מודל ניסיוני לחקר המלריה שחפת-coinfection על הילוכים טבעיים של חפת Mycobacterium ו Berghei Plasmodium

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבסס מודל עכברי ניסיוני שניתן להשתמש בו כדי לחקור את ההשלכות של זיהום מקביל בשחפת ומלריה in vivo. זה מושג תחילה על ידי חשיפת חיות הניסוי אליהם. שחפת המכילה טיפות אירוסול זיהומיות באמצעות מערכת חשיפה לשאיפה.

בשלב השני, קליטת המספר הרצוי של שחפת M מאומתת על ידי ניתוח CFU של רקמת הריאה. יום לאחר הדבקה באירוסול, 40 יום לאחר מכן, העכברים נחשפים ליתושים זיהומיים להעברה טבעית של פלסמודיום ספורוזואיטים, המופקדים מתחת לעור כולו במהלך ארוחת הדם. בשלב האחרון, מעקב אחר התפתחות טפיל שלב הדם של מלריה על ידי ניתוח כתמי גימסה, מריחות דם.

בסופו של דבר, ניתן למנות את נטל השחפת בריאה ואת מספר הטפילים בדם של בעלי חיים נגועים כדי לקבוע את מהלך השחפת והמלריה בהתאמה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום השחפת, זיהום מלריה, כגון כיצד הדבקה משולבת בטפיל המלריה משפיעה על הפתוגנזה והשליטה בזיהום מיקובקטריום טוברקולוזיס? פרוטוקול זה פותח כדי לחקור כיצד זיהום משותף עם אודיום בורי משפיע על השלב הכרוני של שחפת מיקרוביום, שישה עכברים בעלי יכולת חיסונית C 57 PL.

ניתן ליישם אותו גם על זני עכברים אחרים, כולל עכברי נוק-אאוט, או להשתמש בו עם מיני מיקובקטריום או אודיום אחרים. התחל בהתחממות מיקובקטריום שחפת. מניות של טיטר CFU ידוע.

כאשר התאים הופשרו, השתמש במזרק מיליליטר אחד המצויד במחט בגודל 27 כדי לערבב בזהירות את התרחיף חמש פעמים כדי לפזר את גושי החיידקים, הימנע מייצור אירוסולים, בהתאם למינון הזיהום הרצוי העביר את הנפח הנדרש של המלאי המיקובקטריאלי לתוך צינור של 50 מיליליטר המכיל PBS סטרילי לנפח סופי של שישה מיליליטר. לאחר מכן, הניחו את חיות הניסוי בנפרד בסלי רשת מחולקים. הנח את הסלים בתא התרסיס העגול וסגור את מכסה החדר.

חבר את יחידת הנבולייזר של ונטורי לשלושת מפרקי השקע מנירוסטה. שאפו את המתלה המיקובקטריאלי למזרק של 10 מיליליטר, המצויד במחט קהה בגודל 18 ונשאו את המזרק לתא התרסיס בקופסת הובלה סגורה. כעת הסר את מכסה הבורג של הנבולייזר והזריק בזהירות את מתלה המיקובקטריה ליחידה.

הקפדה על הימנעות מיצירת אירוסולים. השליכו את המזרק למיכל חד המכיל 2% ברטון, ולאחר מכן אטמו את הנבולייזר. הפעל את מכשיר השאיפה בסיום המחזור.

ודא שתרחיף המיקובקטריה עבר ערפול מלא לפני פתיחת תא האירוסול. חבשו קסדות הנשמה לטיהור אוויר, ואז החזירו את בעלי החיים לכלובים שלהם, עקרו את סלי הנבולייזר ובתוך תא התרסיס יום אחד לאחר זיהום בתרסיס, הניחו חיות ביקורת ייעודיות שהומתו על נייר סופג על לוח ניתוח בארון בטיחות ביולוגית מדרגה 2, וחטאו את העכברים עם 70% אתנול לכל עכבר. ראשית, בצע חתך קטן באמצע הבטן ולאחר מכן החזר את העור מעל ראשו של בעל החיים.

לאחר מכן, השתמש במספריים כירורגיים כדי לפתוח את הבטן ואת כלוב בית החזה. הסר את דופן בית החזה כך שהריאות יהיו נגישות ואז הסר אותן. העבירו את הריאות לתוך צינור של 15 מיליליטר עם שני מיליליטר של מאגר הומוגניזציה, ולאחר מכן השתמשו בבוכנה ממזרק של חמישה מיליליטר כדי לסנן את הרקמה דרך מסננות של 100 מיקרומטר לצלחת פטרי קטנה.

בעזרת פיפטה של מיליליטר אחד המצוידת בקצה מחסום, יש לשטוף את המסננת מספר פעמים ואז לחלק כ -250 מיקרוליטר של הומוגנט הריאה בין שמונה צלחות אגר. השתמש במפזרים חד פעמיים כדי לצלחת בזהירות את הדגימות כאשר הצלחות יבשות. אוטמים כל צלחת עם פרפיל.

עוטפים אותם בנייר אלומיניום ומדגרים אותם זקופים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך ארבעה שבועות לפחות. כדי להדביק עכברים נאיביים או נגועים במיקובקטריום במלריה על ידי עקיצות יתושים, הניחו בעלי חיים מורדמים על הרשת של כלובי היתושים, ואפשרו ליתושים המדבקים לאכול דרך הממברנה כדי להבטיח העברה מוצלחת של ספורוזואיטים. השאירו עכברים על הכלובים למשך 10 עד 15 דקות.

העבירו עכברים בחזרה לכלובים שלהם על מגבת נייר וכסו אותם במגבת נייר כדי לחמם אותם עד שהם יתעוררו מההרדמה. הרגו את היתושים על ידי ריסוס שלהם באתנול 70% או חומרי חיטוי אחרים דרך רשת הכלוב ועקרו את הכלובים על ידי חיטוי שלהם. כדי לנטר את הפרה, השתמשו במחט כדי לנקב את קצה הווריד של כל חיה נגועה ולאסוף טיפת דם אחת.

בכל קצה של מגלשת זכוכית, השתמש בשקופית אחרת כדי למשוך טיפת דם אחת מעל מחצית אורך המגלשה התחתונה. לאחר מכן הפוך את שקופית ההתפשטות והשתמש בקצה השני למריחה השנייה. הניחו את השקופיות במתלה מכתים.

תקן בקצרה את מריחות הדם במתנול מוחלט ולאחר מכן יבש באוויר. השקופיות הבאות, טבלו את המריחות בגיזה. לאחר 10 דקות, טבלו את השקופיות פנימה והחוצה מוורידים מכתימים מלאים במים נטולי יונים כמה פעמים כדי לשטוף את הכתם העודף.

לבסוף, יבש את המגלשות באוויר במצב אנכי. הדבקה הנגרמת על ידי ספורוזואיט של חיות ניסוי על ידי עקיצות יתושים מביאה לשיעור הדבקה של 100% כפי שאושר על ידי נוכחות טפילים בשלב הדם ארבעה עד חמישה ימים לאחר מכן. כפי שמודגם בטבלה, הדבקה של עכברים נגועים בשחפת נאיבית ו-m עם פלסמודיום בורי על ידי עקיצות יתושים מביאה להדבקה עקבית וניתנת לשחזור של כל בעלי החיים בקבוצת הניסוי.

על ידי השוואת עכברי טרום פטנטיות ועכברי ביקורת נאיביים עם זה ועם בעלי חיים שנדבקו ב-Mycobacterium tuberculosis, ניתן לראות כי הקדם-פטנטיות מתעכבת מעט. בעכברים שנדבקו מראש ב-Mycobacterium tuberculosis בעכברים עם Mycobacterium tuberculosis על ידי שימוש במערכת חשיפה לשאיפה, מביא לשקיעה מוצלחת של חיידקים לריאות החיה עם שונות נמוכה יחסית בין עכברים בודדים. עומסים מיקובקטריאליים בריאות של עכברים שחורים נגועים C 57 מוגברים בנוכחות p burga.

לעומת זאת, לעכברים שנדבקו במשותף יש פרה-מיה מופחתת בהשוואה לעכברים נגועים בודדים בפלסמודיום. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות כמו זרימה ציטומטרית PCR Eliza או טכניקות היסטולוגיות על הרקמה או נוזלי הגוף המעניינים כדי לנתח את התגובות החיסוניות הנוצרות בו זמנית כנגד טפילים מאליים ושחפת בסיסית והאינטראקציות שלהם במארח הנגוע המשותף. אל תשכח שעבודה עם הפתוגן האנושי מיקרובקטריום טוברקולוזיס עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לנקוט באמצעים כדי להימנע מחשיפה לאירוסולים זיהומיים בכל עת.

כל העבודה הניסויית הכרוכה בשחפת מיקרובקטריום חייבת להתבצע במתקנים מתאימים ברמת בטיחות ביולוגית שלוש.