במבחנה Coculture Assay כדי להעריך פתוגן המושרה נדידת נויטרופילים טרנס אפיתל

נדידת חיידקים טרנס-אפיתל נויטרופילים בתגובה לזיהום חיידקי ריר תורמת לפגיעה באפיתל ומחלות קליניות. פותח מודל במבחנה המשלב פתוגן, נויטרופילים אנושיים ושכבות תא אפיתל אנושיות מקוטבות הגדלות על מסנני טרנסוול כדי להקל על חקירות לקראת פענוח המנגנונים המולקולריים המתזמרים תופעה זו.

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לקבוע את מספר הנויטרופילים שחצו חד-שכבת תא אפיתל בתגובה לזיהום. זה מושג על ידי קידוד קולגן לפני טיפוח זהיר של חד-שכבות תאי אפיתל באמצעות תמרון מסנן טרנסוול הפוך. כשלב שני, פתוגן חיידקי מתורבת על מנת להדביק את פני השטח האפיקליים של חד-שכבת האפיתל הגדלה על מסנני הטרנסוול, מה שגורם לתאי האפיתל לייצר מושכי כימותרפיה נויטרופילים אנדוגניים.

לאחר מכן, נויטרופילים המבודדים מדם מלא מתווספים לצד הבסיסי של חד-שכבות אפיתל נגועות הגדלות על מסנני טרנסוול לבדיקת נדידת נויטרופילים מהצד הבסיסי לצד האפיקלי. מתקבלות תוצאות המראות עלייה משמעותית במספר הנויטרופילים הנודדים הטראנס-אפיתל שנצפו בתגובה לחד-שכבות אפיתל נגועות על סמך כימות של מיאלו פרוקסידאז מניטרופילים נודדים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שתמרון מסנן הטרנסוול ההפוך לגדול ולהדביק מחסומי אפיתל אינו קונבנציונלי ולכן יכול להיות פחות נגיש עבור קבוצות מחקר לא מוכרות להקים במעבדה שלהם.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במחלות דלקתיות בדרכי הנשימה הכוללות זיהום כגון דלקת ריאות או סיסטיק פיברוזיס, מכיוון שניתן לפתח ולבדוק טיפולים חדשים כדי להפחית את כמות נדידת הנויטרופילים הטרנס-אפיתליים, מה שעשוי להפחית את ההשפעות המזיקות של נויטרופילים נלהבים מדי, פריצה של מחסומי רירית. יחד עם מארק, שהוא עמית קליני במעבדה שלי, ידגימו את ההליך הטכנאי הבכיר וואהי פרזה ועמית הפוסט-דוקטורט מייקל פסוס. כדי להתחיל, הסר שטח גידול של 0.33 סנטימטר רבוע, Transwells בגודל נקבוביות של שלושה מיקרומטר מהאריזה והנח את צלחת 24 הבארות המכילה 12 טרנסוולים הפוכים בתוך מכסה המנוע.

מרימים את הצלחת התחתונה ומניחים בצד. טרנסוולס יהיה עכשיו הפוך. נח על גבי מכסה להבת צלחת 24 בארות, המוסטט לסטריליות ומניח להתקרר.

באמצעות העברת ההמוסטט הסטרילי מעביר את הנוזלים לצלחת פטרי בגודל 150 על 25 מילימטר, תוך שמירה עליהם במצב הפוך, פיפטה 70 מיקרוליטר של תמיסת קולגן מוכנה של 30 מיקרוגרם למיליליטר באתנול על קרום המסנן של כל משטח טרנסוול הפוך המתח צריך להחזיק את נפח התמיסה הזה במקומו מכיוון שאין קירות סביב קרום המסנן בעת גישה למשטח הצד התחתון. היזהר שתמיסת הקולגן לא תטפטף במורד הצד של הטרנסוול והימנע מהזזת טרנסוול במהלך הליך הציפוי. השאירו את מכסה צלחת הפטרי סגור למשך ארבע שעות לפחות כדי לאפשר לאתנול להתאדות כדי לשמור על סטריליות במהלך תהליך זה.

השאר את מאוורר מכסה המנוע ואת האור האולטרה סגול דולקים לאחר אריזת תאי אפיתל כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסף 70 מיקרוליטר של תמיסת התא המרחף של Resus מצינור של 15 מיליליטר לכל טרנסוול מצופה קולגן הפוך. מערבבים את תרחיף התאים על ידי היפוך עדין של הצינור מעת לעת כדי למנוע מהתאים לשקוע בתחתית צינור ה-15 מיליליטר תוך כדי זריעת הטרנסוולים.

לאחר שכל הטרנסוולים ההפוכים נזרעו בתאי אפיתל, החליפו את מכסה צלחת הפטרי והניחו בזהירות את התאים בחממת תרבית הרקמה למחרת. הוסף מיליליטר אחד של מדיה לכל באר של צלחת 24 הבאר הסטרילית המקורית והשתמש בהמוסטט מעוקר כדי להפוך כל באר טרנס הפוכה לכל באר המכילה מיליליטר אחד של מדיה. הוסף 0.2 מיליליטר מדיה לתא העליון של כל באר טרנס וחזור לחממת תרבית הרקמות.

הסר את צלחת 24 הבארות התומכת בשכבות האפיתל שגודלו בצד התחתון של ממברנות המסנן של Transwell במשך שמונה ימים לפחות מהחממה. אחוז בקצה של כל טרנס היטב עם המוסטט והרם אותו מצלחת 24 הבארות. הפוך את הטרנסוול מעל דלי פסולת כדי להשליך מצע תרבית מהתא הפנימי של הטרנסוול.

טבלו כל טרנסוול בכוס רחצה המכילה את תמיסת המלח המאוזנת של האנק עם סידן ומגנזיום או את האנק פלוס כדי למלא את החדר הפנימי של הטרנסוול. ואז השליכו את הנוזל מהתא הפנימי לדלי פסולת. חזור על שלב זה לשנייה.

שטפו את הפלוס של האנק אחרי שתי כביסות. הנח את הטרנסוולס בצלחת חדשה של 24 בארות המכילה מיליליטר אחד של האנק פלוס. בכל באר התבונן בתא העליון של כל טרנסוול כדי להעריך את שלמות שכבת תאי האפיתל.

הפלוס של האנק לא אמור לדלוף לתוך החדר העליון של הטרנסוול ולמלא אותו כאשר הוא מונח בבאר של צלחת של 24 בארות המכילה מיליליטר אחד של האנק פלוס. לאחר התבוננות מדוקדקת בכל טרנסוול, הוסף 0.2 מיליליטר של הנקס פלוס לתא העליון. הנח את הצלחת בחממה למשך 30 עד 60 דקות כדי לאזן את שכבות תאי האפיתל כדי לבצע את בדיקת הנדידה של הנויטרופיל טרנס אפיתל.

אחוז בכל טרנסוול עם המוסטט מצלחת 24 הבארות של Wash Transwells מאוזנת ב-Hank's Plus והשליך את הנוזל בבאר העליונה לדלי פסולת. מניחים כל טרנסוול הפוך בצלחת פטרי בגודל 150 על 25 מילימטר לשישה מהטרנסוולים ההפוכים הוסף 25 מיקרוליטר של הנקס פלוס לשלושה מהטרנסוולים ההפוכים

הדביקו את התאים ב-25 מיקרוליטר Pseudomonas, arosa או Pao אחד מדולל ב-Hanks Plus שהוכן כמתואר בפרוטוקול הטקסט לשלושת הטרנסוולים ההפוכים האחרונים מדביקים את התאים ב-25 מיקרוליטר של e Coli, K 12 או mc 1000 מדולל ב-Hanks Plus שהוכן גם הוא כמתואר בפרוטוקול הטקסט לאחר דגירה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני בתא לח למשך 60 דקות. שטפו את הטרנסוולים על ידי אחיזה עם המוסטט והפיכתם בחזרה לצלחת כביסה של 24 בארות המכילה מיליליטר אחד של האנק פלוס. בתאים התחתונים.

הוסף 0.2 מיליליטר של האנק פלוס לתאים העליונים. אחזו בטרנסוול עם המוסטט והוציאו אותו מצלחת הכביסה הראשונה. השליכו את הנוזל מהתא העליון לדלי פסולת.

לפני הכנסת הטרנסוולס לצלחת כביסה שנייה של 24 בארות המכילה מיליליטר אחד של הנקס פלוס הוסף 0.2 מיליליטר של הנקס פלוס לתא העליון. חזור על שלב זה פעם נוספת בסך הכל שלוש כביסות. לאחר השטיפה השלישית, השליכו את הנוזל מהתאים העליונים של בארות הטרנס לדלי פסולת באמצעות מקום המוסטט שלוש מבארות הטרנס הלא נגועות לתוך שלוש בארות של לוחית הנדידה של 24 הבארות המכילות מיליליטר אחד של הנקס פלוס, המייצג את פיפטת הבקרה השלילית 10 מיקרוליטר של תמיסה של 10 מיקרו-מולרית של FMLP לכל אחת משלוש הבארות של צלחת הנדידה של 24 הבארות המכילה מיליליטר אחד של הנקס בנוסף למקם שלוש מבארות הטרנס הלא נגועות בשלוש בארות של צלחת הנדידה של 24 הבארות המכילות 100 FMLP ננו-מולרי, המייצג בקרה חיובית על יכולתם של נויטרופילים מבודדים לנדוד.

לאחר מכן הנח את שלוש בארות הטרנס הנגועות ב-PAO 1 ואת שלוש בארות הטרנס הנגועות ב-mc 1000 לתוך שלוש בארות תואמות של לוחית הנדידה של 24 הבארות המכילות מיליליטר אחד של הנקס בתוספת 0.1 מיליליטר של הנקס פלוס לתא העליון של כל באר טרנס על גבי 0.1 מיליליטר הנקס פלוס בכל טרנס. ובכן הוסף בזהירות 20 מיקרוליטר מתרחיף הנויטרופילים שהוכן כמתואר בפרוטוקול הטקסט. דגירה למשך שעתיים כדי לאפשר נדידת אפיתל טרנס של הנויטרופילים.

לאחר שעתיים של נדידה, הרם את הטרנסוולס על ידי אחיזה עם המוסטט והקש בעדינות על הקירות הפנימיים של לוח הנדידה של 24 הבארות. לפני השלכת בארות הטרנס, העריכו את נדידת הנויטרופילים בצורה גסה בבארות על ידי צפייה בבארות של לוחית הנדידה של 24 הבארות תחת מיקרוסקופ הפוך באמצעות המטרה 10x. לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטר של 10% טריטון X 100 לכל באר המשמשת בלוח הנדידה של 24 הבארות, כל תקן והריק.

סובב את 24 תקני לוחית הנדידה של הבארות ורוקן במהירות נמוכה למשך 20 דקות. בארבע מעלות צלזיוס. הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר ציטראט.

שניים כל באר שימשו בלוח הנדידה של 24 הבארות לכל תקן ולריק ביסודיות. מערבבים היטב את התוכן בכל דגימה על ידי פיפטינג התמיסה למעלה ולמטה לפחות חמש פעמים. לאחר מכן העבירו 100 מיקרוליטר מכל באר דגימה בשכפול להעברת צלחת של 96 בארות, 100 מיקרוליטר מכל תקן והריק לצלחת 96 בארות.

לאחר הערבוב מוסיפים 50 מיקרוליטר של מי חמצן 30% לתמיסת A BTS ולמערבולת. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת מצע BTS לכל דגימה. על צלחת 96 הבארות, הניחו לצלחת להתפתח במשך חמש עד 10 דקות בחושך.

התבונן בהתפתחות הצבע הירוק בבארות הלוח המכילות נויטרופילים ליז לפני קריאה באורך גל של 405 ננומטר. באמצעות קורא מיקרו-צלחת להערכת נדידת טרנס-אפיתל של נויטרופילים ניתן לראות נויטרופילים שנדדו במלואם על פני שכבת האפיתל לחדר האפיקלי בבאר התחתונה של לוחית הנדידה של 24 הבארות כפי שמוצג כאן באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך. מעט מאוד נויטרופילים נצפו נודדים על פני שכבת אפיתל לא נגועה ללא שיפוע כימו-טקטי כפוי ומייצגים רמות רקע בבדיקה.

לעומת זאת, שפע של נויטרופילים טרנסמי ניכר כאשר סופק שיפוע FMLP. זיהום של האפיתל ב-e coli mc 1000 לא פתוגני הביא למעט נויטרופילים נודדים טראנס גלויים, בעוד שנויטרופילים רבים שנודדו על ידי טרנס נצפו כאשר שכבות האפיתל נדבקו ב-Pseudomonas aerogen הפתוגני של הריאות. הנויטרופילים שהיגרו בניסוי מכומתים על ידי מדידת פעילות המיאלו פרוקסידאז שלהם.

מספר הנויטרופילים נמצא בקורלציה חיובית עם כמות פעילות הפרוקסידאז שנמדדה לאחר ליזה של נויטרופילים עם ערכים המציגים קשר ליניארי בטווח מספרי הנויטרופילים שנבחרו עבור העקומה הסטנדרטית. מספר משמעותי של נויטרופילים נודדים על פני שכבות אפיתל בתגובה לשיפוע FMLP שסופק, או בתגובה לשכבת אפיתל הנגועה ב-PAO one. מספר הנויטרופילים הנודדים בהיעדר גירויים או בעקבות זיהום אפיתל אפיקלי עם אי קולי mc 1000 לא פתוגני הוא מתחת לגבול הזיהוי עבור הבדיקה.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך חמש שעות לציפוי קולגן וזריעת תאי האפיתל על מסנני הטרנסוול, ולאחר מכן לפחות שבוע כדי לאפשר לתאי האפיתל לגדול. ברגע שחד-שכבות אפיתל מוכנות. בדיקת הנדידה יכולה להתבצע תוך חמש שעות, כולל בידוד נויטרופילים והכנת חיידקים אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להכין את מסנני הטרנסוול בתנאים סטריליים כדי למנוע זיהום. ניתן להתאים הליך זה על מנת לענות על שאלות נוספות הקשורות לתהליך דלקתי זה. ניתן לבצע ניתוח של התאים הנודדים, האפיתל, השכיבה או אפילו הפתוגן.