית בנוירונים מתורבתים. זה מושג על ידי הקפאה מהירה של תרביות תאים חיים והכנת קטעי קריו דקים במיוחד. השלב השני הוא העברת קטעי קריו למיקרוסקופ אלקטרונים אנליטי ולייבש אותם בהקפאה.לאחר מכן נדרשות תמונות וספקטרום רנטגן מאזורים תת-תאיים נבחרים, כולל מיטוכונדריה עצבית. השלב האחרון הוא ניתוח כמותי של ספקטרום קרני הרנטגן כדי לקבוע ריכוזי יסודות מקומיים. בסופו של דבר, גישה זו המכונה EPMA משמשת לחשיפת שינויים בריכוזי הסידן ובפיזורם העומדים בבסיס איתות הסידן התוך-תאי.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קשורות כמו פלואורסצנטיות, מיקרוסקופיה, קליטת רדיואיזוטופ או פוטומטריית להבה, הוא רזולוציה ברמת אברון בודד ורגישות תת-מילימולרית. תדגים את ההליך ד"ר נטליה PVA, מדענית בכירה במעבדה שלנו. כדי להתחיל הכינו אמבט הקפאה על ידי עיבוי אתאן גזי בטמפרטורה שלילית של 160 מעלות צלזיוס בבאר המרכזית של מערכת מקוררת חנקן נוזלי.לאחר מכן מחק את קצה החלקה המכילה תאים דבוקים כדי להסיר את כל הנוזל מלבד שכבה דקה. הקפד לא לייבש את הדגימה. לאחר מכן, החזק את החלקת הכיסוי בקצה וטבול במהירות את הדגימה באתאן הנוזלי.לאחר שתיים-שלוש שניות, הסר את החלקת הכיסוי מהאתאן והנח אותה בקערת קלקר של העברת חנקן נוזלי. כיסוי קפוא מחליק לתוך מיקרוטום קריו שהתקרר מראש למינוס 135 מעלות צלזיוס. חותכים את החלקות הכיסוי הקפוא לריבועים של שלושה מילימטר על שלושה מילימטר בעזרת אזמל חד לפני קירור.לאחר מכן הטמיעו אותם עם הפנים כלפי מעלה על סיכת אלומיניום בקוטר שלושה מילימטר בתערובת דבק קריו המורכבת מחלק אחד אתנול ושישה חלקים. איזופרופנול. מצק את דבק הקריו על ידי הורדת הטמפרטורה של קופסת הקריו למינוס 160 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, חתוך את האזורים העשירים בתא של חתיכת החלקת הכיסוי לפנים בלוק של כ-250 על 250 מיקרון, ולעומק של 100 מיקרון.בעזרת כלי חיתוך יהלומים, חתכו סרטים יבשים של חתכים דקים ב-160 מעלות צלזיוס שליליות באמצעות סכין קריו יהלום 35 מעלות כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן העבירו את החלקים לצורת פאולה מצופה פחמן משוחרר זוהר. סרטי תמיכה יצקו מעל 100 רשתות נחושת מתקפלות ברשת היושבות במעטפת אינדיום פתוחה.הרשת סגורה. לאחר מכן המעטפה והכריך נלחצו בכלי לחיצה מקורר לפני העברת הדגימות למיקרוסקופ האלקטרונים. קררו את מחזיק הקריו לטמפרטורה המינימלית שלו של לפחות 160 מעלות צלזיוס שליליות בוואקום גבוה בשלב המיקרוסקופ.לאחר מכן הטה את הגוניומטר 45 מעלות בכיוון השעון והסר את המחזיק. העבר במהירות את מחזיק הקריו המקורר מהמיקרוסקופ לתחנת העבודה של הקריו המקורר ומשוך את מגן הכפור של המחזיק. לאחר מכן העבירו את הדגימה למחזיק הקריו.אבטח את הרשת עם טבעת השמירה באמצעות כלי הברגים המצורף וסגור את מגן הכפור. לאחר מכן, הסר במהירות את מחזיק הקריו מתחנת העבודה של הקריו והכנס אותו למנעול האוויר של המיקרוסקופ. עברו על רצף השאיבה במהירות האפשרית עם מחזיק הקריו לדוגמה במקומו.החזר את הגוניומטר להטיה של אפס מעלות. חבר מחדש והפעל מחדש את תיבת הבקרה ואשר שטמפרטורת הדגימה נמוכה או שווה ל-150 מעלות צלזיוס שליליות. לבסוף, מלא מחדש את העושה של מחזיק הדגימה ואפשר לוואקום ולטמפרטורה להתאושש במלואם.ראשית, הערך חזותית את הדגימה בהגדלה של פי 250 ובתאורה נמוכה. החלקים שנבחרו צריכים להיות דקים וחלקים, לא מקופלים או חופפים. הם גם צריכים להיות שטוחים מחוברים היטב לסרט התמיכה ובדרך כלל לא מוסתרים על ידי פסי רשת.השתמש בגוניומטר הדיגיטלי stage כדי לאחסן את הקואורדינטות של הקטעים שנבחרו. לאחר מכן, הגדל את טמפרטורת המחזיק ל-100 מעלות צלזיוס שלילית למשך 30 דקות על מנת לייבש בהקפאה את החלקים כדי לייצב אותם ולשפר את הניגודיות. לאחר מכן החזירו את הדגימות חזרה ל-160 מעלות צלזיוס שליליות או פחות.לפני הדמיה ברזולוציה גבוהה. כבה את יחידת הבקרה של מחזיק הקריו ונתק פיזית את כבל הבקר כדי למנוע סחף תמונה עקב רכיבה תרמית ו/או איסוף רעידות. לאחר מכן הפעל את מיקרוסקופ האלקטרונים במצב הגדלה גבוהה.סקר אזורים תת-תאיים בהגדלה של כ-2000 פעמים שנמצאים בקטעים נבחרים שמיקומם אוחסן בעבר. הקלט ואחסן תמונות TIFF של אזורים מבטיחים. לאחר מכן הערך את התמונות על מנת לבחור ולהוסיף הערות לאזורים מעניינים לניתוח רנטגן.לאחר שנבחרו אזורי עניין, הגדר את מיקרוסקופ האלקטרונים לרכישת קרני רנטגן על ידי הכנסת גלאי EDX לעמודה, משיכת צמצם המטרה והכנסה וריכוז של כל פתחי קרינה תועים. הטה את המחזיק 20 מעלות לכיוון הגלאי במצב נקודתי. הגדל את זרם האלומה לכשלושה ננו אמפר כפי שנמדד בנקודה של 100 ננומטר.לאחר מכן העלה את טמפרטורת מחזיק הקריו ל-100 מעלות צלזיוס ומטה כדי למנוע זיהום כפור בתנאי הדמיה בשדה רחב. בחר מיטוכונדריה לניתוח. חזור למצב נקודתי.להשיק את תוכנת רכישת הספקטרום ולהתחיל ברכישות ה-102. שמור את הספקטרום המוקלט בתבנית הקובץ EMSA הסטנדרטית. דגמו מספיק מיטוכונדריה בתאים שונים כדי להבטיח מערך נתונים מובהק סטטיסטית.על מנת לנתח באופן איכותי ספקטרום EDX, השתמש במסד נתונים תוכנה זמין ובשגרת התאמת שיא כגון DTSA כדי לזהות את האלמנטים העיקריים בספקטרום. זהה את היסודות לפי מיקומי האנרגיה האופייניים לפסגות שלהם. דגימות ביולוגיות מכילות בדרך כלל נתרן, קסיום, זרחן, גופרית, כלור, אשלגן וסידן.שימו לב במיוחד לפסגות הסידן והאשלגן מכיוון שהן חופפות לניתוח כמותני. התחל בחילוץ השטח המשולב של פסגות מזוהות באמצעות כל אחד מכמה אלגוריתמי התאמה סטנדרטיים כגון שיטת הסימפלקס המובנית ב-DTSA הבא להעריך מסה יבשה על ידי שילוב הרצף בין 1.45 ל-1.61 קילו אלקטרון וולט. ניתן להשתמש באזורים נטולי הפרעות חלופיות, למשל, 4.0 עד 5.0 קילו אלקטרון וולט כדי למנוע אותות לא ביולוגיים זרים באזור הרצף הראשוני.לבסוף, חשב יחסי שיא על רצף והמר לריכוזים בהשוואה לתקנים. גישה זו ידועה כשיטת פסגת האולם על הרצף. מוצג כאן מיקרוגרף של נוירון היפוקמפוס מתורבת, שקפא במהירות בעקבות חשיפה לגירוי ציטוטוקסי, מה שמוביל לפתיחת תעלות יונים ולסידן בשטף.רוב המיטוכונדריה המוצגים כאן נראים פגומים מבנית מכיוון שהם נפוחים מאוד ומכילים תכלילים קטנים וכהים. לאחר מכן נעשה שימוש במיקרואנליזה של בדיקת אלקטרונים לביצוע ניתוח יסודות בתוך ובלעדי התכלילים המיטוכונדריאלים. המחקר גילה כי תכלילים מורכבים בעיקר מכמויות גבוהות במיוחד של סידן וזרחן.זה מסביר את יכולת חציצה הסידן יוצאת הדופן שלהם ומדוע הצפת מנגנון החציצה הזה מובילה לעומס יתר של סידן הגורם למוות של תאים. ההיפוקמפוס, אזור במוח קריטי ללמידה וזיכרון הוא אתר פגיעה עיקרי לאחר איסכמיה. האזור המובחן מבחינה תפקודית הנקרא CA 3 פגיע הרבה פחות לפגיעה איסכמית מאשר המיקרואנליזה הסמוכה של בדיקת אלקטרונים באזור אחד המחוברים סינפטית בעקבות גירויים רעילים של פרוסות אלה הראתה עליות סידן גדולות בהרבה בתאי עצב CA one פגיעים מאשר בנוירונים CA שלושה עמידים.כתוצאה מכך, מיטוכונדריה CA one מציגה פגיעה נרחבת ותפקוד לקוי, מה שמצביע על כך שתפקוד לקוי של המיטוכונדריה הנגרם על ידי עומס יתר של סידן הוא גורם מכריע בפגיעות הסלקטיבית של נוירוני CA one. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד את ריכוז הסידן הכולל במיטוכונדריה בודדת של נוירונים תרבותיים באמצעות מיקרואנליזה של בדיקת איסוף.

measurement-total-calcium-neurons-electron-probe-x-ray

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מראים כיצד שינויים בריכוז התאי החופשיים הסיד ויעילות הסינפטית ניתן לפקח במקביל בהכנה של...

מעקב אחר שינויים בריכוז הסידן התאיים ויעילות הסינפטית ברכיכות<em&gt; Aplysia</em

סרטון זה מציג את המושגים מאחורי דימות סידן וכולל פרוטוקול לדוגמה להדמיית הילוך מהיר של תולעים הכלולות בבארות אגרוז יצוקות.

הדמיית סידן: שיטה להמחשת פעילות עצבית ב- C. elegans חי

עם גוף מערך עצביה הקטנים שקוף, מתועד היטב ומגוון הרחב של טכניקות גנטיות מתאימים...

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

מתוארים נהלים לביצוע הקלטות בו זמנית של פוטנציאל הממברנה או זרם ושינויים בריכוז הסידן התוך תאי. נוירוני גרעין סופרכיאזמטיים ממולאים במחוון הסידן ביס-פורה-2 באמצעות אלקטרודת מהדק טלאי בכל תצורת מהדק התיקון של התא.

אלקטרו הקלטה בו זמנית ובסידן הדמיה של suprachiasmatic גרעין נוירונים

אנו מציגים שיטת שילוב תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטות והדמיה שני הפוטונים להקליט את Ca2 + שנחשולי דנדריטים עצביים במוח חריפה פרוסות.

שני הפוטונים סידן הדמיה של דנדריטים עצביים במוח פרוסות

אנו מציגים פרוטוקול דו-חלקי המשלב הדמיה של סידן פלורסנט עם היברידיזציה באתרו, ומאפשר לניסויים לתאם דפוסים של פעילות הסידן עם פרופילי ביטוי גנים ברמה של תא אחד.

סידן פלואורסצנטי הדמיה ובעקבות היברידיזציה באתרו לאפיון עצבי בלתי מבשר בקספוס זריזה

שתי שיטות קשורות מתוארות כדי לדמיין אירועים תת-תאיים הנדרשים לשידור סינפטי. פרוטוקולים אלה מאפשרים ניטור בזמן אמת של הדינמיקה של זרם סידן presynaptic והיתוך קרום שלפוחית סינפטי באמצעות הדמיה של תאים חיים של נוירונים בתרבית הפריה חוץ גופית .

מדידה פלואורסצנטית בזמן אמת של פונקציות סינפטיות במודלים של טרשת אמיוטרופית לרוחב

הפרוטוקול מתאר את השיטה של העמסת צבע סידן פלואורסצנטי דרך העצב החתוך לתוך מסופי העצבים המוטוריים של העכבר. בנוסף, מוצגת שיטה ייחודית לרישום ארעי סידן מהירים בקצות העצבים ההיקפיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

רישום של סידן חולף בצומת נוירומוסקולרי עכבר עם רזולוציה טמפורלית גבוהה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

השיטות הנוכחיות מתארות גישה לא רציומטרית להדמיית סידן ברזולוציה גבוהה, תת-מדורית in vivo ב- Caenorhabditis elegans באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית זמינים.

הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי ב-Vivo

הפרוטוקול המוצע כולל גישה גלובלית להערכת היווצרות עצם בהקשר של התחדשות עצם באמצעות אנליזות מולטימודאליות. מטרתו לספק מידע איכותי וכמותי על היווצרות עצם חדשה, לשפר את הקפדנות והתוקף של מחקרים בסיסיים ופרה-קליניים.

אפיון מקיף של מינרליזציה של רקמות במודל Ex Vivo

למד כיצד למדוד סידן סה"כ בנוירונים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים רנטגן וניתוח קריו. שיטה זו חושפת שינויים בריכוזי סידן שמכריעים לסיגנלים תוך-תאיים במיטוכונדריה נוירונליות.

מדידה של סידן סה"כ בנוירונים על ידי אלקטרונים רנטגן Microanalysis Probe

גלה סרטונים נוספים