Name: מבחני לזיהוי של antivirals הרומן נגד וירוס Bluetongue (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-11T23:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: חקור זיהוי תרופות אנטי-ויראליות קטנות נגד וירוס Bluetongue באמצעות מבחני CPE, dose-response ו-Time-of-Addition. השיטה מאפשרת גילוש יעילות אנטי-ויראלית ורעילות נמוכה בתאים חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה מומן על ידי מענק 1R03MH08127-01 ו7R03MH08127-02 מ-NIH לש לי, ועל ידי קרנות IMPACT ממחלקה לרפואה ב UAB לש לי. תמיכה מקרן Molette ואוניברסיטת אובורן זוכה להערכה. אנו מודים גם assistances הטכני מהגב &#39;Pulin צ&#39;ה ומר ולדימיר Musiienko במהלך העבודה.

1. תאים, וירוסים והתרכובות אנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאים ב.ס. ר, נגזרת של כליות אוגר תינוק תאים (BHK) 10, במדיום של הנשר שונה Dulbecco (DMEM) המכילה 5% עוברי עגל בסרום (FCS), פניצילין 100U/ml ו100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל שלושת מבחני, תאי צלחת בDMEM עם FCS 1%, פניצילין 100U/ml ו100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, כמותאמים בעבר 5. בינוני זה התייחס כמדיום assay לכל שלושת מבחני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כל התאים בחממה על 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO 2 ולחות 80-95%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלאק-לטהר ולהפיץ את הסוג 10 BTV (BTV-10) כפי שתואר לעיל 8. לדלל BTV-10 במדיום assay עבור כל מבחני מיועדים לכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את כל חומרי הבדיקה בDMSO כדי ליצור מניות עם ריכוז ב10 מ&quot;מ. אחסן את המניות ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תרכובות לריכוזים רצויים באמצעות מדיום assay ללייעדמבחני ד 2. </li></ol> 2. Assay מבוסס CPE באמצעות ערכת CTG <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע ב.ס. ר לmicroplate 384 גם (שחור; פורמט ידי 16 x 24) באמצעות מתקן בחר MicroFlo. צפיפות הזריעה היא 5,000 תאים / היטב, וזריעת הנפח 20 μl לניתוח יעילות אנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים למשך 2-3 שעות עד שתאים מקבלים חסיד אל הצלחת ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת מתחם אנטי עם ריכוז סופי של 10 מיקרומטר היטב כל אחד. לערבב אותו לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל BTV לכייל רצוי ולהוסיף 5 BTV μl עם משרד הפנים מסומנים היטב כל אחד. לשליטה טובה, להוסיף 5 μl של תקשורת assay. דגירה התאים הנגועים ל72 שעות על 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO 2 ולחות 80-95%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב72 HPI, הפשרה ולאזן חיץ CTG ומצע CTG lyophilized לטמפרטורת חדר לפני השימוש. מחדש את הפתרון מגיב CTG הומוגנית על ידי ערבוב של האנזים / מצע lyophilized ומגיב חיץ על פי ההוראות יצרן דואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את צלחות assay לטמפרטורת חדר במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה (25 μl) של חומרים כימיים CTG היטב כל אחד על ידי מתקן. לאחר דוגרים במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר בחושך, למדוד אותות הארה באמצעות קורא מצב מרובה עם זמן אינטגרציה של 0.1 שניות. </li></ol> 3. Assay מנת התגובה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע ב.ס. ר לmicroplate 384 גם (שחור; פורמט ידי 16 x 24) באמצעות מתקן, עם צפיפות זריעה של 5,000 תאים / גם בזריעת נפח 20 μl עבור assay יעילות אנטי ו25 μl עבור assay cytotoxicity, בהתאמה . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים למשך 2-3 שעות על 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO 2 ולחות 80-95% עד תאים המחוברים היטב לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> assay תהליך באזור רבע מהצלחת 384 גם לכל מתחם (שווה ערך לצלחת 96 היטב), כפי שמוצג בטבלה 1. להקצות שמונה חזרות לכל ריכוזבassay אחד. הקצה את העמודה הראשונה כביקורת החיובית מבלי להוסיף מתחם ווירוס, והעמודה האחרונה (ה 12) כביקורת שלילית על ידי הוספת וירוס רק בלי תרכובות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תרכובות 50 מיקרומטר במדיום assay ולהוסיף לעמודה 2 nd ב20 μl / גם עבור assay יעילות אנטי. מערבבים את המתחם חמש פעמים באמצעות פיפטה חצי האוטומטית 8 ערוצים לריכוז של 25 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פיפטה חצי אוטומטית 8 ערוצים, להעביר 20 תערובת μl ב2 nd עמודה לעמודה הבאה (3 rd), ומערבב היטב כדי ליצור ריכוז של 12.5 מיקרומטר. חזור על תהליך זה על ידי העברת 20 תערובת μl מעמודת 3 ​​rd לעמודה הבאה (4 th) לצורה אחרת דילול כפול עם ריכוז של 6.25 מיקרומטר. חזור על הפעולה דילול סדרה כפול זה עד עמודת -11. לשאוב ולזרוק 20 μl של התערובת בעמודת ה 11 לאחר הוספת וערבוב compound. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת BTV-10, המבוסס על משרד הפנים של 0.01, לכל אחד גם מעמודה 2 לעמודה 11 בהיקף של 5 μl / טוב. לאחר הוספת הווירוס, ריכוז התרכובת הסופי בכל עמודה צריך להיות: 20 מיקרומטר בעמודה 2, 10 מיקרומטר בעמודה 3, והמשיך בדילול כפול למטה לעמודת 11 עם ריכוז סופי של 0.04 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של מדיום לעמודה 1 כתא שליטה בלבד (חיובית) וμl 5 / היטב BTV לעמודה 12 כזיהום BTV רק שליטה (שלילית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תרכובות לריכוז ראשוני של 200 מיקרומטר עבור assay cytotoxicity. בדומה לכך, להוסיף 25 μl / טוב של מתחם לעמודה 2 ומעורב 5x עם פיפטה חצי אוטומטית 8 ערוצים לריכוז של 100 מיקרומטר. אל תוסיף BTV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את דילול הסדרה הכפול על ידי aspirating 25 μl מעמודה 2 לעמודה 3 השכן, ונמשך עד העמודה האחרונה (ה 12). בעמודה 12, לאחר הערבוב, לשאוב ולזרוק 25 μl של מ &#39;ixture. הריכוז הסופי בעמודה 2 צריך להיות 100 מיקרומטר ועמודת ה 12 צריכה להיות ב0.2 מיקרומטר. עמודת 1 היא השליטה היחידה בתא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור שני מבחני יעילות ורעילים לתאי נגיפים, דגירה הצלחות על 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO 2 ולחות 80-95% ל72 לאחר טיפול שעה. למדוד כדאיות תא באמצעות ערכת CTG כפי שתואר לעיל (פרוטוקול הצעדים 2.5-2.7). </li></ol> 4. בזמן של תוספת Assay (TOA) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי הזרע ב.ס. ר מהעמודה 1-24 בmicroplate 384 גם (שחור; פורמט ידי 16 x 24) באמצעות מתקן ב5,000 תאים / היטב וזריעת הנפח 15 μl / טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל מתחם, לנצל את כל העשרים והארבע עמודות עם שמונה העתקים לכל נקודת זמן במחצית של צלחת 384 גם (טבלה 2). הקצה עמודת 1 כשליטה רק תאים על ידי הוספת 10 μl / גם מדיום assay. מארק עמודה 24 כזיהום BTV רק שליטה (בקרה שלילית) על ידי הוספה בינונית 5 μl / גם assayוירוס ד 5 μl / גם במשרד הפנים של 0.01 לנפח סופי של 25 μl / טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את העמודות הזוגיות מעמודת 2-22 עמודת הערכת יעילות אנטי כבשעות שלאחר זיהום שונה (HPI). בטורים אלה, להדביק תאים עם 5 μl / טוב BTV במשרד הפנים של 0.01. בHPI שונה, גם להוסיף 5 μl / מתחם מדולל היטב היטב כל אחד כדי ליצור נפח סופי של 25 μl / טוב. למסומן -2 ו -1 HPI להוסיף מתחם לתאים ב.ס. ר לפני הדבקת BTV. ל0 HPI, להוסיף את המתחם וBTV לתרבות בו זמנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל, לייעד את עמודות אי זוגיות מעמודת 3-23 כמתחם שולט בלבד, מתוכם מתחם נוספו בזמן נקודות שונות כמיועד (-2, -1, 0, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48 HPI). בטורים אלה, להוסיף 5 μl בינוני / טוב assay ו5 μl / מדולל היטב מתחם כדי ליצור נפח סופי של 25 μl / טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר טיפול, דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% לחות 2 עם 80-95% CO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע כדאיות תא ב72 HPI באמצעות ערכת CellTiter-Glo כפי שתואר לעיל (פרוטוקול הצעדים 2.5-2.7). </li></ol> 5. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את כל הנתונים הראשונים באמצעות תוכנה מתאימה בבית תוך שימוש באיתותים זורח הושגו באמצעות הקורא במצב מרובה. קבע את הערך הממוצע (הממוצע), סטיית תקן (STDEV) עבור כל טיפול, כמו גם וריאציות המקדם (CV), המחייב את ערך שאינו עולה על 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הנתונים המעובדים מהתוכנה הנ&quot;ל לכלי תוכנת biostatic והגרפי. לבצע את ניתוח רגרסיה שאינו ליניארי כדי לקבוע את הערכים של EC 50 ו50 CC. </li></ol>

<ol><li>Hemati, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bluetongue+virus+targets+conventional+dendritic+cells+in+skin+lymph%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph.</a> J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).</li>
<li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Virostatic+Agents+against+Bluetongue+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus.</a> PLoS ONE. 7, e43341(2012).</li>
<li>Meiswinkel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2006+outbreak+of+bluetongue+in+northern+Europe--the+entomological+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Prev.+Vet.+Med%22%5BJournal%5D)">The 2006 outbreak of bluetongue in northern Europe--the entomological perspective.</a> Prev. Vet. Med. 87, 55-63 (2008).</li>
<li>Szmaragd, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+and+case+fatality+during+the+recurrence+of+BTV-8+in+northern+Europe+in+2007%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Rec%22%5BJournal%5D)">Mortality and case fatality during the recurrence of BTV-8 in northern Europe in 2007.</a> Vet. Rec. 161, 571-572 (2007).</li>
<li>Li, Q., Maddox, C., Rasmussen, L., Hobrath, J. V., White, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+development+and+high+throughput+antiviral+drug+screening+against+Bluetongue+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Assay development and high throughput antiviral drug screening against Bluetongue virus.</a> Antiviral Research. 83, 267-273 (2009).</li>
<li>Noah, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-based+luminescence+assay+is+effective+for+high-throughput+screening+of+potential+influenza+antivirals%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals.</a> Antiviral Res. 73, 50-59 (2007).</li>
<li>Che, P., Wang, L., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development%2C+optimization+and+validation+of+an+assay+for+high+throughput+antiviral+drug+screening+against+Dengue+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Clin.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The development, optimization and validation of an assay for high throughput antiviral drug screening against Dengue virus.</a> Int. J. Clin. Exp. Med. 2, 363-373 (2009).</li>
<li>Li, Q., Li, H., Blitvich, B. J., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Aedes+albopictus+inhibitor+of+apoptosis+1+gene+protects+vertebrate+cells+from+bluetongue+virus-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Aedes albopictus inhibitor of apoptosis 1 gene protects vertebrate cells from bluetongue virus-induced apoptosis.</a> Insect Mol. Biol. 16, 93-105 (2007).</li>
<li>Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+MTT+and+ATP-based+assays+for+the+measurement+of+viable+cell+number%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biolumin.+Chemilumin%22%5BJournal%5D)">Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell number.</a> J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).</li>
<li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+%28BRSV%29+from+cDNA%3A+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture%2C+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> J. Virol. 73, 251-259 (1999).</li>
<li>Phillips, T., Jenkinson, L., McCrae, C., Thong, B., Unitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+high-throughput+human+rhinovirus+infectivity+cell-based+assay+for+identifying+antiviral+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a high-throughput human rhinovirus infectivity cell-based assay for identifying antiviral compounds.</a> J. Virol. Methods. 173, 182-188 (2011).</li>
<li>Harvey, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetracycline-inducible+packaging+cell+line+for+production+of+flavivirus+replicon+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Tetracycline-inducible packaging cell line for production of flavivirus replicon particles.</a> J. Virol. 78, 531-538 (2004).</li>
<li>Puig-Basagoiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+assays+using+a+luciferase-expressing+replicon%2C+virus-like+particles%2C+and+full-length+virus+for+West+Nile+virus+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 4980-4988 (2005).</li>
<li>Puig-Basagoiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triaryl+pyrazoline+compound+inhibits+flavivirus+RNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Triaryl pyrazoline compound inhibits flavivirus RNA replication.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 50, 1320-1329 (2006).</li>
<li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+protection+against+the+highly+pathogenic+H5N1+influenza+virus+by+an+antisense+phosphorothioate+oligonucleotide%5BTitle%5D)+AND+%22Antivir.+Ther%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo protection against the highly pathogenic H5N1 influenza virus by an antisense phosphorothioate oligonucleotide.</a> Antivir. Ther. 13, 109-114 (2008).</li>
<li>Ray, D., Shi, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+flavivirus+antiviral+drug+discovery+and+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Pat.+Antiinfect.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Recent advances in flavivirus antiviral drug discovery and vaccine development.</a> Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 1, 45-55 (2006).</li>
<li>Severson, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+a+100%2C000-compound+library+for+inhibitors+of+influenza+A+virus+%28H3N2%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of a 100,000-compound library for inhibitors of influenza A virus (H3N2).</a> J. Biomol. Screen. 13, 879-887 (2008).</li>
<li>Severson, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+high-throughput+screen+for+inhibitors+of+SARS+CoV+and+its+application+in+screening+of+a+100%2C000-compound+library%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a high-throughput screen for inhibitors of SARS CoV and its application in screening of a 100,000-compound library.</a> J. Biomol. Screen. 12, 33-40 (2007).</li>
<li>Bolken, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+potent+small+molecule+inhibitor+of+hemorrhagic+fever+New+World+arenaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Antivir.+Res%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses.</a> Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).</li>
<li>Van Loock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+high-throughput+cellular+screening+assay+for+the+discovery+of+HIV-1+integrase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors.</a> J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).</li>
<li>Kampmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+screening+of+small+molecule+libraries+using+the+dengue+virus+envelope+E+protein+has+identified+compounds+with+antiviral+activity+against+multiple+flaviviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses.</a> Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).</li>
<li>Kirchmair, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+anti-viral+agents+using+molecular+modeling+and+virtual+screening+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Disord.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques.</a> Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

לזיהוי הראשוני של להיטים אנטי, אחד הצעדים המרכזיים לגילוי תרופות אנטי ופיתוח הוא לפתח מבחני חזקים, הכולל בחירת סמן לכימות, פיתוח פרוטוקול פשוט, קבלת אותות מספיקים וקורות חיים פחות מ -10%. רוב המסכים ביוכימי או מבוסס תאים נועדו לספק נקודת התחלה כימית המבוססת על assay חזק ביותר, הפשוט וזול, בשל שחזור נדרש בתהליך המיון והמספר פוטנציאלי הגדול של מולקולות שיוקרנו. Assay מבוסס CPE היה מיועד כדי לעמוד בדרישות אלה כדי לזהות להיטים יעילים מספריית מתחם גדולה. CPE מתייחס להשפעה השלילית על הת...

BTV הוא וירוס RNA כפול גדילי אב טיפוס בסוג Orbivirus, משפחת Reoviridae. BTV הוא אחת המחלות החשובות ביותר של בעלי חיים מקומיים, ובם כבשים, עז, בקר וחיות בית אחרות, עם אובדן 3000000000 $ / שנה ברחבי העולם 1,2. סרוטיפ BTV האקזוטי הוא פתוגן בעלי חיים חשוב מופיע בסעיף &#39;פתוגנים משק החי התוצאה USDA גבוהה &quot;. לאחרונה, מחדש מתפתח של BTV גרם להתפרצות גדולה של מחלה בבקר וצאן במספר המדינות באירופה הצפונית 3,4. כתוצאה מהמשמעות הכלכלית שלה כמערכת מודל, BTV כבר את הנושא של מחקרים מולקולריים, גנטיים ומבניים נרחבים, ומספר חיסונים פותחו. עם זאת, בשל המחסור במבחנים ראויים לגילוי תרופות אנטי, אין antivirals זמין נגד BTV. בהקרנת תפוקה גבוהה לאחרונה במסע פרסום (HTS) תוך שימוש BTV כמערכת המודל, אנחנו דeveloped, מותאם ומאומתים assay מבוסס CPE לזהות antivirals ספקטרום רחב הפוטנציאלי נגד arboviruses 5. assay מבוסס CPE הוא assay מוכר היטב כי כבר בשימוש בגילוי תרופות אנטי נגד מספר הווירוסים שנגרם CPE / אפופטוזיס המהיר והנצפה 5-7. במערכת שלנו, זיהום BTV הודעה, CPE בא לידי ביטוי בתאים בעלי חוליות, כוללים הלה, ב.ס. ר, וHEK 293T 8. CPE-Induced BTV יכול להיות במעקב ולכמת באמצעות שיטות זיהוי כדאיות תא שונות, כוללים ערכת CellTiter Glo מגיב כדאיות תא (ערכת CTG) 9. ערכה זו קובע את מספר תאי קיימא בתרבות המבוססת על quantitation של ה-ATP הסלולרי הוצג, מה שמסמן את נוכחותם של תאי חיים פעילים מטבולית. בתנאים אופטימליים, מבוסס assay CPE מוצג כאן הראה ההיתכנות שלה עם הפרוטוקול &quot;לערבב ולמדוד&quot; צעד אחד, וגמישות עם אותות זורח יציבים. בינתיים, Redu תרכובות רעילותcing כדאיות תא לא ייכללו בassay מבוסס CPE זה. Assay מבוסס CPE הראה עמיד ואמין לגילוי תרופה אנטי נגד BTV שלה, ומאז משמש למסך NIH הספריות מולקולריות המולקולה קטנה Repository (MLSMR), מה שמוביל לזיהוי של שישה אשכול רומן של מתחם להוביל אנטי פוטנציאלי (ים &#39;) 5. כאשר תרכובת אנטי פוטנציאלית זוהתה באמצעות assay מבוסס CPE, זה יהיה צריך להיות חשוף לassay מנת תגובת עשר הריכוז כדי לקבוע את טווח היעילות וcytotoxicity 2 אנטי. היעילות אנטי, מיוצג כ50% הריכוז המעכב (50 IC) או 50% הריכוז היעיל (50 EC), היא הריכוז של תרופה אשר מעכבת באמצע הדרך CPE-induced וירוס בין קו הבסיס והמקסימום. Cytotoxicity של antivirals, כלומר ריכוז 50% cytotoxicity (CC 50), הוא הריכוזשל תרופת גרימת 50% מcytotoxicity בין קו הבסיס והמקסימום. המדד סלקטיבית (SI), מסומן כ50% SI (50 SI) מחושב מCC 50 / IC 50 הקובע את הספציפיות של נגיפים נגד CPE-induced וירוס. IC 50 (או 50 EC), CC 50 וSI 50 ערכים הם צעדים קריטיים כדי לקבוע אם תרכובת אנטי היא חזקה ובררנית לפיתוח תרופות נוסף. כאשר נגיפים לא הראו כל רעילות גלויה במבחנה, אך וירוס מנע מושרה CPE ומחזור החיים הנגיפי היעיל, חשוב לאפיין משרד החקלאות שלה 2. אנחנו יזמנו אפיון כזה על ידי ביצוע assay TOA כדי לקבוע את הצעד האפשרי (ים) של מחזור החיים נגיפי שמושפע אנטי. באופן כללי, מתחם אנטי נוספו לתאים בזמנים שונים מראש או זיהום שלאחר וירוס. אם antivirals נוספו לתאים הנגועים לפרסם ליעד שלהTEP במהלך ההדבקה, הוא יביא לפעילות נמוכה יותר בהשוואה לזו שהתווסף לפני הצעד. לכן, מחקר TOA הוא קריטי לקביעת היעילות אנטי של מתחם, והיעד הפוטנציאלי שלו, או על מחזור החיים הנגיפי או מכונות המארח מעורבות במחזור החיים הנגיפי. לכל שלושת מבחני, כדאיות תא נקבעה באמצעות ערכת CTG בעקבות ההוראה של היצרן 5. מערכת זיהוי זה פלטי אותות הארה הולמים שיכול להיות מנותח באמצעות תוכנות שונות בבית. כל assay קבל תוקף ומתבצע לפחות בשלושה העתקים עם שמונה העתקים. לכל הנתונים שהתקבלו, שלושה פרמטרים, כולל ערך ממוצע (AVE), סטיית תקן (STDEV), ווריאצית שיתוף יעיל (CV) נותחו על מנת לקבוע את החוסן של assay. ברגע שהחוסן של assay נקבע, הנתונים ינותחו נוספים וזממו באמצעות יוסטאטיקה וgraphi שוניםכלים ג 2.

<table><tbody><tr><td>DMEM בינוני</td><td>Gibco</td><td>1134218</td><td>לתרבית תאים</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td>לתרבית תאים</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>1000185</td><td>לתרבית תאים</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gbico</td><td>1049769</td><td>לתרבית תאים</td></tr><tr><td>ערכת CellTiter-Glo (CTG) Promega</td><td></td><td>TB288</td><td>למדידת כדאיות תאים</td></tr><tr><td>70% אתנול</td><td>פישר</td><td>S25309B</td><td>מדולל מ-95%</td></tr> <tr><td>תרכובות הואשיל אנטי-ויראליות</td><td>NIH MLSMR וסינתזה</td><td></td><td></td>דה נובו</tr><tr><td>BTV-10</td><td>ATCC</td><td>VR-187</td><td></td></tr><tr><td>תא BSR</td><td>פותח בבית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy-II קורא מיקרו-פלטות רב-מצבי</td><td>BioTek</td><td></td><td>לקריאת אותות זוהרים</td></tr><tr><td>מתקן</td> <td>בחירה MicroFloBioTek</td><td></td><td>הוספת תאים, וירוסים וריאגנטים</td></tr><tr><td>384 בארות מיקרו-פלטה</td><td>שטוחה CORNING</td><td>28908031</td><td>לתרבית תאים</td></tr><tr><td>Gen. 5 תוכנה</td><td>BioTek</td><td></td><td>לניתוח תפוקות קריאה מקורא מיקרו-פלטות רב-מצבי Synergy-II</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5</td><td>GraphPad</td><td>גרסה 5</td><td>לניתוח ביוסטטי ועלילה</td></tr></tbody></table>

מבחני לזיהוי של antivirals הרומן נגד וירוס bluetongue

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

לזהות antivirals הפוטנציאלי נגד BTV, פיתחנו, מותאם ומאומתים שלושה מבחני שהוצגו כאן. Assay מבוסס CPE היה assay הראשון שפותח כדי להעריך אם מתחם הראה שום יעילות אנטי ושמש למסך ספריית מתחם גדולה. בינתיים, cytotoxicity של antivirals יכול גם להיות מוערך באמצעות assay מבוסס CPE. Assay מנת התגובה נועד לקבוע את טווח היעילות לנגיפים שנבחרו, כלומר 50% ריכוז מעכב (IC 50) או ריכוז יעיל (50 EC), כמו גם מגוון של cytotoxicity (CC 50). Assay TOA הועסק ללימוד משרד החקלאות הראשוני כדי לקבוע את המנגנון הבסיסי של antivirals הרומן במהלך מחזור חיים נגיפיים BTV או ההשפעה האפשרית על מנגנון תאי מארח. מבחני אלה הם חיוניים להערכת יעילות אנטי במערכת תרבית תאים, והיה בשימוש במשך המחקרים האחרונים שלנו להובילing לזיהוי של מספר התרופות אנטי רומן נגד BTV.

1. יעילות אנטי של מתחם Assay CPE מבוסס התאים פותח, מותאם ותוקף במבחנה באמצעות ערכת CTG מבוסס זורח לזהות antivirals רומן נגד BTV כפי שתואר לעיל 2,5. Assay התגובה עשרה המינון הועסק כדי לשקף את היעילות ורעילה לתאי נגיפים של מתחם להוביל זוהה על ידי מדידת מספר תאי קיימא מטבולית בתרבות המבוססת על quantitation של ה-ATP הסלולרי הוצגה בתאים חיים 5,11. בדו"ח הקודם שלנו, מספר התרכובות אנטי פוטנצי...

שלושה מבחני, כולל השפעת cytopathic (CPE) מבוססת assay, assay מנת התגובה וassay בזמן של תוספת (TOA) פותחו, אופטימיזציה, תוקף ומנוצל כדי לזהות antivirals רומן נגד וירוס Bluetongue (BTV), כמו גם כדי לקבוע את הפעולה מנגנון-of-האפשרית (משרד חקלאות) לantivirals זיהה לאחרונה.

מבחני לזיהוי של antivirals הרומן נגד וירוס Bluetongue

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות ולאפיין תרופות אנטי-ויראליות של מולקולות קטנות כנגד נגיף הלשון הכחולה או BTV באמצעות בדיקת כדאיות תאים מבוססת CPE. זה מושג על ידי סינון ראשון של ספרייה של תרכובות אנטי-ויראליות באמצעות אפקט ציטופתי או בדיקה מבוססת CPE עם מגיב זוהר טיטר התא. לאחר מכן, היעילות האנטי-ויראלית מאושרת והציטוטוקסיות של תרופות אנטי-ויראליות נבחרות מוערכת באמצעות בדיקת תגובת המינון.לבסוף, זמן בדיקת ההוספה מתבצע כדי לקבוע את שלב מחזור החיים הנגיפי האפשרי של אנטי-ויראלים נבחרים המוביל למנגנוני הפעולה האפשריים. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות אנטי-ויראלים חדשים עם CIE אנטי-ויראלי חזק וציטוטוקסיות נמוכה בהתבסס על בדיקת תגובת המינון וזמן בדיקת ההוספה. אז היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות כמו בדיקת TCI D 50 בבדיקת פלאק הוא שטכניקה זו מספקת רגיש, חזק ורבייה מאוד בשיטה המדידה לסינון וסיווג אנטי-וירוס כנגד נגיפים מסוימים, כולל נגיף גלוטן, הגורם ל-CP מדיד בתאי תאים נגועים כהכנה לבדיקה מבוססת CPE מתאי BSR הנשמרים בתוספת DMEM השתמש במתקן בחירת מיקרו-זרימה כדי זרע 20 מיקרוליטר של תאים ב-5,000 תאים לבאר לתוך 384.ובכן, מיקרופלייט דוגר על התאים למשך שעתיים-שלוש כדי לאפשר להם להיצמד במלואם לצלחת, ואז להוסיף תרכובות אנטי-ויראליות בריכוז סופי של 10 מיקרומולר לכל באר ולער

assays-for-identification-novel-antivirals-against-bluetongue

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

שיטה פשוטה כתם חריץ פותחה עבור כימות של hemagglutinin שפעת ויראלי neuraminidase באמצעות נוגדנים אוניברסלי מיקוד רצפים שימור ביותר שלהם מזוהה באמצעות ניתוחים ביואינפורמטיקה. גישה חדשנית זו עשויה לספק חלופה שימושי להגדרה כמותית של hemagglutinin כל נגיפיים neuraminidase.

ניתוח כמותי של השפעת כל סוג Hemagglutinins ויראלי ו Neuraminidases באמצעות נוגדנים יוניברסל מבחני כתם פשוט חריץ

כאן, אנו מציגים פרוטוקול הבוחן שלבים ספציפיים של הכניסה הנגיפית כדי לזהות ולהעריך חומרים אנטי-ויראליים חדשים.

מבחני ויראלי המוקדם כניסה לזיהוי והערכה של אנטי תרכובות

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים כדי לזהות immunomodulators 1) וירוס מקודד המקדמים arbovirus השכפול וגורמים מארח 2) האיקריוטים שמגבילות את שכפול arbovirus. שיטות אלה פלורסצנטיות הפריה חוץ גופית מבוססות מאפשרים להשיג במהירות את המפרט כמותית של שכפול arbovirus ב מבחני פשטני עם יחס אות לרעש נמוך.

זיהומים arbovirus כמו כלים ההקרנה לצורך זיהוי גורמים אנטי ויראלי Immunomodulators ומנחה

פרוטוקול זה מציג נוהל הפעלה מעבדה סטנדרטית עבור בדיקות אבחון של אנטיגנים lyssavirus ירוס בעטלפים בטייוואן.

נוהל הפעלה רגיל של מעקב וירוס של אוכלוסיית העטלף בטייוואן

פאן-lyssavirus וירוס שעתוק הפוכה התגובה שרשרת פותחה כדי לזהות במיוחד את כל lyssavirus ידוע. אימות באמצעות דגימות מוח של כלבת ממינים שונים של בעלי חיים הראו כי שיטה זו יש רגישות וספציפיות שוות ערך לבדיקת נוגדן הפלורסנט הסטנדרטית וניתן להשתמש בה לאבחון כלבת שגרתית.

הערכה של מקונן אוניברסלי הפוכה תגובת שרשרת פולימראז לאיתור של Lyssaviruses

כאן אנו מתארים בעקיפין כריך מחלה אימונואפלטיוט כדי לקבוע את התוכן החיסוני גליקופרוטאין בחיסון כלבת. מבחן זה משתמש נוגדן מונושבטיים (mAb-D1) לזהות גליקופרוטאין טרימרס. זוהי חלופה למבחן vivo NIH לבצע את העקביות של עוצמת החיסון במהלך הייצור.

בדיקת מחוץ גופית מבחן להערכת כלבת חיסון עוצמת

זה בזמן אמת RT-PCR באמצעות הצבע הintercalating מתאים לאבחן זיהומים lyssavirus ירוס. השיטה מתחילה עם רנ א שחולצו מפני חשד כלבת לאחר המוות או דגימות שלאחר המוות, המפרט הכנה לערבב הורים, הוספת RNA, ההתקנה של מכונת בזמן אמת ופרשנות נכונה של תוצאות.

הפאן-lyssavirus בזמן אמת RT-PCR לאבחון כלבת

מטרת הפרוטוקול היא להמחיש את הנושא השונה המתייחס לערך ויראלי שניתן להשתמש בו כדי לזהות מעכבי כניסה ויראלית של מועמד.

שימוש בעלי כניסה ויראלי וניתוח עגינה מולקולרית לזיהוי מועמדים אנטי-ויראליים A16

אנו מציגים פרוטוקול מלאה לאבחון שלאחר המוות של כלבת בעלי חיים תחת תנאי שדה באמצעות מבחן חיסוני מהיר האבחון (RIDT), מן הבדיקה ביופסיה המוח לפרשנות הסופי. אנו גם לתאר יישומים נוספים באמצעות המכשיר לניתוח מולקולרי הגנוזות ויראלי.

שדה הנתיחה לאחר המוות חיסוני מהיר מבחן אבחון עבור הגדרות מוגבלות משאב עם יישומים מולקולריים נוספים

בעבודה זו, אנו מתארים את הפרוטוקולים המשמשים בבדיקות מבוססות אנזים מבוססות replicon ויראלי כדי לסנן מעכבים של שכפול וירוס זיקה בפורמט הקרנה תפוקה גבוהה.

בדיקות אנטי-ויראליות בעלות תפוקה גבוהה למסך עבור מעכבי שכפול וירוס זיקה

מאמר זה מתאר את המתודולוגיה ליצירת חלקיקים מדומים מסוג SARS-CoV-2 באמצעות מערכת מדווח לוסיפראז ואת השימוש בה לזיהוי מעכבי כניסה. פרוטוקולים אלו מודגים באמצעות שני מעכבי כניסה שונים: חלבון מיזוג ACE2-Fc האנושי רקומביננטי והתרכובת המולקולית הקטנה ארבידול.

נהלים לזיהוי מעכבי כניסה ל-SARS-CoV-2 כאנטי-ויראליים פוטנציאליים באמצעות פסאודו-וירוסים מבוססי MLV

חקור זיהוי תרופות אנטי-ויראליות קטנות נגד וירוס Bluetongue באמצעות מבחני CPE, dose-response ו-Time-of-Addition. השיטה מאפשרת גילוש יעילות אנטי-ויראלית ורעילות נמוכה בתאים חיים.

מבחני לזיהוי של antivirals הרומן נגד וירוס Bluetongue

גלה סרטונים נוספים