מבחני לזיהוי של antivirals הרומן נגד וירוס Bluetongue

שלושה מבחני, כולל השפעת cytopathic (CPE) מבוססת assay, assay מנת התגובה וassay בזמן של תוספת (TOA) פותחו, אופטימיזציה, תוקף ומנוצל כדי לזהות antivirals רומן נגד וירוס Bluetongue (BTV), כמו גם כדי לקבוע את הפעולה מנגנון-of-האפשרית (משרד חקלאות) לantivirals זיהה לאחרונה.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות ולאפיין תרופות אנטי-ויראליות של מולקולות קטנות כנגד נגיף הלשון הכחולה או BTV באמצעות בדיקת כדאיות תאים מבוססת CPE. זה מושג על ידי סינון ראשון של ספרייה של תרכובות אנטי-ויראליות באמצעות אפקט ציטופתי או בדיקה מבוססת CPE עם מגיב זוהר טיטר התא. לאחר מכן, היעילות האנטי-ויראלית מאושרת והציטוטוקסיות של תרופות אנטי-ויראליות נבחרות מוערכת באמצעות בדיקת תגובת המינון.

לבסוף, זמן בדיקת ההוספה מתבצע כדי לקבוע את שלב מחזור החיים הנגיפי האפשרי של אנטי-ויראלים נבחרים המוביל למנגנוני הפעולה האפשריים. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות אנטי-ויראלים חדשים עם CIE אנטי-ויראלי חזק וציטוטוקסיות נמוכה בהתבסס על בדיקת תגובת המינון וזמן בדיקת ההוספה. אז היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות כמו בדיקת TCI D 50 בבדיקת פלאק הוא שטכניקה זו מספקת רגיש, חזק ורבייה מאוד בשיטה המדידה לסינון וסיווג אנטי-וירוס כנגד נגיפים מסוימים, כולל נגיף גלוטן, הגורם ל-CP מדיד בתאי תאים נגועים כהכנה לבדיקה מבוססת CPE מתאי BSR הנשמרים בתוספת DMEM השתמש במתקן בחירת מיקרו-זרימה כדי זרע 20 מיקרוליטר של תאים ב-5,000 תאים לבאר לתוך 384.

ובכן, מיקרופלייט דוגר על התאים למשך שעתיים-שלוש כדי לאפשר להם להיצמד במלואם לצלחת, ואז להוסיף תרכובות אנטי-ויראליות בריכוז סופי של 10 מיקרומולר לכל באר ולערבב לחלוטין. השתמש במדיום בדיקה כדי לדלל את הפלאק, מטוהר ומופץ BTV לטיטר הרצוי והוסף חמישה מיקרוליטר של BTV עם MOI מסומן לכל באר לצורך הבקרה. ובכן הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של מדיום בדיקה, הכניסו קופסה רטובה המכילה את לוחית הבדיקה לתוך החממה ודגרו על התאים הנגועים למשך 72 שעות ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ו-80 עד 95% לחות.

לאחר מכן הוציאו את לוחית הבדיקה מהחממה, לאחר מכן הפשירו ואזנו את מאגר ה-CTG ואת מצע ה-CTG הליופילי לטמפרטורת החדר. לאחר מכן הרכיבו מחדש את תמיסת ריאגנט ה-CTG ההומוגנית על ידי ערבוב מצע האנזים הליופילי ומגיב החיץ בהתאם להוראות היצרן. לאחר איזון לוחות הבדיקה לטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, השתמש במתקן כדי להוסיף 25 מיקרוליטר של ריאגנטים CTG לכל באר דגירה למשך 15 דקות בחושך לפני שימוש בקורא רב-מצבי עם זמן אינטגרציה של 0.1 שניות למדידת אותות זוהרים זרע 5,000 תאי BSR לבאר ב-384 בארות מיקרופלייט לבדיקת תגובת המינון באמצעות 20 מיקרוליטר לבדיקת היעילות האנטי-ויראלית ו-25 מיקרוליטר עבור בדיקת הציטוטוקסיות.

לאחר דגירה של שעתיים-שלוש, הקצו שמונה שכפולים לכל ריכוז של תרכובת לכל בדיקה כפי שמוצג כאן. הקצה את העמודה הראשונה כבקרה חיובית מבלי להוסיף תרכובת או וירוס ואת העמודה האחרונה כבקרה שלילית על ידי הוספת וירוס רק לבדיקת היעילות האנטי-ויראלית תרכובות מדוללות ל-50 מיקרומולר במדיום הבדיקה ולעמודה השנייה הוסף 20 מיקרוליטר לבאר. באמצעות פיפטה חצי אוטומטית בעלת שמונה ערוצים.

מערבבים את התרכובת חמש פעמים לריכוז של 25 מיקרומולר. לאחר מכן, העבירו 20 מיקרוליטר מהתערובת בעמודה השנייה לעמודה שלוש וערבבו היטב, וכתוצאה מכך ריכוז של 12.5 מיקרומולר. חזור על זה פעמיים.

דילול סדרתי עד העמודה ה -11, שיהיה לו ריכוז סופי של 0.04 מיקרומולר. לאחר מכן הוסף חמישה מיקרוליטרים של מדיום לעמודה אחת כבקרה חיובית בלבד בתא וחמישה מיקרוליטר לבאר BTV לעמודה 12 כזיהום BTV בלבד. בקרה שלילית מוסיפה חמישה מיקרוליטר לבאר BTV מעמודה 2 עד עמודה 11 לבדיקת הציטוטוקסיות, מדללת את התרכובת לריכוז ראשוני של 200 מיקרומולר.

הוסף 25 מיקרוליטר לבאר תרכובת לעמודה השנייה וערבב חמש פעמים כדי להביא את הריכוז ל -100 מיקרומולר. בצע את דילול הסדרה הכפולה על ידי העברת 25 מיקרוליטר מעמודה שתיים לעמודה הסמוכה שלוש והמשך דרך עמודה 12. לאחר ערבוב עמודה 12, שואבים וזורקים 25 מיקרוליטר מהתערובת.

עמודה ראשונה היא הבקרה היחידה של התא הן עבור הבדיקות האנטי-ויראליות והן עבור מבחני הציטוטוקסיות. הכניסו קופסה רטובה המכילה את לוחית הבדיקה לחממה למשך 72 שעות והוציאו את הצלחת לאחר מכן. לאחר מכן השתמש בערכת CT G כדי למדוד את כדאיות התא.

השתמש בתוכנה ביוסטטיסטית וגרפית כדי לחשב את הערך הממוצע, שינויים במקדם סטיית התקן ואחוז כדאיות התא עבור כל ריכוז תרכובת ובצע ניתוח רגרסיה לא ליניארי כדי לקבוע את ה-EC 50 ו-CC 50 של כל תרכובת. התכוננו לזמן ההוספה או בדיקת TOA על ידי זריעת 5,000 תאים לבאר ב-15 מיקרוליטר בעמודה 1 עד 24 מתוך 384. ובכן מיקרופלייט לכל תרכובת.

השתמש בכל 24 העמודות עם שמונה שכפולים עבור כל נקודת זמן. הקצה את העמודה הראשונה כבקרת תאים בלבד על ידי הוספת 10 מיקרוליטר לבאר של בדיקת עמודה בינונית 24 כזיהום BTV בלבד. שליטה שלילית על ידי הוספת חמישה מיקרוליטר לבאר של מדיום בדיקה וחמישה מיקרוליטר לבאר של נגיף ב-MOI של 0.01.

בנפח סופי של 25 מיקרוליטר לבאר בחר את העמודות הממוספרות הזוגיות מעמודה שתיים עד 22 כעמודות הערכת יעילות אנטי-ויראליות בשעות שונות לאחר ההדבקה או HPI בעמודות אלה, תאים מדביקים עם חמישה מיקרוליטר לבאר BTV ב-MOI של 0.01 ב-HPI שונה מוסיפים גם חמישה מיקרוליטר לבאר של תרכובת מדוללת בנפח סופי של 25 מיקרוליטר לבאר עבור המסומן מינוס שניים ו מינוס HPI אחד. הוסף את התרכובת לתאי BSR לפני זיהום BTV לאפס HPI הוסף את התרכובת ואת ה-BTV לתרבית בו זמנית. במקביל, הקצה את העמודות האי-זוגיות משלוש עד 23 כפקדים מורכבים בלבד המתאימים לנקודות הזמן השונות בעמודות אלה.

הוסף חמישה מיקרוליטר לבאר של מדיום בדיקה וחמישה מיקרוליטר לבאר של תרכובת מדוללת בנפח סופי של 25 מיקרוליטר לבאר. לאחר הדגירה של התאים ל-72 HPI באינקובטור, הוציאו את לוחית הבדיקה והשתמשו בערכת הזוהר של טיטר התאים כדי לקבוע את כדאיות התא. לבסוף, השתמש בתוכנה המעבדת אותות זוהרים המתקבלים באמצעות הקורא הרב-מצבי כדי לקבוע את הערך הממוצע.

S-T-D-E-V CV ואחוז כדאיות תאי ההגנה עבור כל טיפול באמצעות מבחן CPE לכימות A TP תאי בתאים חיים, זיהינו בעבר מספר תרכובות עופרת מבטיחות עם יעילות אנטי-ויראלית חזקה, רעילות נמוכה וסלקטיביות גבוהה. לדוגמה, לתרכובת 0 5 2 נקבע כי יש EC 50 של 0.27 פלוס או מינוס 0.12 מיקרומולר ו-CC 50 של 82.69 מיקרומולר שניהם מציגים עקומות רגרסיביות אופייניות. תחת ניתוח ניתוחי הרגרסיה הלא ליניארית, נקבע כי 306 בהתבסס על ערכי EC 50 ו-CC 50 שלו, היעילות האנטי-ויראלית בקנה מידה ננו-מולארי, רעילות נמוכה, וכתוצאה מכך SI 50 גבוה הצביע על כך ש-C 0 5 2 עשוי להיות אנטי-ויראלי חזק וסלקטיבי נגד BTV כפי שניתן לראות כאן, התאים נדבקו ב-BTV ב-MOI של 0.01 בנוכחות 10 ריכוזים שונים של C 0 5 2 וכדאיות התאים נקבעה ב-72 HPI.

באמצעות ערכת CTG, כל נקודת נתונים מייצגת אמצעים ו-SD מחמישה שכפולים. בדיקת TOA שימשה לקביעת השלבים האפשריים של מחזור החיים הנגיפי הממוקד על ידי תרכובות. כאשר C 0 5 2 נוסף שעה או שעתיים לפני ההדבקה ב-BTV, היעילות האנטי-ויראלית נותרה בקנה מידה ננו מולארי כפי שניתן לראות באיור זה.

בנוסף, כדאיות התאים ירדה עוד יותר כאשר C 0 5 2 נוסף ב-32 ו-48 HPI, מה שמצביע על כך ש-C 0 5 2 עשוי לפעול מעבר לשלב המוקדם של מחזור החיים הנגיפי, כגון כניסת הנגיף. מכיוון שהמחזור הראשון של שכפול נגיפי BTV הושלם בדרך כלל בתאים נגועים בטווח של 24 HPI, התוצאות שלנו הציעו כי C 0 5 2 עשוי לפעול בשלבים מאוחרים של מחזור החיים הנגיפי של BTV, כגון שכפול הנגיף, אריזה, התבגרות ויציאה. בינתיים, ייתכן גם ש-C 0 5 2 פועל על מנגנון תאי מארח הפועל בשלבים מאוחרים יותר של מחזור החיים הנגיפי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במאמר הטוב ביותר של CPE כדי לזהות ולסווג את האנטי-וירוס הפוטנציאלי נגד הנגיפים הגורמים ל-CPE מדיד לאחר הדבקה.