Name: שימוש בכימיה לחץ כדי למדוד את ההשפעה של זיהום ויראלי בסינתזת RNA Host-Cell (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: למדו כיצד למדוד שינויים בתעתוק תאי מארח לאחר זיהום בנגיף RVFV באמצעות כימיה לחץ. שיטה זו מאפשרת זיהוי RNA חדש ללא שימוש בחומרים רדיואקטיביים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים RB Tesh למתן העכבר polyclonal אנטי RVFV נסיוב ומ &#39;גריפין של מתקן Core cytometry זרימת UTMB לעזרה עם cytometry הזרימה. עבודה זו נתמכה על ידי 5 U54 AI057156 באמצעות המרכז האזורי המערבי של אקסלנס, מענק NIH R01 AI08764301, ומימון ממרכז Sealy לפיתוח חיסון בUTMB.BK נתמכה על ידי מלגת קרן מקלפלין וו ג&#39;יימס בUTMB.OL נתמכה על ידי פרס מוריס הילמן ר &#39;בשלב מוקדם בקריירה חוקר.

<ol><li>Fakan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+support+for+RNA+synthesis+in+the+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Achiev.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Structural support for RNA synthesis in the cell nucleus.</a> Methods Achiev. Exp. Pathol. 12, 105-140 (1986).</li>
<li>Jensen, P. O., Larsen, J., Christiansen, J., Larsen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+measurement+of+RNA+synthesis+using+bromouridine+labelling+and+bromodeoxyuridine+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric measurement of RNA synthesis using bromouridine labelling and bromodeoxyuridine antibodies.</a> Cytometry. 14, 455-458 (1993).</li>
<li>Jao, C. Y., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+RNA+transcription+and+turnover+in+vivo+by+using+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 15779-15784 (2008).</li>
<li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stepwise+huisgen+cycloaddition+process%3A+copper%28I%29-catalyzed+regioselective+%22ligation%22+of+azides+and+terminal+alkynes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 41, 2596-2599 (2002).</li>
<li>Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidotriazoles+on+solid+phase%3A+%5B1%2C2%2C3%5D-triazoles+by+regiospecific+copper%28i%29-catalyzed+1%2C3-dipolar+cycloadditions+of+terminal+alkynes+to+azides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides.</a> J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).</li>
<li>Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+protein+of+rift+valley+fever+virus+promotes+posttranslational+downregulation+of+the+TFIIH+subunit+p62%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs protein of rift valley fever virus promotes posttranslational downregulation of the TFIIH subunit p62.</a> J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).</li>
<li>Kalveram, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+NSs+inhibits+host+transcription+independently+of+the+degradation+of+dsRNA-dependent+protein+kinase+PKR%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus NSs inhibits host transcription independently of the degradation of dsRNA-dependent protein kinase PKR.</a> Virology. , (2012).</li>
<li>Head, J. A., Kalveram, B., Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+Rift+Valley+fever+virus+NSs+encoding+a+partial+truncation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of Rift Valley fever virus NSs encoding a partial truncation.</a> PLoS One. 7, e45730(2012).</li>
<li>Lihoradova, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Rift+Valley+Fever+Virus+MP-12+Strain+Encoding+NSs+of+Punta+Toro+Virus+or+Sandfly+Fever+Sicilian+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Characterization of Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain Encoding NSs of Punta Toro Virus or Sandfly Fever Sicilian Virus.</a> PLoS Negl Trop Dis. 7, e2181(2013).</li>
<li>Kalveram, B., Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toscana+Virus+NSs+Protein+Promotes+Degradation+of+Double-Stranded+RNA-Dependent+Protein+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Toscana Virus NSs Protein Promotes Degradation of Double-Stranded RNA-Dependent Protein Kinase.</a> J. Virol. , (2013).</li>
<li>Schmaljohn, C., Nichol, S. In Fields Virology. Knipe, D. M., et al. , Lippincott Williams and Wilkins. 1741-1789 (2007).</li>
<li>Le May, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TFIIH+transcription+factor%2C+a+target+for+the+Rift+Valley+hemorrhagic+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus.</a> Cell. 116, 541-550 (2004).</li>
<li>Caplen, H., Peters, C. J., Bishop, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagen-directed+attenuation+of+Rift+Valley+fever+virus+as+a+method+for+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Mutagen-directed attenuation of Rift Valley fever virus as a method for vaccine development.</a> J. Gen. Virol. 66, 2271-2277 (1985).</li>
<li>Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+infectious+Rift+Valley+fever+virus+entirely+from+cDNA%2C+analysis+of+virus+lacking+the+NSs+gene%2C+and+expression+of+a+foreign+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rescue of infectious Rift Valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene.</a> J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).</li>
<li>Vyboh, K., Ajamian, L., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+viral+RNA+by+fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of viral RNA by fluorescence in situ hybridization (FISH).</a> J. Vis. Exp. , e4002(2012).</li>
<li>Reich, E., Goldberg, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actinomycin+and+nucleic+acid+function%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Nucleic+Acid+Res.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Actinomycin and nucleic acid function.</a> Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 3, 183-234 (1964).</li>
<li>Holmes, K. L., Lantz, L. M., Russ, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugation+of+fluorochromes+to+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Conjugation of fluorochromes to monoclonal antibodies.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 4 (Unit 4 2), (2001).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הפרוטוקול סיפק מתאר שיטה למדוד את ההשפעה של זיהום ויראלי בשעתוק תא מארח באמצעות שילוב של uridine האנלוגי האיחוד האירופי לרנ&quot;א המתהווה. לשיטה זו מספר יתרונות על פני שיטות קודמות: הוא מהיר, רגיש, ושאינו מסתמך על השימוש באיזוטופים רדיואקטיביים. יתר על כן, ניתן להתאים את השיטה להניב נתונים איכותניים דרך מיקרוסקופ פלואורסצנטי או נתונים כמותיים באמצעות cytometry הזרימה באמצעות את אותם חומרים כימיים. בשילוב עם מכתים immunofluorescence לאנטיגנים נגיפיים, שיטה זו גם מאפשרת לחוקר לנקוט...

<html> באופן מסורתי, פעילות תעתיק כבר נמדד באמצעות שילוב של שני רדיואקטיבי (H-3 uridine) 1 או הלוגנים (BRU) 2 נוקלאוזידים לרנ&quot;א המתהווה. אנלוגים uridine אלה נלקחו על ידי תאים, הוסבו uridine-אדנוזין (UTP) דרך מסלול ההצלה nucleoside, ושולבו לאחר מכן לתוך RNA מסונתז חדש. ניתן לאתר 3 H-uridine ידי autoradiography, שיכול להימשך זמן רב, או נצנץ ספירה, אשר דורש ציוד מיוחד. יתר על כן, השימוש באיזוטופים רדיואקטיביים לא יכולים להיות מעשי במספר הגדרות מעבדה, כולל מעבדות בטיחות ביולוגיות הכלה גבוהה. ניתן לאתר באמצעות ברו immunostaining עם נוגדנים נגד ברו, אשר עשוי לדרוש permeabilization הקשה כדי להבטיח גישה של הנוגדן לגרעין או denaturation החלקית של רנ&quot;א, כמבנה המשני RNA עשוי להיות הפרעה סטרית לכריכת נוגדנים. _content &quot;&gt; הפרוטוקול המתואר כאן מנצל את הכימיה לחץ פיתחה לאחרונה לחץ כימיה 3 למדידת פעילות תעתיק בתאים נגועים בזן RVFV MP-12. מסתמכת על נחושת סלקטיבי והיעילה ביותר (אני)-catalyzed תגובת cycloaddition בין alkyne ו מחצית אזיד 4,5. בפרוטוקול זה, RNA המתהווה בתאים נגועים שכותרתו ראשונה באמצעות שילוב של uridine האנלוגי האיחוד האירופי. בשלב שני, האיחוד האירופי Incorporated הוא זוהה באמצעות תגובה עם אזיד ניאון. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם (1) שהיא אינה דורשת את השימוש באיזוטופים רדיואקטיביים ו( 2) שהיא אינה דורשת permeabilization הקשה או denaturation של רנ&quot;א. עם משקל מולקולרי של פחות מ -50 דא, גישה של אזיד הניאון לא הקשתה על ידי מספיק permeabilization או RNA מבנה המשני. יתר על כן, חוקרים אינם מוגבלים בבחירתם של נוגדנים עיקריים כאשר שילוב זיהוי של RNA עם כיתהimmunostaining iCal לחלבונים ויראליים. שתי שיטות שונות מתוארות בפרוטוקול זה: אחת להמחשת שעתוק באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (צעדים 1-4), ואחד לכימות שעתוק באמצעות cytometry זרימה (שלבים 5-8). שתי שיטות אלה משלבות תיוג של רנ&quot;א המתהווה עם immunostaining תאי לחלבונים נגיפיים, המאפשר למתאם בין פעילות תעתיק וזיהום ויראלי על בסיס תא אחר תא. החוקרים השתמשו בהצלחה בפרוטוקול שתואר כאן כדי לקבוע פעילות תעתיק בתאים נגועים בזן RVFV MP-12 6, התאים נגועים במוטציות שונות MP-12, 9, 7,8 ותאים נגועים בנגיף טוסקנה (TOSV) 10. ניתן להתאים הפרוטוקול המתואר כאן בקלות לשימוש עם וירוסים שונים ויש לו את הפוטנציאל להיות שונה כדי לכלול מכתים immunofluorescence של חלבונים נגיפיים או סלולריים ספציפיים.

<table><tbody><tr><td>5-ethynyl-uridine</td><td>Berry Associates</td><td>PY 7563</td><td>מתמוססים ב-DMSO עבור מלאי 100 מ"מ</td></tr><tr><td>12 מ"מ כיסויים עגולים</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>צינורות פוליסטירן 5 מ"ל</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Actinomycin D (ActD)</td> <td>Sigma</td><td>9415</td><td>מתמוססים ב-DMSO עבור מלאי 10 מ"מ</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 עז אנטי-עכבר IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר (BSA) </td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-2323</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Sigma</td><td>C-8027</td><td>מתמוסס ב-H2O עבור מלאי 100 מ"מ</td></tr><tr><td>DAPI </td><td>Sigma</td><td>D-9542</td><td>מתמוסס ב-H2O עבור מלאי 5 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>DMEM </td><td>Invitrogen</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>אזיד</td> פלואורסצנטי <td>Invitrogen 16000044</td><td></td></tr><tr><td>(Alexa Fluor 594-coupled)</td><td>Invitrogen</td><td>A10270</td><td></td></tr><tr><td>אזיד פלואורסצנטי (Alexa Fluor 657-coupled)</td><td>Invitrogen</td><td>A10277</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbic</td><td>acid Sigma</td><td>A-5960</td><td>מתמוסס ב-H2O עבור 500 מ"מ </td></tr><tr><td>מסנן נייר</td><td>VWRbrand</td><td>28333-087</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד </td><td>סיגמא</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>פולי-L-ליזין (MW &#8805; 70000)</td><td>Sigma</td><td>P1274</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>בסיס Trizma</td><td>Sigma</td><td>T-1503</td><td>להתמוסס ב-H2O עבור מלאי של 1.5 M, pH 8.5</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td></td><td></td> <td>למשל Olympus IX71</td></tr><tr><td>Flow Cytometer</td><td></td><td></td><td>e. BD Biosciences LSRII Fortessa</td></tr></tbody></table>

שימוש בכימיה לחץ כדי למדוד את ההשפעה של זיהום ויראלי בסינתזת rna host-cell

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

רבים וירוסי RNA התפתחו היכולת לעכב שעתוק תא מארח כאמצעי לעקוף את ההגנות של סלולריות. לצורך המחקר של וירוסים אלה, ולכן חשוב לנו בצורה מהירה ואמינה למדידת פעילות תעתיק בתאים נגועים. באופן מסורתי, שעתוק כבר נמדד גם על ידי שילוב של נוקלאוזידים רדיואקטיביים כגון H-3 uridine אחרי גילוי דרך autoradiography או נצנץ ספירה, או שילוב של תולדות אנלוגים uridine כגון 5-bromouridine (BRU) ואחריו גילוי דרך immunostaining. השימוש באיזוטופים רדיואקטיביים, לעומת זאת, דורש ציוד מיוחד ולא ריאלי במספר הגדרות מעבדה, תוך זיהוי של ברו יכול להיות מסורבל ועלול לסבול מרגישות נמוכה. הכימיה לחץ שפותחה לאחרונה, הכוללת היווצרות triazole נחושת קטליזאטור מיזיד וalkyne, החברה מספקת מהירה וhighlחלופה רגישה Y לשתי השיטות הללו. לחץ כימיה היא תהליך שלב שני שבו RNA המתהווה הוא שהכותרת ראשונה על ידי שילוב של אנלוגי uridine 5 ethynyluridine (איחוד אירופי), ואחריו גילוי של התווית עם אזיד ניאון. azides האלה זמינים בכמה fluorophores שונה, המאפשר מגוון רחב של אפשרויות לשם ויזואליזציה. פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידת דיכוי שעתוק בתאים נגועים בנגיף קדחת בקעת (RVFV) מתח MP-12 באמצעות לחץ כימיה. במקביל, ביטוי של חלבונים נגיפיים בתאים אלה נקבע על ידי immunostaining תאי הקלסית. שלבי 1 עד 4 פירוט שיטה לדמיין דיכוי תעתיק באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ואילו שלבי 5 עד 8 פירוט שיטה לכמת דיכוי תעתיק באמצעות cytometry הזרימה. פרוטוקול זה הוא להתאמה בקלות לשימוש עם וירוסים אחרים.

<html> החלבון של NSS RVFV (משפחת Bunyaviridae, Phlebovirus סוג) 11 מעכב שעתוק כללי תא מארח באמצעות שני מנגנונים נפרדים: (א) על ידי sequestering מקטע P44 של גורם השעתוק הבסיסי TFIIH 11 ו (ב) על ידי קידום השפלה proteasomal של p62 מקטע של 6 TFIIH. MP-12 זן תרכיב RVFV 13 שימש במשך הניסויים שתוארו בפרוטוקול זה מאז-12 MP מתח יכול להיות מטופלים במעבדת בטיחות ביולוגית ברמת 2 והוא לא נכלל בשלטון בחר הסוכן בארה&quot;ב, אשר חל על פרוע אחרות...

שיטה זו מתארת ​​את השימוש בכימיה לחץ כדי למדוד שינויים בשעתוק תא מארח לאחר הדבקה בנגיף קדחת הבקעה (RVFV) מתח MP-12. תוצאות יכולות להיות דמיינו איכותית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או הושגו כמותית באמצעות cytometry הזרימה. שיטה זו ניתנת להתאמה לשימוש עם וירוסים אחרים.

שימוש בכימיה לחץ כדי למדוד את ההשפעה של זיהום ויראלי בסינתזת RNA Host-Cell

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לנתח פעילות שעתוק בתאים נגועים בנגיף. ראשית, הדביקו את תאי 293 בנגיף חום עמק השריפט, MP-12. לאחר מכן, סמנו את התאים באמצעות האנלוג של אורידין, 5-ethynyl-uridine, אשר נטמע ב-RNA נבנה. בשלב הבא, חברו את ה-5-ethynyl-uridine הנטמע לאזיד פלואורסצנטי על מנת להנמיח את ה-RNA שסונתז לאחרונה. התוצאות שהתקבלו העריכו הבדלים בכמות ה-RNA שסונתז לאחרונה בין תאים נגועים לתאים שאינם נגועים, על בסיס מיקרוסקופיה פלואורסצנטית או ציטומטריית זרימה.בניגוד לסימון באמצעות tritium-uridine או 5-bromo uridine, גישה זו של כימיית קליק אינה דורשת שימוש באיזוטופים רדיואקטיביים. היא גם מהירה ורגישה יותר מצביעה אימונוהיסטוכימית נגד bromo uridine. הרעיון לשיטות אלו נובע מהצורך שלנו בדרך מהירה ואמינה למדידת דיכוי תעתוק בתאים שהודבקו במאבט של נגיף חום עמק השריף, MP-12.הניחו כיסויי זכוכית עגולים בקוטר 12 מילימטר בכל באער של פלטת תרבית רקמות בעלת 12 באערים. לאחר מכן, זרעו תאי 293 ב-1 מילימטר של מצע DMEM מלא. הדגרירו את התאים באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 degrees Celsius וב-5% carbon dioxide למשך לילה. בהתאם לתכנון הניסוי, דללו את מלאי הווירוס כך שהדבקת התאים ב-MP-12 תהיה בריבוי הדבקה (multiplicity of infection) של שלושה, בנפח כולל של 200 microliters לבאער. הגדירו באער אחד כביקורת לא-מדובקת ובאער נוסף כביקורת לדיכוי שעתוקי. כעת, הסירו את מצע הגידול. הוסיפו את האינוקולום הווירוסלי והדגרירו למשך שעה אחת באינקובטור הלח. שאבו את האינוקולום. הוסיפו 1 מיליליטר של מצע גידול טרי לכל באער, והדגרירו בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. 15 שעות לאחר ההדבקה, החליפו את מצע הגידול במצע המכיל 1 מילימולר של אנלוג uridine, שמו 5-ethynyl-uridine. לאחד מהבאערים שעברו הדבקה דמה (mock infection) הוסיפו גם 5 מיקרוגרם למילליטר של actinomycin-D, מעכב של סינתזת RNA תלוית-DNA. החזירו את התאים לאינקובטור. 16 שעות לאחר ההדבקה, הסירו את המצע ושטפו את כיסויי הזכוכית פעם אחת עם 1 מיליליטר PBS לכל באער. קבעו את התאים באמצעות 1 מיליליטר של 4% para-formaldehyde לכל באער. שטפו פעם אחת עם 1 מיליליטר PBS לכל באער.כדי להרכיב את תא הלחות, רפדו את תחתיתו של כלי לתרבית תאים או צלחת פטרי בקוטר 10 סנטימטרים בסרט פלסטיק פראפיני. רפדו את פנים דפנות הצלחת בנייר סופג לח. כעת, כדי לבצע פרמיליזציה לתאים, הוסיפו מיליליטר אחד של 0.2%triton X-100 ב-PBS. הדגירו למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שלושה שטיפות ב-PBS, העבירו את הזכוכיות למכסה (cover slips) אל תא הלחות. לצורך תגובת ה-click לזיהוי RNA מסומן, כסו כל זכוכית למכסה ב-50 עד 100 microliters של תמיסת צביעת click שהוכנה טרי. הדגירו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בחשכה.הוסיפו 1 ml של PBS לבארות של פלטת 12 בארות חדשה והעבירו את כיסויי הזכוכית (cover slips) אל הבארות. שטפו פעמיים נוספות עם 1 ml של PBS לכל בארה. כדי להכין את התאים למיקרוסקופיה פלואורסצנטית, הניחו טיפה אחת של fluoromount-G על סלייד של מיקרוסקופ. טבלו את כיסוי הזכוכית במים והסירו את עודפי המים. הניחו את כיסוי הזכוכית כשהצד שבו נמצאים התאים פונה כלפי מטה לתוך טיפת ה-fluoromount G והניחו לייבש באוויר במשך חמש דקות.בהתאם למערך הניסוי, הדביקו את תאי 293 ב-MP 12 ב-MOI של שלושה. הסירו את מצע הגידול, הוסיפו תמיסת נגיף מדוללת והדגירו למשך שעה אחת באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. החליפו את האינוקולום בשני מיליליטר של מצע גידול טרי לכל באר, והדגירו ב-37 °C למשך הזמן האופטימלי לסימון ולבקיעה של הנגיף. לאחר מכן, החליפו את מצע הגידול במצע המכיל 0.5 millimolar 5-ethynyl-uridine באחת מבארי הביקורת (mock infected). הוסיפו גם חמישה מיקרוגרם למילליטר actinomycin-D. החזירו את התאים לאינקובטור למשך שעה אחת. לאחר שטיפה אחת ב-PBS, בצעו קציר של התאים באמצעות טריפסינזציה. שטפו את התאים שנקצרו שלוש פעמים ב-PBS המכיל one millimolar EDTA. כדי לקבע את התאים, השביו את המשקע במיליליטר אחד של 4%PFA והדגירו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו פעם אחת במיליליטר אחד של PBS-EDTA לכל מבחנה. לאחר מכן, בצעו פרמיאביליזציה לתאים ב-0.5 מיליליטר של 0.2%Triton X-100 ב-PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו פעם אחת במיליליטר אחד של PBS נטול נוקלאז. עבור תגובת ה-click, השביו את משקע התאים ב-200 microliters של תמיסת צביעת click המכילה את הצבע הפלואורסצנטי. אם התאים נצמדים זה לזה, השביו אותם באמצעות פיפטינג. הדגירו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בחשיפה מוגבלת לאור (בחושך). שטפו פעמיים בבפר FACS. בניסוי זה, תאי 293 הוחדרו ב-MP-12 ובנגיף מוטנטי עם מחיקה שחסרה היכולת לדכא את התעתוק של תאי המאכסן. בתאים שעברו הדחאה דמה (mock), הגרעינים נראים באדום בהיר עקב תעתוק מתמשך. מכיוון שהתאים סומנו ב-EU למשך שעה אחת בלבד, ולאחריהם בוצע קיבוע מיידי, מרבית ה-RNAs נשארים בגרעין. לעומת זאת, כאשר תאים טופלו ב-Actinomycin-D כדי לעכב תעתוק באופן פרמקולוגי, הפלואורסצנציה האדומה של הגרעינים פחתה באופן ניכר. פלואורסצנציה זו פחתה באופן דומה כאשר תאים הוחדרו ב-MP-12, אך לא במוטנט המחיקה, שאינו מדכא את תעתוק המאכסן. כאן התאים עברו טרנספקציה של mRNA שסונתז in vitro במקום הדחאה בנגיף חי. האות הפלואורסצנטי האדום בגרעינים מעיד על כך שבהשוואה לתאים שלא עברו טרנספקציה, תאים שעברו טרנספקציה עם mRNA המקודד לחלבון פלואורסצנטי ירוק לא שינו את פעילות התעתוק. רק טרנספקציה עם mRNA המקודד לגורם הוירולנציה NSs של נגיף חום עמק הריפט (Rift Valley fever virus) הביאה לירידה בפלואורסצנציה האדומה. כאשר נמדדו הכמויות, את נתוני ציטומטריית הזרימה שהתקבלו ניתן להציג כגרפי פיזור, כאשר האות הפלואורסצנטי של שילוב EU ב-RNA ראשוני מוצג על ציר ה-Y, והאות של צביעה נגד נגיף חום עמק הריפט מוצג על ציר ה-X. שערים של רביעים נקבעו כך שמרבית התאים שעברו הדחאה דמה ממוקמים ברביע השמאלי העליון. מרבית תאי ה-actinomycin-D מומקמו ברביע השמאלי התחתון ומרבית התאים המוחדרים מומקמו בחציו הימני של הגרף. כאשר התאים הוחדרו ב-MP-12, 81.5% מכלל התאים, או 93% מהתאים החיוביים לנוגדן נגד נגיף חום עמק הריפט, הראו פעילות תעתוק מופחתת. לעומת זאת, כאשר תאים הוחדרו ב-MP-12, clone 13-type, 91.6% מכלל התאים, או 97% מהתאים החיוביים לנוגדן נגד נגיף חום עמק הריפט, הראו פעילות תעתוק שהייתה דומה לזו של תאים שעברו הדחאה דמה. נתונים אלה ניתן להציג גם בצורה של היסטוגרמה עבור סימון פלואורסצנטי של RNA עם שילוב EU.בעקבות זאת, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון צביעה אימונוהיסטוכימית תוך-תאית כדי להדמיות ביטוי של חלבון נגיפי בתאים אלו. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה של האופן שבו ניתן להשתמש בכימיה של "קליק" (click chemistry) להדמיית פעילות שעתוק בתאים נגועים בנגיף, בין אם באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ובין אם באמצעות ציטומטריה של זרימה.אל תשכחו, עבודה עם נגיפים זיהומיים עלולה להיות מסוכנת ביותר, לכן יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת PPE מתאים ומניעת שאיפה של אירוסולים.

using-click-chemistry-to-measure-effect-viral-infection-on-host-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

חלקיקים adenovirus מתוכננים להכיל אנלוגי טבעי חומצת אמינו azidohomoalanine או סוכר...

שינוי Chemoselective של משטחים ויראלי באמצעות כימיה לחץ Bioorthogonal

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

סרטון זה מדגים בדיקה להערכת חומרים אנטי-ויראליים המכוונים לשלבים ספציפיים של כניסת הנגיפים לתאי המאכסן ואיחוי עם האנדוזום. התאים מודגרים בטמפרטורה נמוכה ואז נגועים ב- HCV. הטמפרטורה הנמוכה מאפשרת קשירה נגיפית לתאים מארחים אך מעכבת הפנמה באמצעות אנדוציטוזה. התרכובת האנטי-ויראלית של הבדיקה מתווספת, והתאים מודגרים בטמפרטורה פיזיולוגית. מעבר זה לטמפרטורה גבוהה יותר מאפשר כניסה נגיפית ומאפשר להעריך את השפעת תרכובת הבדיקה על איחוי מעטפת נגיפית עם אנדוזומים.

בדיקה להערכת ההשפעה של תרכובות בדיקה על כניסה נגיפית ואיחוי בתאים מארחים

במבחני חוץ גופית כדי למדוד שכפול נגיף כבר השתפר מאוד על ידי הפיתוח של וירוסי RNA רקומביננטי להביע לוציפראז או אנזימים אחרים מסוגלים פליטת אור. כאן אנו פירוט צינור הקרנת תפוקה גבוהה המשלב זני רקומביננטי כגון חצבת והווירוסים chikungunya לבודד antivirals ספקטרום רחב מספריות כימיות.

הקרנת תפוקה גבוהה לספקטרום רחב כימיים מעכבי RNA וירוסים

אנו מתארים את השימוש של וירוס vaccinia כתב ניאון המאפשר מדידה של infectivity הנגיפי וביטוי גנים בזמן אמת דרך הביטוי בשלב מסוים של fluorophores כתב ספקטרלית שונה. אנחנו פירוט שיטה המבוססת על צלחת לזיהוי מדויק השלב שבו שכפול נגיף מושפע בתגובה לעיכוב מולקולה קטן.

וירוסי כתב Vaccinia לכימות פונקציה ויראלי בכל השלבים של ביטוי גנים

כאן, מוצג פרוטוקול ליצירת כרומוזום מלאכותי חיידקי זיהומי המכיל cDNA באורך מלא של ה-RNA הגנומי החיובי של נגיף דלקת המוח היפני. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה לבניית cDNA פונקציונלי של נגיפי RNA חיוביים אחרים, מה שהופך אותו לכלי גנומי רב עוצמה לחקר ביולוגיה של נגיפים.

חיידקים מלאכותיים כרומוזומים: Genomics כלי פונקציונלי לחקר חיובי גדיל RNA וירוסים

מתוארות שיטות להערכת היעילות והרעילות של מולקולות RNA המכוונות לשלבים שלאחר האינטגרציה של מחזור השכפול של HIV-1. שיטות אלו שימושיות לסינון מולקולות חדשות ולאופטימיזציה של הפורמט של מולקולות קיימות.

הערכת היעילות והרעילות של RNAs מיקוד ייצור HIV-1 לשימוש ב ג&#39;ין או טיפול תרופתי

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים כדי לזהות immunomodulators 1) וירוס מקודד המקדמים arbovirus השכפול וגורמים מארח 2) האיקריוטים שמגבילות את שכפול arbovirus. שיטות אלה פלורסצנטיות הפריה חוץ גופית מבוססות מאפשרים להשיג במהירות את המפרט כמותית של שכפול arbovirus ב מבחני פשטני עם יחס אות לרעש נמוך.

זיהומים arbovirus כמו כלים ההקרנה לצורך זיהוי גורמים אנטי ויראלי Immunomodulators ומנחה

ניתוח תגובת שרשרת פולימראז כמותיים בזמן אמת בשילוב עם שעתוק במהופך (RT-qPCR) כבר בשימוש נרחב כדי למדוד את רמת זיהומים וירוס RNA. כאן אנו מציגים assay RT-qPCR ישיר, אשר אינה דורשת שלב טיהור RNA, שפותחה עבור כימות של כמה וירוסים RNA, כולל וירוס דנגה.

מדידת דנגה נגיף RNA תגובת שיקוע התרבות של תאים נגועים על ידי תגובת שרשרת של פולימראז כמותיים בזמן אמת

אנו מתארים שיטה ליצירת, הגברה גנטית שונה וירוסים syncytial הנשימה (RSVs) ואת וזמינותו של פלאק ממוטב עבור RSVs. אנו ממחישים לפרוטוקול זה על-ידי יצירת שני וירוסים רקומביננטי בהתאמה לאפשר כימות של שכפול RSV ולחיות ניתוח של RSV הכללה וגופי בגרגרים הכללה גופים הקשורים דינמיקה.

דור, הגברה, טיטור של Recombinant וירוסים Syncytial הנשימה

למדו כיצד למדוד שינויים בתעתוק תאי מארח לאחר זיהום בנגיף RVFV באמצעות כימיה לחץ. שיטה זו מאפשרת זיהוי RNA חדש ללא שימוש בחומרים רדיואקטיביים.

שימוש בכימיה לחץ כדי למדוד את ההשפעה של זיהום ויראלי בסינתזת RNA Host-Cell

גלה סרטונים נוספים