Name: קרום עמוד שדרה: ביוכימית כלי לזיהוי חלבונים אינטראקציות של חלבונים בממברנה בVivo (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-07T19:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: למדו שיטה ביוכימית לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון של חלבוני ממברנה בvivo באמצעות קשר צולב פורמלדהיד, טיהור אפיניות וספקטרומטריית מסה. שיטה זו מאפשרת גילוי אינטראקציות חולפות וחלשות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענקים של דויטשה Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 וSFB940 לSH

הערה: מידע מפורט לגבי מאגרים שצוינו בפרוטוקול נגיש בטבלה 1. 1. קיבוע של חלבונים אינטראקציות על ידי פורמלדהיד cross-linking בתאים חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל להכין את תקשורת צמיחה, פתרונות מניות וP1 החיץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 500 בינוני מיליליטר: הבינוני צריך לספק תנאים התומכים באינטראקציה בין חלבון פיתיון הממברנה וחלבונים טרף. בנוסף, ניסוי אחד צריכה להתבצע בתנאים בהם אין אינטראקציה צפויה (למשל ללא cross-linking). הערה: אנו משווים אינטראקציות בין חלבונים בחיידקים הדגישו ולא לחוצים. לכן, אנו מכינים 500 מיליליטר וריא Bertani בינוני (LB) (טבלת 1) שאנחנו משלימים עם סוכן וישכנע לחץ (למשל 0.5 M NaCl) בבקבוק 2 ליטר Erlenmeyer. לבקרה, אנו משתמשים במדיום LB נורמלי עם 0.17 M NaCl (pH 7.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן טריס-חיץ (20 מ&quot;מ טריס-HCl; pH 8.0) ו0.1 M חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA), פתרון ה-pH 8.0 המניה (טבלת 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן P1 חיץ. ממיסים סוכרוז לריכוז סופי של 0.5 M בטריס-חיץ. לעקר P1 חיץ על ידי סינון ולאחסן אותו ב 4 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים המבטאים את חלבון פיתיון הקרום עם פיוז&#39;ן סטרפטוקוקוס תג טרמינל C-מוקטור. לגרום לביטוי של חלבוני קרום פיתיון למספיק זמן. הערה: אנו לגרום לביטוי של חלבוני פיתיון קרום חיידק בשלב מוקדם יומן (600 = 0.3) על ידי תוספת של 250 μl M 1 איזופרופיל-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) 500 מיליליטר בינוני (ריכוז סופי: 0.5 מ&quot;מ) . כדי לאפשר ביטוי מספיק, אנחנו דגירה החיידקים עד השלב מאוחר ביומן (600 = 1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתכונן לכל תרבות שתי כוסות צנטריפוגות בהיקף מינימאלי של 300 מיליליטר כל אחד ומניח אותם על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פורמלדהיד cross-linking. CAUTION: פורמלדהיד הוא רעיל ביותר אנו ממליצים לעבוד תחת מנדף בטיחות.. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את כלי התרבות תחת מנדף בטיחות. פיצול כל דגימה לשתי דוגמאות, אחד השמטת cross-linking (- X) ואחד כולל פורמלדהיד cross-linking (+ X). הוסף 4 מיליליטר 37% תמיסת פורמלדהיד לתרבות מיליליטר 250 להגיע לריכוז סופי של .0.6%. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את כלי התרבות אחורה ולגדל תאים עבור 20 דקות נוספות כמו בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא תרבויותיך לתוך צינורות צנטריפוגה תחת מנדף בטיחות. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה ב3,000 XG במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ידי pipetting אותה בזהירות מתחת למכסה המנוע קטר בטיחות. איסוף supernatant המכיל פורמלדהיד הרעיל ולהיפטר ממנו כמו שצריך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להגיע לתשואה אופטימלית במהלך הכנת חלבון קרום, להכין spheroplasts הראשונה. כאן, אנו מספקים פרוטוקול להיווצרות spheroplast של חיידקים גראם שליליים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PreparP2 חיץ דואר (טבלה 1) מאבקת lyophilized. בעדינות לפזר 2 ליזוזים מ&quot;ג ב0.1 M EDTA, pH 8, בצינור 1.5 מיליליטר. תמיד להכין P2 חיץ טרי ליום של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן טריס-חיץ עם מעכבי פרוטאז (P3 חיץ). ל10 מיליליטר של טריס-חיץ, להוסיף 0.1 מיליליטר 1 M phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) (טבלת 1) לריכוז סופי של 10 מ&quot;מ. השתמש במאגר באופן מיידי, על מנת להבטיח תפקוד תקין של PMSF כמעכב פרוטאז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדורי תא גלול ב10 מיליליטר טריס-חיץ עם מעכבי פרוטאז ופתרון טרנספר לצינור חרוטי 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת P2 חיץ מיליליטר 1 ו לדגור על קרח למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף spheroplasts ידי צנטריפוגה ב3,000 XG במשך 30 דקות וזורקים supernatant בזהירות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את כדורי spheroplast הלילה ב -20 ° C. </li></ol> 2. טיהור של חלבון ממברנה סטרפטוקוקוס תג (פיתיון) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח גלולה spheroplast על קרח. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הזמן את כדורי spheroplast להפשיר על קרח, להכין 10 מיליליטר P3 חיץ עבור כל הכנת spheroplast. בעדינות לפזר מ&quot;ג DNaseI 1 ב10 מיליליטר טריס-חיץ. הוסף 0.1 מיליליטר PMSF M 1 רק לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור ב 6 מיליליטר P3 מוכן טרי. Sonicate המדגם ארבע פעמים ל1 דקות ברציפות על קרח עם הפסקה 1 דקות בין כל פרץ, במטרה לשבש spheroplasts. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה המדגם XG ב 10,000 במשך 10 דקות לפסולת תא קציר. מעביר את supernatant באמצעות פיפטה לצינור ultracentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה שבריר הקרום ב100,000 XG במשך 30 דקות. שטוף את הכדור בזהירות בטריס-חיץ ללא פירוקה. ייבש את הצינור עם ממחטת נייר (למשל קלינקס). הימנע מלהפריע גלולה בכל עת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור (= קרום) בזהירות ב1 מיליליטר טריס-חיץ. השתמש aliquot 20 μl כדי לקבוע את ריכוז החלבון על ידי assay BCA למשל. בשלב זה, את הקרומים ניתן הלם קפוא בliחנקן פאונד ומאוחסנים ב -80 ° C. </li></ol> 3. טיהור של סטרפטוקוקוס תג חלבון ממברנה פיתיון ו- SDS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את ריכוז החלבון של שבריר הקרום עד 5 מ&quot;ג / מיליליטר עם טריס-חיץ. קח 2.5 מיליליטר שבריר קרום (5 מ&quot;ג / מיליליטר) בצינור ultracentrifuge ולהוסיף 0.25 מיליליטר של 20% טריטון X-100 להגיע לריכוז סופי של 2%, על מנת solubilize החלבונים בממברנה. הוספת מוט מיקרו מגנטי ומערבבים על קרח במשך שעה 1. הערה: למרות שבאופן כללי יש לנו תוצאות טובות באמצעות טריטון X-100 כחומר ניקוי, זה יכול להיות שימושי כדי לשנות את חומר הניקוי לאופטימיזציה. במובן זה, יש לנו תוצאות הטובות ביותר עם ​​אלו חומרי ניקוי המשמשים לטיהור תפקודית של חלבון פיתיון קרום בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת ביצוע שלב 3.1, להכין 50 מיליליטר חיץ E W ו 5 מיליליטר חיץ מ( טבלה 1). מלא את 10 מיליליטר 5x ​​להתרכז W חיץ 50 מיליליטר ולהוסיף 150 μl 20% טריטון X-100. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא 1 מיליליטר 5x ​​buffeתרכיז r E ל10 מיליליטר ולהוסיף 30 μl 20% טריטון X-100. לאזן את זרימת עמודה הכבידה superflow סטרפטוקוקוס-Tactin 1 מיליליטר עם 8 וו מיליליטר החיץ שים לב: זה חיוני כדי להוסיף את חומר הניקוי המשמש לsolubilization בריכוז של פי 10 מעל הריכוז הקריטי micelle (CMC) בכל חיץ במהלך הליך הטיהור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מוט המייקר מגנטי ממדגם solubilization וultracentrifuge ב100,000 XG במשך 30 דקות, עד גלולה שבריר הקרום מסיס. הסר את supernatant באמצעות פיפטה לטיהור נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את supernatant לעמודה. הפעל את העמודה רק עם זרימת כוח הכבידה. לשטוף את העמודה עם 5 מיליליטר החיץ וו חזור על שלב זה הכביסה 5x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute חלבוני פיתיון קרום עם 1 מיליליטר חיץ א &#39;חזור על שלב elution זה 4x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתרכז שברים elution 2, 3, ו4-300 μl עם יחידת מסנן צנטריפוגלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 200 μl של כל דגימה עם 50 μl 5x SDS-PAGטעינת צבע E. פיצול כל הכנה ב125 aliquots μl. מרתיחים aliquot אחד מכל הכנה ל20 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, כדי להפוך קישורים צולבים פורמלדהיד. בואו דגימות להתקרר לRT לפחות 10 דקות על גבי ספסל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 30 μl מכל מדגם לנתיב יחיד של polyacrylamide ג&#39;ל מתאים לimmunoblotting. השתמש סמן משקל מולקולרי prestained להתמצאות הטובה ביותר ולהפעיל-SDS 10. </li></ol> 4. Immunoblot ניתוח לאישור שותפי אינטראקציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שצעד 3.8 הושלם, חלבוני העברה לממברנה ניטרוצלולוזה על ידי למשל semidry. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסום את הקרום כדי למנוע תיוג נוקב. הכן את חיץ חסימה על ידי שקילת אלבומין בסרום שור (BSA) כדי להשיג במשקל של 3% לכל נפח שבנאגר מלוח טריס בתוספת סופי ריכוז 0.05% 20-Tween (TBS-T). השתמש בנפח מספיק של חיץ חסימה כדי לכסות את הממברנה. לחסום את הקרום עבור שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדללnd דגירה הנוגדן הראשון הספציפי חלבון טרף כרגיל. השתמש בנוגדן HRP צמוד כנוגדן השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתח immunoblot באמצעות ערכת זיהוי chemiluminescent עם רגישות גבוהה. לנטר את האות באמצעות הליך עיבוד סרט קלאסי או ציוד הדמיה דיגיטלי. </li></ol> 5. ניסויי NanoLC-ESI-MS/MS רזולוציה גבוהה לזהות שותפי אינטראקציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה שאין נוגדן ספציפי זמין עבור חלבון הטרף או שותפי אינטראקציה ידועים צריך להיות מזוהה, השתמש ספקטרומטריית מסה (MS) לצורך זיהוי. על מנת למנוע זיהום קרטין, השתמש ג&#39;לי precasted להפרדת חלבונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסף להכתים-SDS באמצעות ערכת צביעת MS-תואם על פי הפרוטוקול של היצרן. לבצע את כל שלבי הצביעה ושטיפה במיכלי זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקות ובהתאמה בלו לנתח אלה על ידי LC ברזולוציה גבוהה / 9 טרשת נפוצה. </li></ol>

<ol><li>Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+transmembrane+protein+topology+with+a+hidden+markov+model%3A+application+to+complete+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes.</a> J. Mol. Biol. 305, 567-580 (2001).</li>
<li>Bakheet, T. M., Doig, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+and+identification+of+human+protein+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Properties and identification of human protein drug targets.</a> Bioinformatics. 25, 451-457 (2009).</li>
<li>Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-target+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Drug-target network.</a> Nat. Biotechnol. 25, (2007).</li>
<li>Daley, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly+of+membrane+proteins+into+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">The assembly of membrane proteins into complexes.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 420-424 (2008).</li>
<li>Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histidine+kinases+and+response+regulators+in+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Histidine kinases and response regulators in networks.</a> Curr. Opin. Microbiol. 15, 118-124 (2012).</li>
<li>Müller, V. S., Jungblut, P. R., Meyer, T. F., Hunke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-SPINE%3A+An+improved+method+to+identify+protein-protein+interaction+partners+of+membrane+proteins+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Membrane-SPINE: An improved method to identify protein-protein interaction partners of membrane proteins in vivo.</a> Proteomics. 11, 2124-2128 (2011).</li>
<li>Herzberg, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPINE%3A+A+method+for+the+rapid+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">SPINE: A method for the rapid detection and analysis of protein-protein interactions in vivo.</a> Proteomics. 7, 4032-4035 (2007).</li>
<li>Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+formaldehyde+cross-linking+and+mass+spectrometry+in+the+study+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions.</a> J. Mass Spectrom. 43, 699-715 (2008).</li>
<li>Hernandez, P., Müller, M., Appel, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+protein+identification+by+tandem+mass+spectrometry%3A+Issues+and+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Automated protein identification by tandem mass spectrometry: Issues and strategies.</a> Mass Spectrom. Rev. 25, 235-254 (2006).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Hunke, S., Keller, R., Müller, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+integration+by+the+Cpx-envelope+stress+system%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Signal integration by the Cpx-envelope stress system.</a> FEMS Microbiol. Lett. 326, 12-22 (2012).</li>
<li>Weber, R. F., Silverman, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cpx+proteins+of+Escherichia+coli+K12+%3A+Structure+of+the+CpxA+polypeptide+as+an+inner+membrane+component%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Cpx proteins of Escherichia coli K12 : Structure of the CpxA polypeptide as an inner membrane component.</a> J. Mol. Biol. 203, 467-478 (1988).</li>
</ol>

יש לנו מה למסור.

ניתוח עמוד שדרת ממברנה הוא גישה ביוכימית, המאפשרת אחד כדי לאשר ולזהות לשותפי שלב זה לא ידוע אינטראקציה של חלבונים בממברנה. עמוד שדרת קרום משלבת in vivo cross-linking ידי פורמלדהיד עם טיהור של חלבון פיתיון קרום סטרפטוקוקוס מתויג. שילוב עם immunoblotting מאפשר האישור של שותפי אינטראקציה ניבאו (איור 2). בנוסף, שילוב עם ניתוח MS מאפשר זיהוי של שותפי אינטראקציה לא ידועים (איור 3). עבור שניהם היישומים, אין דרישה לשינוי חלבון הטרף שלך. יתר על כן...

כדי להבין את תפקידו של חלבון זה חיוני לדעת שותפי האינטראקציה שלה. כמה טכניקות קלאסיות זמינות לזיהוי שותפי אינטראקציה של חלבונים מסיסים. עם זאת, טכניקות אלה אינן ניתנות להעברה בקלות לחלבוני קרום בשל האופי ההידרופובי שלהם 4. כדי להתגבר על מגבלה זו, פיתחנו ניסוי האינטראקציה סטרפטוקוקוס חלבון ממברנה (ממברנה-עמוד שדרה) 6. היא מבוססת על שיטת עמוד השדרה, שהייתה מתאים רק לחלבונים מסיסים 7. יתרונות קרום עמוד שדרה משני יתרונות של פורמלדהיד סוכן cross-linking: ראשון, פורמלדהיד יכול לחדור בקלות ממברנות ולכן מייצר תמונת מצב מדויקת של interactome של תא חי 8. שנית, יכולים להיות הפוכים קישורים צולבים פורמלין על ידי הרתחת 9. הנה, שני יתרונות אלו משמשים לזיהוי לא רק-PPI קבוע, אלא גם הגנה של מחזור החולף של קרוםתוספות 6. בקיצור, סטרפטוקוקוס תג הוא קבע את C-הסופית של חלבון פיתיון קרום נפרד. תאים המבטאים את חלבון פיתיון הקרום מודגרת עם פורמלדהיד אשר חוצה קישורים לטרוף חלבונים לחלבון פיתיון קרום (איור 1). שינויים של חלבוני טרף אין צורך. בשלב הבא, את החלק יחסי הקרום מוכן. לכן, חלבוני קרום solubilized על ידי טיפול בחומרי ניקוי ופיתיון חלבונים הם שיתוף מטוהר עם חלבוני הטרף שלה באמצעות טיהור זיקה. בהמשך לכך, הקישור הצולב מתהפך על ידי רותחים, ואת הפיתיון והחלבונים טרף שיתוף eluted-מופרדים על ידי-SDS. לבסוף, ניתן לזהות חלבוני טרף על ידי ניתוח immunoblot או ספקטרומטריית מסה.

<table><tbody><tr><td>37% פורמלדהיד</td><td>רוט</td><td>4979.1</td><td>לא צריך להיות מבוגר יותר משנה אחת</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>BCA ערכת בדיקת חלבון</td><td>פירס</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>מוט מיקרומגנטי</td><td>Roth</td><td>0955.2</td><td>5 מ"מ אורך, קוטר 2 מ"מ</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Roth</td><td>6683.1</td><td>חומר ניקוי סטנדרטי למסיסות</td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&beta;-maltoside</td><td>Glycon</td><td>D97002-C</td><td>חומר הניקוי הטוב ביותר להמסת CpxA</td></tr><tr><td>1 מ"ל Strep-Tactin Superflow עמודת זרימת כוח הכבידה</td><td>IBA</td><td>2-1207-050</td><td></td></tr><tr><td>Strep-tag חיץ לטיהור חלבון</td><td>SBA</td><td>2-1002-001</td><td>מכיל מאגר W ומאגר E</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 מסנן צנטריפוגלי</td><td>Millipore</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico מצע כימילומינסנט</td><td>Pierce</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>SilverQuest ערכת צביעת כסף</td><td>Invitrogen</td><td>LC6070</td><td></td></tr><tr><td>ערכת צביעת FireSilver</td><td>מפעל Proteome</td><td>P-S-2001</td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

קרום עמוד שדרה: ביוכימית כלי לזיהוי חלבונים אינטראקציות של חלבונים בממברנה בvivo

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

החלבונים בממברנה הם חיוניים ליכולת קיום של תאים ולכן הם מטרות טיפוליות חשובות 1-3. מאז הם פועלים במתחמים 4, שיטות לזיהוי ואפיון של האינטראקציות שלהם נחוצות 5. לשם כך, פיתחנו ניסוי ממברנה סטרפטוקוקוס חלבון האינטראקציה, הנקרא ממברנה עמוד השדרה 6. טכניקה זו משלבת in vivo cross-linking באמצעות פורמלדהיד צולב מקשר הפיך עם טיהור זיקה של חלבון פיתיון קרום סטרפטוקוקוס מתויג. במהלך ההליך, חלבוני טרף צולבים הם שיתוף מטוהר עם חלבון פיתיון הקרום ולאחר מכן הופרד על ידי רתחה. לפיכך, ניתן לבצע שתי משימות עיקריות בעת ניתוח אינטראקציות בין חלבונים (-PPI) של חלבונים בממברנה באמצעות ממברנה בעמוד שדרה: ראשון, האישור של שותף אינטראקציה שהוצע על ידי immunoblotting, ושנית, זיהוי שותפי אינטראקציה חדשים על ידי ניתוח ספקטרומטריית מסה . יתר על כן, גם אניow זיקה, PPIs החולף הוא לגילוי על ידי טכניקה זו. לבסוף, ממברנה שדרה להתאמה כמעט לכל סוג תא, מה שהופך אותו מתאים ככלי מיון רבי עוצמה כדי לזהות-PPI של חלבונים בממברנה.

ניתוח עמוד שדרת קרום מאפשר שיתוף הטיהור של חלבונים בממברנה ושותפי חלבון transiently אינטראקציה. שיתוף הטיהור מושגת על ידי השימוש בפורמלדהיד סוכן cross-linking. שני פרמטרים הם קריטיים כדי למנוע קישורים צולבים נוקבים: ריכוז הפורמלין וזמן cross-linking. השימוש מספק, אך לא מוגזם של פורמלדהיד בקלות יכול להיות נשלט על ידי immunoblotting. ניתן להפריד קומפלקסי חלבונים פורמלדהיד צולבים על ידי רתחה, אך לא על ידי טיפול SDS. לפיכך, הם יכולים להיות דמיינו לאחר סופג של חלבון פיתיון הקרום מתויג ...

גישת יוכימיים מתוארת לזהות באינטראקציות vivo חלבונים (PPI) של חלבונים בממברנה. השיטה משלבת צלב המקשר חלבון, טיהור זיקה וספקטרומטריית מסה, וניתנת להתאמה כמעט לכל סוג תא או האורגניזם. עם גישה זו, גם זיהוי של PPI החולף הופך לאפשרי.

קרום עמוד שדרה: ביוכימית כלי לזיהוי חלבונים אינטראקציות של חלבונים בממברנה בVivo

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות חלבון in vivo, אינטראקציות חלבון של חלבוני ממברנה באמצעות ניסוי אינטראקציה של חלבון סטרפטוקוקוס ממברנה או עמוד שדרה ממברנה. זה מושג על ידי קישור צולב in vivo באמצעות הקישור ההפיך לפורמלדהיד. השלב השני הוא טיהור חלבון פיתיון הממברנה המתויג בסטרפט יחד עם חלבוני הטרף הצולבים.לאחר מכן, הקישור הצולב מתהפך על ידי רתיחה. השלב האחרון הוא הפרדת חלבון פיתיון הממברנה וחלבוני הטרף המטוהרים על ידי סולפט נתרן דו-התפלה, אלקטרופורזה של ג'ל פולי אקרילאמיד או דף SDS. בסופו של דבר, ניתוח ספיגה חיסונית וספקטרומטריית מסה משמשים לזיהוי חלבוני הטרף, ומאפשרים ניתוח של אינטראקציות חלבון הממברנה.אני סבינה הונקה ונראה לכם היום את טכנולוגיית עמוד השדרה הממברנה. היתרון העיקרי של טכנולוגיה זו על פני שיטות קיימות כמו co IP, הוא שהיא מאפשרת לך אפילו לזהות זיקה נמוכה או אינטראקציות חלבון חולפות. קליין שאאנה תדגים לך את ההליך.היא אחת מתלמידי הדוקטורט שלי שפיתחו את הפרוטוקול כדי להתחיל בהליך זה, גידול תאי חיידקים המבטאים את חלבון פיתיון הממברנה עם היתוך תג סטרפטוקוקוס מסוף C גורמים לביטוי של חלבוני פיתיון ממברנה בשלב הלוג המוקדם על ידי תוספת של 0.5 מילי-מולרי IPTG ל-500 מיליליטר של מדיום כדי לאפשר ביטוי מספיק. דגרו על החיידקים עד לשלב היומן המאוחר. התכוננו לבצע קישור צולב פורמלדהיד מתחת למכסה אדים בטיחותי בגלל רעילות הפורמלדהיד.העבירו את כלי התרבות מתחת למכסה אדים בטיחותי. פצל כל דגימה לשתי דגימות, אחת משמיטה קישור צולב, ואחת, כולל קישור צולב פורמלדהיד. הוסף ארבעה מיליליטר של תמיסת פורמלדהיד 37% לתרבית של 250 מיליליטר כדי להגיע לריכוז סופי של 0.6%העבירו את כלי התרבות בחזרה וגדלו את התאים למשך 20 דקות נוספות כמו קודם.לאחר מכן מלאו את התרביות בצינורות צנטריפוגה מתחת למכסה אדים בטיחותי. אוספים את התאים על ידי צנטריפוגה ב -3000 פעמים G למשך 30 דקות. הסר את הסופרנטנט על ידי סילוק ושנית על ידי יניקה.בעזרת פיפטה מתחת למכסה אדים, השליכו את הסופרנטנטים המשליכים את הפורמלדהיד הרעיל המכיל סופרנטנט כראוי. על מנת להגיע לתפוקה אופטימלית במהלך הכנת חלבון הממברנה, ראשית, הכינו את פלטות Sphero כדי להתחיל להמיס בעדינות שני מיליגרם של ליזוזים ב-0.1 E-D-T-A-P-H מולארי שמונה בשפופרת של 1.5 מיליליטר. להכנת מאגר P שתיים, אותו יש להכין טרי ביום הניסוי.Resus משהה את כדורי התא ב-10 מיליליטר של בופר טריס סוכרוז שהוכן טרי עם מעכב פרוטאז, ומעביר את התמיסה לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ P שניים ודוגרים על קרח למשך 30 דקות. אוספים את פלטות ה-Sphero על ידי צנטריפוגה ב-3000 פעמים G למשך 30 דקות וזורקים את הסופרנטנט.דגרו בזהירות את כדורי הפלסט של Sphero למשך הלילה בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס בעבודה על קרח. Resus משהה את החיך של Sphero Plast בשישה מיליליטר של חיץ טרי שהוכן מראש. עמ' שלוש.סוניקציה של הדגימה ארבע פעמים למשך דקה אחת ברציפות על קרח עם הפסקה של דקה בין כל פרץ. על מנת לשבש את צנטריפוגת הפלסט Sphero הדגימה ב-10,000 פעמים G למשך 10 דקות כדי לקצור פסולת תאים לאחר צנטריפוגה. העבירו את הסופרנטנט באמצעות פיפטה לצינור אולטרה-צנטריפוגה.גלולה את שבר הממברנה ב 100, 000 פעמים G למשך 30 דקות. שטפו בזהירות את הגלולה ב-20 מילי-מולרי טריס בופר pH שמונה מבלי להמיס אותה. לאחר מכן סע צינור עם טישו נייר הימנע מהפרעה לגלולה בכל עת.כדי להשעות מחדש את הגלולה המכילה את הממברנות, הוסף מיליליטר אחד של טריס, חוצץ מוט מיקרו מגנטי והשעיה מחדש את הגלולה, חלקית עם פיפטה מערבבים על קרח למשך שעה, השתמש ב-20 מיקרוליטר כדי לקבוע את ריכוז החלבון. לנרמל את החלבון ריכוז שבר הממברנה לחמישה מיליגרם למיליליטר עם פיפטת חיץ טריס 2.5 מיליליטר משבר הממברנה לצינור אולטרה-צנטריפוגה ולהוסיף 0.25 מיליליטר של 20% טריטון X 100 כדי להגיע לריכוז סופי של 2% על מנת להמיס את חלבוני הממברנה. לאחר מכן מוסיפים מוט מיקרו מגנטי ומערבבים על קרח למשך שעה.אזן עמוד זרימת כוח משיכה של מיליליטר אחד עם שמונה מיליליטר של חיץ. W. הסר את המוט המיקרו מגנטי מדגימת המסיסות והאולטרה-צנטריפוגה ב-100, 000 פעמים G למשך 30 דקות כדי לגלול את שבר הממברנה הבלתי מסיס לאחר השלמת הריצה, הסר את ה-sate באמצעות פיפטה. לטיהור נוסף, מרחו את הסופרנטנט על העמודה באמצעות זרימת כוח הכבידה.שטפו את העמוד עם ארבעה מיליליטר חיץ W חוזרים על שלב הכביסה הזה חמש פעמים. לחסל את חלבוני פיתיון הממברנה עם מיליליטר אחד של מאגר E.חזור על פליטה זו. שלב ארבע פעמים, רכז את השברים המרומזים.שניים, שלושה וארבעה עד 300 מיקרוליטר עם יחידת פילטר צנטריפוגלית. מערבבים 200 מיקרוליטר מכל דגימה עם 50 מיקרוליטר של חמישה x כצבע לטעינת דפי DS. מחלקים כל תכשיר ל -125 מיקרוליטר לפני הרתיחה.מנה אחת מכל תכשיר למשך 20 דקות ב-95 מעלות צלזיוס כדי להפוך קישורים צולבים של פורמלדהיד. הניחו לדגימות להתקרר לטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לפחות על הספסל. עומס עליון 30 מיקרוליטר מכל דגימה לנתיב יחיד של ג'ל פולי אקרילאמיד המתאים לספיגה חיסונית.השתמש בסמן משקל מולקולרי צבוע מראש לכיוון הטוב ביותר ובצע כדף DS לאחר העברת חלבונים לקרום ניטרוצלולוזה. חסום את הממברנה כדי למנוע תיוג לא ספציפי למשך שעה. בטמפרטורת החדר, יש לדלל ולדגור על הנוגדן הראשוני הספציפי לחלבון הטרף.השתמש בנוגדנים המקושרים ל-HRP כנוגדנים משניים ופתח את הכתם החיסוני באמצעות ערכת זיהוי כימילומינסנט עם רגישות גבוהה. עקוב אחר האות באמצעות הליך עיבוד סרטים קלאסי או ציוד הדמיה דיגיטלי. אם אין נוגדן ספציפי זמין לטרף, לחלבון או לאינטראקציה לא ידועה, יש לזהות שותפים.השתמש בספקטרומטריית מסה או MS לזיהוי. צבע כסף את דף ה-SDS באמצעות ערכת צביעה תואמת MS. על פי פרוטוקול היצרן, בצע את כל שלבי הצביעה והכביסה במיכלי זכוכית.הסר את הרצועות המתאימות לפני ניתוחן על ידי LCMS ברזולוציה גבוהה כחלבון פיתיון. נעשה שימוש בחלבון הממברנה האינטגרלי CPXA של VISIA coli. CPXA הוא חיישן קינאז ומורכב מתחום חיישן מסוף N עם שני תחומים טרנסממברניים המשלבים תחום חיישן ציטופלזמי נוסף גדול ותחום קטליטי ציטופלזמי משומר מאוד במסוף C.לאחר הגירוי, CPXA מפעיל את מווסת התגובה הקוגנטית שלו, CPXR המופעל על ידי CPXR מתפזר כדי לתווך את התגובה לעמוד השדרה הממברני. תג הסטרפטוקוקוס אוחה לקצה C של CPX. ניתוח עמוד השדרה הממברנה מגלה כי סטרפטוקוקוס CPXA מקושר לחלבונים אחרים או קומפלקסים חלבונים המסומנים על ידי מריחה בדגימה שטופלה בפורמלדהיד שנחשפה.ללא טיפול בפורמלדהיד, מריחה זו נעדרת. יתר על כן, אינטראקציה ישירה של חלבון חלבון של סטרפטוקוקוס CPXA עם חלבון מווסת התגובה הקוגנטית שלו CPXR כחלבון הטרף ניתנת לזיהוי רק בנוכחות פורמלדהיד. תמיכה בספציפיות של קישור צולב פורמלדהיד עם מכתים כסף.ניכרת רצועה ספציפית לדגימה המבושלת. החץ מסמן רצועה שנותחה על ידי MS. ניתוח ואישר את CPXR כשותף האינטראקציה של CPXA. לאחר צפייה בסרטון זה, הוא אמור להבין היטב כיצד לשלב טיהור זיקה פרו וקישור צולב בספקטרומטריית מסה כדי לזהות שותפי אינטראקציה של חלבוני ממברנה.

membrane-spine-biochemical-tool-to-identify-protein-protein

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

וידאו זה מראה ניסויים עם ניתוח בדיעבד של חלבונים אינטראקציות על ידי שימוש במיקרו בדוגמת משטחים. הגישה מציעה את האפשרות לזהות אינטראקציות חלבון בתאים חיים, והוא משלב יכולות התפוקה גבוהה עם אפשרות לחלץ מידע כמותי.

In-vivo גילוי של חלבונים אינטראקציות על מיקרו-בדוגמת משטחים

חלבונים אינטראקציה בדיקה הכרחית לנתיחה של פונקציונליות חלבון. הנה, אנחנו...

חלבון ממברנה Assay Overlay: פרוטוקול בדיקת אינטראקציה בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים במבחנה</em

משטח Plasmon תהודה (SPR) היא שיטה ללא תווית לזיהוי אינטראקציות ביו-מולקולרי בזמן אמת. במסמך זה, פרוטוקול לחלבון קרום: ניסוי אינטראקציה קולט מתואר, תוך דיון על היתרונות וחסרונות של השיטה.

מדידות בזמן אמת של חלבון ממברנה: קולט אינטראקציות שימוש תהודה Plasmon Surface (SPR)

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקביעת הכיוון והטופולוגיה של חלבוני ממברנה אינטגרליים בתאים חיים. פרוטוקול פשוט זה מסתמך על רגישות סלקטיבית לפרוטאז של כימרות בין החלבון המעניין ל-GFP.

קביעת טופולוגיה חלבון ממברנה באמצעות הקרינה הגנת פרוטאז (FPP)

חלבונים רבים מבצעים את תפקידם כאשר הם מחוברים למשטחי הממברנה. ניתן לדמות בעקיפין את הקישור של חלבונים חיצוניים על ממברנות ננו-דיסק על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה. אנו מראים כי הערימה האופיינית (רולו) של ננו-דיסקים הנגרמת על ידי הכתם השלילי נתרן פוספוטונגסטט נמנעת על ידי קשירה של חלבון חיצוני.

השיטה לחזות ולנתח חלבוני אינטראקצית ממברנה ידי הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול קרום המוח פרוקציה המייצג תהליך חסון לבודד חלבונים השייכים תאים סינפטית שונים.

קרום המוח Fractation: An<em&gt; אקס ויוו</em&gt; גישה כדי להעריך לוקליזציה חלבון subsynaptic

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לנטר את הרכבה ופירוק של הרעלן גחלת באמצעות biolayer אינטרפרומטריה (בלי). בעקבות הרכבה/פירוק על פני ביוסנסור, משתחררים את מתחמי חלבון גדולה מפני השטח עבור פריט חזותי וזיהוי של רכיבי מתחמי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני ו ספקטרומטר מסה, בהתאמה.

ניתוח דינאמי חלבון מתחמי נאסף בנושא ושוחרר מן Biolayer אינטרפרומטריה ביוסנסור באמצעות ספקטרומטר מסה ואלקטרון

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור טכניקת העיכול על הקרום להכנת דגימות עבור ספקטרומטר מסה. טכניקה זו מקלה על ניתוח נוח של אינטראקציות חלבון-חלבון.

הערכה של אינטראקציות חלבונים-חלבונים באמצעות טכניקת העיכול האנטי-ממברנה

מוצג כאן הוא פרוטוקול לקביעת המצב האוליגומרי של חלבוני קרום המשתמשת במערכת ננו חלקיקים קרום התא המקומי בשילוב עם מיקרוסקופ אלקטרונים.

מערכת חלקיקי קרום התא המקורי לניתוח אינטראקציה של חלבון-חלבון קרום

מחקר זה מתאר את ההליך לשיקום חלבון הממברנה הרגיש לחומצה ב-TWIK, ערוץ K+ 2 (משימה 2) לננו-דיסקים. ההרכבה המוצלחת אושרה על ידי מיקרוסקופ קריו-אלקטרון חד-חלקיק, שהניב ממוצעים דו-ממדיים מוגדרים היטב.

טכניקה לייצוב חלבוני ממברנה בננו-דיסקים

למדו שיטה ביוכימית לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון של חלבוני ממברנה בvivo באמצעות קשר צולב פורמלדהיד, טיהור אפיניות וספקטרומטריית מסה. שיטה זו מאפשרת גילוי אינטראקציות חולפות וחלשות.

קרום עמוד שדרה: ביוכימית כלי לזיהוי חלבונים אינטראקציות של חלבונים בממברנה בVivo

גלה סרטונים נוספים