Name: הצלה של וירוס רקומביננטי ניוקאסל מחלות מcDNA (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-11T23:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: למדו את שיטת ההצלה של וירוס ניוקאסל רקומביננטי מ-cDNA באמצעות זיהוי תאי יונקים ושתל פלסמידים. שיטה זו מאפשרת פיתוח וקטורים לחיסונים ולטיפולים גנטיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחברים מבקשים להודות לחברים בעבר ובהווה במעבדות של בני הזוג. פיטר Palese ואדולפו גרסיה ססטרה לפיתוח NDV הפוך טכניקות גנטיקה ולסיוע טכני. מחקר בנגיף מחלת ניוקאסל במעבדה AG-S ממומן חלקית על ידי NIAD להעניק R01AI088770 ועל ידי המחלקה לביטחון מולדת מרכז מדע וטכנולוגיה של אקסלנס למתעורר ומחלות zoonotic בעלי החיים (CEEZAD, מספר הפרס 2010-ST-061-AG001). מחקר במעבדה של LM-S ממומן על ידי מענקי NIH RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, מרכזי NIAID למצוינות לחקר שפעת ומעקב (HHSN266200700008C), ואוניברסיטת רוצ&#39;סטר המרכז לBiodefense חיסון דוגמנות (HHSN272201000055C) .

1. הכנת תאי יונקים (איור 4A, יום 1) פיצול הפ-2 או A549 תאי היום לפני transfection ב6 גם צלחות. צפיפות של התאים צריכה להגיע למפגש 80-90% ביום שלמחרת. בדרך כלל, 100 מנה מ&quot;מ מחוברות ניתן לפצל 8 בארות (בסביבות 1 x 10 6 תאים לכל טוב). שליציל את כל וירוס, יש לכלול 2-4 בארות שונות, כמו גם 2 בארות נוספות עבור פקדי pCAGGS-GFP וpCITE-GFP 18, שמטרתה לפקח על transfection ויעילות זיהום MVA-T7, בהתאמה. 2. זיהום של תאי יונקים עם וירוס Vaccinia אנקרה רקומביננטי השתנה הבעת קטריופאג T7-RNA פולימראז (MVA-T7) (איור 4 א, יום 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם את PBS 1x/BA/PS ותקשורת ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים, פעמיים, עם 1 מיליליטר של PBS 1x/BA/PS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק את תאי יונקים בתרבית בנגיף MVA-T7 בריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 1 pfu / תא בנפח סופי של μl 200 ב-PBS / התואר הראשון / PS עבור 1 שעות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה זיהום ויראלי, להכין את תערובת transfection כמתואר ב3. </li></ol> 3. Transfection של תאי יונקים (איור 4A, יום 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Lipofectamine: מערבבים 1-2 מיקרוגרם של LPF2000 עם 250 μl של OptiMEM לניסיון חילוץ ודגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של ה-DNA: להפוך את קוקטייל פלסמיד עבור כל הצלה ב50 μl של OptiMEM. הוספת 0.4 מיקרוגרם של pTM1-NP, 0.2 מיקרוגרם של pTM1-P, ו0.2 מיקרוגרם של pTM1-L לכל צינור. הוספת 1 מיקרוגרם של שיבוט cDNA באורך המלא של NDV להינצל לצינור אחד. כמו כן להכין שני transfections שליטה, אחד עם 2 מיקרוגרם של pCAGGS-GFP (כדי לבדוק את יעילות transfection) והשני עם 2 מיקרוגרם של pCITE-GFP (כדי לבדוק פולימראז T7 מונע על ידי ביטוי MVA-T7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פתרון LPF2000-OptiMEM כבר preincubated במשך 5 דקות (שלב 3.1), להוסיף 250μl של הפתרון לצינורות ה-DNA (שלב 3.2) ו דגירה של 20-30 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגרה עם MVA-T7, להסיר את הבידוד הנגיף על ידי שאיפה ולהחליף עם תערובת ה-DNA-LPF2000 transfection (שלב 3.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של DMEM 10% FBS / PS לכל מנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים הנגועים / transfected ל6-8 שעות (או הלילה) על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ולאחר מכן להחליף את תקשורת transfection עם 1.5 מיליליטר של 10% FBS / PS DMEM הטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב24 לאחר transfection שעה, ניתן לצפות בארות שליטה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להעריך את יעילות transfection (pCAGGS-GFP) ופעילות T7 פולימראז (pCITE-GFP) (איור 5 א). להמשיך בשיתוף התרבות של התאים הנגועים / transfected עם fibroblasts עופות כפי שיתואר להלן. </li></ol> 4. התרבות משותפת של תאי יונקים עם תאי עופות (איור 4 א, יום 3) בדרך כלל, מנה מחוברות 100 מ&quot;מ רקמת תרבות של עוף (CEFs) ofibroblasts עובר ברווז r (defs) משמש לשתי בארות transfected. הקפד להכין, מראש, מספיק מנות בתרבית רקמת 100 מ&quot;מ של תאי עופות לכל ניסיונות ההצלה. להצלה יעילה של הווירוס, מדיה 10% FBS DMEM / PS היא בתוספת 5% מנוזל allantoic ו30 מ&quot;מ MgCl 2. בשלב זה, 24 pi שעות, בתאי יונקים יכולים להתחיל להראות השפעת cytopathic (CPE) עקב זיהום MVA-T7, asevident באיור 5 א. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחמם 1x ותקשורת PBS 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאי יונקים, 2x, עם 1 מיליליטר של PBS 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize תאי יונקים עם 0.2 מיליליטר של EDTA-טריפסין עד שהם מנותקים. Resuspend תאי 1 מיליליטר של DMEM 10% FBS / PS, 5% נוזל allantoic, 30 מ&quot;מ MgCl 2 והעברה לצלחת תרבית רקמת 100 מ&quot;מ. הוסף 3 מיליליטר של אותה תקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאי עופות, פעמיים, עם 4 מיליליטר של PBS 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize תאי עופות עם 1 מיליליטר של EDTA-טריפסין ודגירה של 1-2 דק &#39;ב 37 מעלות צלזיוס עד תאים לניתק. ה resuspendתאי דואר והוסיפו 8 מיליליטר של 10% FBS / PS, 5% נוזל allantoic DMEM, 30 מ&quot;מ MgCl 2 ולהוסיף 4 מיליליטר של תאי trypsinized לתאי יונקים בצלחת שיתוף התרבותית 100 מ&quot;מ רקמת התרבות להיקף כולל של 8 מיליליטר (4 יונקים מיליליטר, תאי עופות 4 מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נער בעדינות ביד תאי שיתוף התרבותיים בצלחת 100 מ&quot;מ כדי שתהיה התפלגות אחידה ואז למקם אותם בחממה ב37 מעלות צלזיוס במשך 3-4 ימים. הקריטריונים להדבקת ביצים 3 או 4 ימים לאחר שיתוף התרבות של תאי יונקים ועופות תלוי כמה השפעת cytopathic (עיגול תא, מוות, ניתוק מהשטח, וכו &#39;.) הוא ציין בזיהום ויראלי MVA-T7. </li></ol> 5. זיהום של עוף embryonated ביצים (איור 4 א, ימי 6-7) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 3-4 ימים של התרבות המשותפת של תאי יונקים ועופות, הסר 1 מיליליטר של supernatant תרבית הרקמה ולהוסיף לצינור Eppendorf. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה supernatant תרבית רקמת 1 דקות ב12,000 סל&quot;ד בספסלצנטריפוגה בראש כדי להסיר פסולת הסלולר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נר הביצים באמצעות תיבה לקט את ביצים באור כדי לראות את הממשק שבין שק האוויר וחלל allantoic. להטביע את חותמו על גבול ממשק הימנעות לוקליזציה כלי דם. תרסיס אתנול 70% מעל הביצים להקים תנאים סטריליים. בעדינות להפוך את החור בקליפת הביצה על המקום המסומן ולחסן 500 μl של supernatant באמצעות מזרק אינסולין (1 מיליליטר), במטרה את המחט בצורה אנכית ובאופן ישיר לתוך חלל allantoic. (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הכינוי בקליפת הביצה בשעווה או פרפין נמסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על הביצים ל2-3 ימים ב 37 ° C. </li></ol> 6. קציר של נוזל allantoic ממאשרום עוף embryonated ביצים (איור 4 א, ימי 8-10) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על הביצים הנגועים ל2-4 שעה או הלילה ב 4 ° C כדי להרוג את עובר העוף ולהקריש את הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסס את הביצים עם 70% אתנול (כדי לשמור על תנאים סטריליים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברז בזהירות את סעיף הקודקוד של הביצה, על חלל האוויר, בכפית. ברגע שקליפת הביצה סדוקה, להסיר את שברים עם מלקחיים ומלואו לחשוף את קרום allantoic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את חלל allantoic ידי מוציא את קרום allantoic עם מלקחיים ומספריים, הימנעות נזק לכלי הדם והחלמון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדחוף בזהירות את העובר עם מרית ולאסוף את נוזל upflowing allantoic (8-12 מיליליטר לביצה) עם טפטפת 10 מיליליטר. להימנע מפגיעה בקרום החלמון. מעביר את נוזל allantoic לצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר על קרח (שימוש צינור אחד לכל ביצה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבהיר את נוזל allantoic ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 1,500 סל&quot;ד. מעביר את supernatant לצינור טרי מבלי להפריע גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע עד 1, עד שבודק אותם לנוכחות של NDV ידי assay hemagglutination. </li></ol> 7. Hemagglutination Assay (HA) הנוכחות של נגיף בAllantנוזל OIC מהביצים נגועים ניתן לקבוע macroscopically ידי היכולת שלהם hemagglutinate תאי דם אדומים טורקיה (RBC). במקרה של NDV, כ 10 6 פלאק להרכיב יחידות (pfu) לכל מיליליטר נדרש לתת איתות חיובית בassay HA. מבחני HA מתבצעים בצלחות 96 היטב V-תחתון. שלילי (PBS 1x, נוזל allantoic נגוע), כמו גם חיובי (נוזל allantoic מכל וירוס NDV) תמיד צריכה להיות כלולות דגימות שליטה בכל assay HA כדי לאמת את זה. כדי לבצע assay HA: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 50 μl של 1x PBS לכל גם בצלחת 96 היטב V-תחתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 50 μl של דגימות נוזל allantoic לתוך הבורות בעמודה הראשונה של הצלחת. לבצע דילולים סדרתי פי 2 דרך שאר הצלחת וזורקים 50 μl האחרון, נוסף מבארות בעמודה האחרונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 50 μl של .0.5% RBC טורקיה ב PBS 1x בכל טוב. נער בעדינות את הצלחת על ידי הקשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת על 4 ° C (או קרח) ואו 30-45 דקות או עד גלולה ברורה נוצר בבארות ביקורת השליליות. </li></ol>

<ol><li>Lamb, R. A., Parks, G. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLamb%2C+RA+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Howley, P. H., Knipe, D. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1689 (2007).</li>
<li>Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+rabies+viruses+from+cloned+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Infectious rabies viruses from cloned cDNA.</a> EMBO J. 13, 4195-4203 (1994).</li>
<li>Peeters, B. P., de Leeuw, O. S., Koch, G., Gielkens, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+Newcastle+disease+virus+from+cloned+cDNA%3A+evidence+that+cleavability+of+the+fusion+protein+is+a+major+determinant+for+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA: evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence.</a> J. Virol. 73, 5001-5009 (1999).</li>
<li>Romer-Oberdorfer, A., Mundt, E., Mebatsion, T., Buchholz, U. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+recombinant+lentogenic+Newcastle+disease+virus+from+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA.</a> J. Gen. Virol. 80 (Pt 11), 2987-2995 (1999).</li>
<li>Nakaya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Newcastle+disease+virus+as+a+vaccine+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector.</a> J. Virol. 75, 11868-11873 (2001).</li>
<li>Zamarin, D., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+Newcastle+disease+virus+for+cancer+therapy%3A+old+challenges+and+new+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy: old challenges and new directions.</a> Future Microbiol. 7, 347-367 (2012).</li>
<li>Park, M. S., Garcia-Sastre, A., Cros, J. F., Basler, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+V+protein+is+a+determinant+of+host+range+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus V protein is a determinant of host range restriction.</a> J. Virol. 77, 9522-9532 (2003).</li>
<li>Park, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+%28NDV%29-based+assay+demonstrates+interferon-antagonist+activity+for+the+NDV+V+protein+and+the+Nipah+virus+V%2C+W%2C+and+C+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus (NDV)-based assay demonstrates interferon-antagonist activity for the NDV V protein and the Nipah virus V, W, and C proteins.</a> J. Virol. 77, 1501-1511 (2003).</li>
<li>Zamarin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+oncolytic+properties+of+recombinant+newcastle+disease+virus+through+antagonism+of+cellular+innate+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Enhancement of oncolytic properties of recombinant newcastle disease virus through antagonism of cellular innate immune responses.</a> Mol. Ther. 17, 697-706 (2009).</li>
<li>Vigil, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+reverse+genetics+to+enhance+the+oncolytic+properties+of+Newcastle+disease+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Use of reverse genetics to enhance the oncolytic properties of Newcastle disease virus.</a> Cancer Res. 67, 8285-8292 (2007).</li>
<li>Swayne, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+paramyxovirus+type+1-avian+influenza-H7+virus+as+a+vaccine+for+protection+of+chickens+against+influenza+and+Newcastle+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Dis%22%5BJournal%5D)">Recombinant paramyxovirus type 1-avian influenza-H7 virus as a vaccine for protection of chickens against influenza and Newcastle disease.</a> Avian Dis. 47, 1047-1050 (2003).</li>
<li>Park, M. S., Steel, J., Garcia-Sastre, A., Swayne, D., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+viral+vaccine+constructs+with+dual+specificity%3A+avian+influenza+and+Newcastle+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: avian influenza and Newcastle disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8203-8208 (2006).</li>
<li>Carnero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+human+immunodeficiency+virus+gag+expression+by+newcastle+disease+virus+vectors+for+the+induction+of+potent+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Optimization of human immunodeficiency virus gag expression by newcastle disease virus vectors for the induction of potent immune responses.</a> J. Virol. 83, 584-597 (2009).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+type+I+interferon+secretion+through+recombinant+Newcastle+disease+virus+expressing+measles+virus+hemagglutinin+stimulates+antibody+secretion+in+the+presence+of+maternal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Induction of type I interferon secretion through recombinant Newcastle disease virus expressing measles virus hemagglutinin stimulates antibody secretion in the presence of maternal antibodies.</a> J. Virol. 85, 200-207 (2011).</li>
<li>DiNapoli, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus%2C+a+host+range-restricted+virus%2C+as+a+vaccine+vector+for+intranasal+immunization+against+emerging+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus, a host range-restricted virus, as a vaccine vector for intranasal immunization against emerging pathogens.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9788-9793 (2007).</li>
<li>Martinez-Sobrido, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+respiratory+syncytial+virus+by+a+recombinant+Newcastle+disease+virus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Protection against respiratory syncytial virus by a recombinant Newcastle disease virus vector.</a> J. Virol. 80, 1130-1139 (2006).</li>
<li>Bukreyev, A., Collins, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+as+a+vaccine+vector+for+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus as a vaccine vector for humans.</a> Curr. Opin. Mol. Ther. 10, 46-55 (2008).</li>
<li>Martinez-Sobrido, L., Zuniga, E. I., Rosario, D., Garcia-Sastre, A., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+type+I+interferon+response+by+the+nucleoprotein+of+the+prototypic+arenavirus+lymphocytic+choriomeningitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the type I interferon response by the nucleoprotein of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus.</a> J. Virol. 80, 9192-9199 (2006).</li>
<li>Jennings, S., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weber, F., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thogoto+virus+ML+protein+suppresses+IRF3+function%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Thogoto virus ML protein suppresses IRF3 function.</a> Virology. 331, 63-72 (2005).</li>
<li>Kochs, G., Garcia-Sastre, A., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+anti-interferon+actions+of+the+influenza+A+virus+NS1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Multiple anti-interferon actions of the influenza A virus NS1 protein.</a> J. Virol. 81, 7011-7021 (2007).</li>
<li>Munoz-Jordan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+alpha%2Fbeta+interferon+signaling+by+the+NS4B+protein+of+flaviviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of alpha/beta interferon signaling by the NS4B protein of flaviviruses.</a> J. Virol. 79, 8004-8013 (2005).</li>
<li>Cardenas, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ebola+virus+VP35+protein+binds+double-stranded+RNA+and+inhibits+alpha%2Fbeta+interferon+production+induced+by+RIG-I+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Ebola virus VP35 protein binds double-stranded RNA and inhibits alpha/beta interferon production induced by RIG-I signaling.</a> J. Virol. 80, 5168-5178 (2006).</li>
<li>Mibayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+retinoic+acid-inducible+gene+I-mediated+induction+of+beta+interferon+by+the+NS1+protein+of+influenza+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of retinoic acid-inducible gene I-mediated induction of beta interferon by the NS1 protein of influenza A virus.</a> J. Virol. 81, 514-524 (2007).</li>
<li>Kopecky-Bromberg, S. A., Martinez-Sobrido, L., Frieman, M., Baric, R. A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+open+reading+frame+%28ORF%29+3b%2C+ORF+6%2C+and+nucleocapsid+proteins+function+as+interferon+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Severe acute respiratory syndrome coronavirus open reading frame (ORF) 3b, ORF 6, and nucleocapsid proteins function as interferon antagonists.</a> J. Virol. 81, 548-557 (2007).</li>
<li>Rose, K. M., Elliott, R., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+coronavirus+delays+expression+of+a+subset+of+interferon-stimulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Murine coronavirus delays expression of a subset of interferon-stimulated genes.</a> J. Virol. 84, 5656-5669 (2010).</li>
<li>Roth-Cross, J. K., Martinez-Sobrido, L., Scott, E. P., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+alpha%2Fbeta+interferon+response+by+mouse+hepatitis+virus+at+multiple+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the alpha/beta interferon response by mouse hepatitis virus at multiple levels.</a> J. Virol. 81, 7189-7199 (2007).</li>
<li>Andersson, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crimean-Congo+hemorrhagic+fever+virus+delays+activation+of+the+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Virol%22%5BJournal%5D)">Crimean-Congo hemorrhagic fever virus delays activation of the innate immune response.</a> J. Med. Virol. 80, 1397-1404 (2008).</li>
<li>Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+vesicular+stomatitis+viruses+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).</li>
<li>Kato, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+Sendai+virus+multiplication+from+transfected+cDNA+or+RNA+with+negative+or+positive+sense%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Initiation of Sendai virus multiplication from transfected cDNA or RNA with negative or positive sense.</a> Genes Cells. 1, 569-579 (1996).</li>
<li>Durbin, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+infectious+human+parainfluenza+virus+type+3+from+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Recovery of infectious human parainfluenza virus type 3 from cDNA.</a> Virology. 235, 323-332 (1997).</li>
<li>Zhao, H., Peeters, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Newcastle+disease+virus+as+a+viral+vector%3A+effect+of+genomic+location+of+foreign+gene+on+gene+expression+and+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication.</a> J. Gen. Virol. 84, 781-788 (2003).</li>
<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((At+least+six+nucleotides+preceding+the+AUG+initiator+codon+enhance+translation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells.</a> J. Mol. Biol. 196, 947-950 (1987).</li>
<li>Calain, P., Roux, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rule+of+six%2C+a+basic+feature+for+efficient+replication+of+Sendai+virus+defective+interfering+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The rule of six, a basic feature for efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA.</a> J. Virol. 67, 4822-4830 (1993).</li>
<li>Wyatt, L. S., Moss, B., Rozenblatt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-deficient+vaccinia+virus+encoding+bacteriophage+T7+RNA+polymerase+for+transient+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Replication-deficient vaccinia virus encoding bacteriophage T7 RNA polymerase for transient gene expression in mammalian cells.</a> Virology. 210, 202-205 (1995).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
<li>Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Alexander, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product+review.+New+mammalian+expression+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Product review. New mammalian expression vectors.</a> Nature. 348, 91-92 (1990).</li>
<li>Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+genetics+of+mononegavirales%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Reverse genetics of mononegavirales.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 283, 1-41 (2004).</li>
</ol>

אדולפו גרסיה ססטרה היא ממציא פטנטים על וירוסי מחלת רקומביננטי ניוקאסל אשר בבעלות בית הספר לרפואה של אייקן בהר סיני.

מספר גורמים שיש להתחשב על מנת להשיג תוצאות טובות בזמן הצלת NDV. ראשית, מבנה cDNA באורך מלא כדי לשמש צריך להיות מתוכנן כדי לאפשר את השילוב הפונקציונלי של transgenes / השינויים החדשים לתוך הגנום NDV. משמעות דבר היא, כאמור לעיל, שרצפי הסוף (i) מתאים גנטית (GE), intergenic (IG) ותחילת גן (GS) הם שיש להוסיף אם נדרשו, (ii) אין רצפי GE או GS המשוערת לזרים גן, וכן (iii) הגנום רקומביננטי המלא כדלקמן &quot;השלטון של שש&quot;. <p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rt...

נגיף מחלת ניוקאסל (NDV), paramyxovirus עופות המשתייכים לסוג Avulavirus 1, הוא סוכן zoonotic כלכלי רלוונטי ובכך נחקר באופן נרחב ומעקבים, אשר באופן חמור יכול להשפיע על גידול עופות בכל רחבי העולם. למרות שלא הפתוגן אנושי, NDV גם נחקר ביסודיות מעבר לשדה הווטרינר הן כparamyxovirus מודל ובשל המאפיינים שלה מעניינים מאוד, הטבעיים oncolytic 6. מחקר על NDV תועלת רב מהפיתוח של טכניקות גנטיקה הפוכה לוירוסים חד גדילים, שאינם מפולחים תחושה השלילית RNA, שתוארו לראשונה על ידי וירוס כלבת Conzelmann וcoleagues 2. מגוון של NDVs מהונדס גנטי, שנשא גנים או שינויים של הגנום הסוג הבר זרים נחקרו בהרחבה מאז. עבודה עם וירוסי רקומביננטי אלה הייתה קריטית כדי לאפיין גורמים ארסי שונים, לא רק של NDV אלא גם של הומא הרלוונטי האחרn פתוגנים כמו שפעת 7 וירוס - וירוס Nipah או מתהווה 8. יתר על כן, מספר מחקרים שונים בחנו את השימוש בטכניקות הללו כדי לשפר את פעילות antitumoral המולדת של NDV 6,9,10, בעיקר על ידי שיפור מאפייני immunostimulatory של הנגיף. אזור רלוונטי אחר של מחקר על NDVs רקומביננטי היה הדור של מועמדי חיסון נגד מחלות ויראליות אחרות כמו שפעת 5,11,12, 13 איידס, חצבת 14, 15 סארס, או שנגרם על ידי נגיף sincytial הנשימה (RSV) 16. בין היתרונות הבולטים השונים הניתנים על ידי NDV הם חוסר החסינות קיימת מראש באוכלוסיות אנושיות, היציבות מוסיף חוץ גנטי, חוסר פעילות recombinatory וכולל פרופיל בטיחות גבוה בשילוב עם מאפייני immunostimulatory הטבעיים האמורים 17. זה גם ראוי לציון השימוש הפוטנציאלי של חיסונים דו ערכי רקומביננטי בעמ &#39;oultry, שפעת עופות מגנה מפני שני NDV ופתוגניים מאוד וירוסי 11,12. זו עשויה להיות דרך מצוינת כדי להפחית את הסיכויים של האחרון מתפשטים מטבע לבעלי חיים מבויתים, ובכך גם עוזרים למנוע קפיצת היתר ספציפית אפשרית של שפעת עופות חשש לבני אדם. לבסוף, NDV-להביע כתב היה בשימוש להערכה של תגובות חיסוניים מולדים, כמו גם זיהוי של אנטגוניסט אינטרפרון המקודד על ידי וירוסים מרובים 18-27. תהליך ההצלה של רקומביננטי, שאינו מפולח, נגיף RNA שלילי תקוע בעצם מורכב באופן מלאכותי מאלץ את מחזור שכפול נגיפי בתא ייצור על ידי transfecting קידוד cDNA המכונות מינימליות התולעת מולקולרית, המכונים ribonucleoprotein או RNP (איור 2). RNPs מורכב של פולימראז הנגיפי (P וחלבונים L), nucleoprotein (NP) ורנ&quot;א antigenomic באורך המלא של הנגיף. RNA + antigenome זו הוא התבנית דואר הנדרשת עבור הדור של RNA-הגנום המשלים, אשר, קשור גם עם שאר החלבונים של RNP הנגיפי, משחזרת את אותו מורכב מדבק שנגיף טבעי ישחרר בציטופלסמה של התא על זיהום (איור 2A ). משלב זה ואילך, המחזור הנגיפי יכול להמשיך באופן טבעי וויריונים רקומביננטי, encapsidating גנומים שונה, יופקו (איור 2). למרבה הפלא, transfection של cDNA גנומי במקום cDNA antigenomic מאוד פוגע או לחלוטין מבטל את יעילות הצלת 2,28-30. גם כאשר cDNA antigenomic הוא transfected, את היעילות של encapsidation של RNA רקומביננטי לRNPs בתאי transfected היא כנראה נמוכה מאוד. בגלל זה, פרוטוקולי הצלה לNDV לעתים קרובות כוללים צעדים שונים להגברה של כמה חלקיקים נגיפיים שוחררו מתאי transfected במקור על ידי coculturing אותם עם תאים מתירנית ו / או על ידיזיהום של ביצי embryonated. לפני ההצלה, ניתן להשפיע cDNA על ידי נהלי שיבוט סטנדרטיים על מנת ליצור את השינויים הרצויים. בעוד מוטציות ספציפיות של מוצרי גן השונים ורצפים רגולטוריים של הנגיף יכולות להיות מושגת בדרך זו בצורה ישירה, רבים של העבודה שפורסמה מעורבת NDV רקומביננטי דרש תוספת של יחידת תעתיק חדשה לתוך הגנום NDV. כמו חברים אחרים במשפחת paramyxovirus, הגנום מקודד NDV שמונה חלבונים שונים לשש יחידות תעתיק, אשר באות לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי בהתאם למיקום שלהם ביחס לסוף &#39;3 ​​בשיפוע יורד קריטי עבור מחזור החיים הנגיפי 1. בגלל זה, את המיקום של יחידת תעתיק החדשה בתוך הגנום חייב להיות שנבחר בקפידה כדי להשיג איזון בין הביטוי של transgene וירידת הערך של שכפול נגיפי. הכנסה בין P וגני M כבר בשימוש, לא הכיאתרים אחרים האף גם נבדקו 13,31. לא משנה מה להוסיף, השיבוט לNDV cDNA צריך לעקוב אחר כמה כללים כדי ליצור מבנה rescuable: (i) כל גן חדש שייכלל לתוך הגנום NDV צריך להיות תחת שליטה של ​​האותות המתאימים לRNA תלוי-RNA הנגיפי פולימראז. רצפים אלה יש להוסיף במעלה הזרם של מסגרת הקריאה הפתוחה החדשה (ORF) כך פולימראז יכול לזהות את הסוף של הגן הקודם (GE) ותחילתו של transgene החדש (GS), במרווחים של רצף intergenic נוקלאוטיד יחיד (IG) . תוספת של קוזאק תקף (K) רצף כדי לשפר את תרגום ריבוזומלי אוקריוטים מומלץ גם לחלבון זר ביטוי טוב יותר 32 (ii) שכפול יעיל של NDV, כמו עבור רוב בני משפחת Paramyxoviridae, תלוי באורך הגנום להיות מרובה של שש 33, ולכן כל כניסה לתוך NDV יש לעקוב &quot;השלטון של שש&quot; הזה. במידת צורך, reqניתן להוסיף נוקלאוטידים נוספים uired מורד הזרם ORF החדש, וכן (iii) את הרצף של transgene צריך להיבדק כדי למצוא אפשרי GE ו GS כמו רצפים אשר עלול לפגוע ביעילות הצלה, ביטוי transgene ו / או כדאיות וירוס. אם קיימים, רצפים אלה יש להסיר על ידי mutagenesis השקט. הדור של cDNA באורך המלא רקומביננטי הבא כללים הנ&quot;ל הוא הצעד הראשון כדי לייצר ביעילות NDV מהונדס גנטי כמפורט כאן. במערכת כל בונה DNA נמצא תחת שליטה של אמרגן פולימראז T7-RNA (איור 3). פולימראז cytoplasmic זה מסופק בטרנס ידי coinfection עם vaccinia וירוס אנקרה הותאם רקומביננטי (MVA-T7) 34. איור 3 א מציג את פלסמיד pNDV-B1, אשר מקודד cDNA antigenomic באורך מלא 5. איור 3 ב מציג פלסמידים pTM1 קידוד NP, ORFs P ו-L. פלסמידים pCITE-GFP, אשר מקודד, under אמרגן T7, החלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP), וpCAGGS GFP 18, אשר מקודד באותו ORF תחת האמרגן אקטין בטא עוף 35, משמשים כקבוצת ביקורת. בפרוטוקול זה אנו מציגים את ההליך כדי להציל NDV רקומביננטי מcDNA של B1 lentogenic NDV Hitchner זן 5 (איור 4).

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>CORNING Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>כל ספק</td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 (LPF2000)</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>35% אלבומין בקר (BA)</td><td>Sigma</td><td>232-936-2</td><td>כל ספק</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>CORNING Cellgro</td><td>25-052-CI</td><td>כל ספק</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין (PS) 100x</td><td>CORNING Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>כל ספק</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td>כל ספק</td></tr><tr><td colspan="4"> קווי תאים A549 (מספר קטלוגי CRL-185), תאי HEp-2 (מספר קטלוגי CRL-185), פיברובלסטים של עוברי עוף (מספר קטלוגי CRL-12203) ופיברובלסטים של עוברי ברווז (מספר קטלוגי CCL-141) הם זמין באוסף תרבות הטיפוס האמריקאי (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 ארה"ב). כל קווי התאים נשמרים ב-37 מעלות; חממת C עם 5% CO2 ב-DMEM 10% FBS, 1% PS. ביצי עוף עובריות ניתן להשיג ביצי עוף עובריות ממעבדות נהר צ'ארלס, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Delivery (Franklin Commons, 106 Route 32, צפון פרנקלין, CT 06254, ארה"ב) ונשמרים ב-37 מעלות צלזיוס. ביצים נדבקות כשהן מגיעות לגיל 8-10 ימים. גם זיהום וגם קציר של הנוזל האלנטואי מתרחשים בתנאים סטריליים. כל הביצים עוברות חיטוי ומושלכות בהתאם לפרוטוקולי הבטיחות הביולוגית הסטנדרטיים של המעבדה. כדוריות דם טורקיות אדומות (RBC) ניתן לרכוש RBC טורקי מ-Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA) ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. להכנת RBC לבדיקת HA, שטפו 5 מ"ל מהמלאי המסחרי עם 45 מ"ל PBS 1x בשפופרת חרוטית של 50 מ"ל. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב -1,000 סל"ד והשליכו בזהירות את הסופרנטנט. מדולל כדורי RBC 1:1,000 ב-PBS 1x לריכוז סופי של 0.5-1.0%. ניתן לאחסן RBC שטוף בטמפרטורה של 4 מעלות; C למשך מספר ימים. Plasmids תכשירי פלסמיד מתקבלים עם כל ערכת maxiprep זמינה מסחרית בעקבות היצרן&#039; הוראות s, מדוללות ב-ddH20 לריכוז סופי של 1 &mu; g/&mu; l ומאוחסנים ב-20 מעלות צלזיוס. ריכוז ה-DNA והטוהר מוערכים על ידי ספקטרופוטומטריה ב-260 ו-280 ננומטר. תכשירים עם יחס 260/280 גבוה מ-1.8 נחשבים לאיכות מקובלת להצלה. איכות ה-DNA של הפלסמיד נבדקת גם באופן שגרתי על ידי כרומטוגרפיה של ג'ל אגרוז. Virus ניתן לבצע את הפרוטוקול המתואר להצלת זן ה-NDV הלטוגני היצ'נר B1 בתנאי רמת בטיחות ביולוגית (BSL) 2. ה-Vaccinia Ankara המבטא את ה-T7 RNA פולימראז (MVA-T7) תואר 34 והתקבל מד"ר ברנרד מוס. נגיף זה הוא גידול בשכבות חד-שכבתיות של פיברובלסטים של עוברי עוף וטיטרציה בתאי יונקים (A549 או HEp-2). מלאי NDV גדל בביצי תרנגולות עובריות ועובר טיטרציה על ידי IFA באמצעות סרום רב-שבטי שגדל כנגד נגיפים מטוהרים. יש לעקר בבטחה את כל החומר המזוהם ולהשליך אותו על פי נהלי בטיחות ביולוגית סטנדרטיים. מדיה ופתרונות לתרבית רקמות: DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco&#039; s שונה Eagle&#039; s Medium (DMEM) בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ופניצילין/סטרפטומיצין (P/S): 445 מ"ל DMEM, 50 מ"ל FBS מומת בחום, 5 מ"ל תמיסת P/S מסחרית פי 100. אחסן בטמפרטורה של 4 &deg;C. 10x מי מלח פוספט חומציים (PBS):</חזק> 80 גרם NaCl, 2 גרם KCl, 11.5 גרם Na2HPO4.7H2O, 2 גרם של KH2PO4. הוסיפו ddH2O עד 1 ליטר. התאימו את ה-pH ל-7.3. לעקר על ידי חיטוי. יש לאחסן בטמפרטורת החדר. <חזק>1x PBS: </חזק> לדלל 10x PBS 1:10 עם ddH2O. יש לעקר על ידי חיטוי ולאחסן בטמפרטורת החדר. <חזק>100x Ca/Mg: </חזק> 1.327 גרם CaCl2.2H2O, 2.133 גרם MgCl2.6H2O ולהוסיף ddH2O עד 100 מ"ל. חיטוי ואחסון בטמפרטורת החדר. 1x PBS/BA/PS: </חזק> 50 מ"ל של 10x תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) ב-437 מ"ל ddH2O. חיטוי וכשהוא מקורר לטמפרטורת החדר, יש להוסיף 5 מ"ל 100x פניצילין/סטרפטומיצין 3 מ"ל 35% בקר ו-5 מ"ל של 100x Ca/Mg. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס< לאדם> </td></tr></tbody></table>

הצלה של וירוס רקומביננטי ניוקאסל מחלות מcdna

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

נגיף מחלת ניוקאסל (NDV), חבר אב הטיפוס של סוג Avulavirus של המשפחה 1 Paramyxoviridae, הוא שאינם מפולח תחושה שלילית,, חד גדילים, עטף וירוס RNA (איור 1) עם יישומים פוטנציאליים כוקטור לחיסון ו טיפול במחלות אנושיות. חקירה לעומק של יישומים אלה הפכה להיות אפשרית רק לאחר הקמתה של טכניקות גנטיקה הפוכה כדי להציל וירוסי רקומביננטי מפלסמידים קידוד הגנום המלא שלהם כcDNA 2-5. cDNA הנגיפי יכול להיות שונה בנוחות במבחנה באמצעות נהלי שיבוט סטנדרטיים לשנות את גנוטיפ של הווירוס ו / או לכלול יחידות תעתיק חדשות. הצלה של וירוסים מהונדסים גנטי כזה מספקת כלי רב ערך כדי להבין את הגורמים המשפיעים על שלבים רבים של זיהום, כמו גם מאפשר פיתוח והשיפור של וקטורים לביטוי והאספקה ​​של אנטיגניםלחיסון וטיפול. כאן אנו מתארים פרוטוקול להצלת NDVs רקומביננטי.

הצלה של NDV היא הליך מבוסס היטב, מבוצע באופן שיגרתי במעבדות שיש להם גישה לcDNA של הנגיף השלם. עם זאת, הטבע סטוכסטיים המהותי של השיטה הופך אותו לקשה להשגה 100% יעילות הצלה. ניטור השלבים המוקדמים של התהליך, במיוחד את יעילות transfection והזיהום עם MVA-T7, מסייע בזיהוי בעיות אפשריות. איור 5A תערוכות transfection סטנדרטי ויעילות transfection / זיהום שאינן מספיק להצלת NDV מוצלחת. אחרי הסיבובים של הגברה בשיתוף תרבויות עופות יונקות וביצי embryonated, נוכחות של וירוס הציל...

נגיף מחלת ניוקאסל (NDV), נחקר בהרחבה בשנים האחרונות על מנת לפתח וקטורים חדשים לחיסון וטיפול, בין יתר. מחקרים אלה היו אפשריים בשל טכניקות להצלת וירוס רקומביננטי מcDNA, כמו אלה שאנו מתארים כאן.

הצלה של וירוס רקומביננטי ניוקאסל מחלות מcDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להציל את נגיף מחלת ניוקאסל רקומביננטי או NDV מ-DNA משובט. זה מושג תחילה על ידי הדבקת תאי יונקים בנגיף עוזר המקודד T שבע פולימראז, ולאחר מכן העברת תאים אלה עם פלסמידים, המקודדים את מנגנון השכפול המינימלי של הנגיף הנשלט על ידי מקדם T 7. השלב השני הוא טיפוח משותף של תאי היונקים שעברו טרנספטציה עם תאי עופות, שהם מהמארחים הטבעיים של הנגיף.הווריאנים החדשים שנוצרו המשתחררים מתאי היונקים ידביקו את תאי העופות לסבב ראשון של הגברה. לאחר מכן, הסופרנטנט של התרבות המשותפת מחוסן לביצי תרנגולות עובריות להמשך צמיחה של הנגיף שניצל, השלב האחרון הוא איסוף נוזל ה-LAN מהביצים המחוסנות. בסופו של דבר, נעשה שימוש בבדיקת אומת המגלוטינין פשוטה כדי להראות את נוכחותו של NDV בנוזל ה-LAN ואת הצלחת תהליך החילוץ.וירוסים רקומביננטיים שניצלו בשיטה זו יכולים לספק תובנות לגבי גורמים שונים המשפיעים על זיהום ויכולים לשמש גם כווקטורים להעברת אנטיגנים לחיסון וטיפול אנטי-גידולי. כדי להתחיל לפצל hep של יונקים שני או 5 49 תאים יום לפני הטרנספקציה בשש לוחות באר, צפיפות התאים צריכה להגיע ל-80 עד 90% מפגש למחרת. כדי להציל כל נגיף, כלול שתיים עד ארבע בארות שונות.כלול גם שתי בארות נוספות לבקרות PCAs, GFP ו-pite, GFP שמטרתו לנטר את יעילות ההעברה וה-MVAT שבע בהתאמה. שטפו תאים פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS מחומם, ואז הדביקו את תאי היונקים המתורבתים בנגיף MVA T 7 בריבוי הדבקה של PFU אחד לתא. בנפח סופי של 200 מיקרוליטר ב-PBS, השאירו את התאים לדגור במשך שעה בטמפרטורת החדר במהלך הדגירה של הזיהום הנגיפי, הכינו את תערובת הטרנספקציה כמתואר בטקסט הכתוב לאחר הכנת התמיסה האופטימלית לכריתת הליפקטומיה והדגירה מראש למשך חמש דקות.250 מיקרוליטר של התמיסה לצינורות ה-DNA ודגירה במשך 20 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר לאחר הדגירה עם MVAT 7, מסירים את חיסון הנגיף על ידי שאיפה ומחליפים בתערובת טרנספקציה של DNA lipo. הוסף מיליליטר אחד של DMEM 10% FBS לכל מנה. דגרו על התאים הנגועים במשך שש עד שמונה שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני.לאחר מכן החלף את מדיום הטרנספקציה ב-1.5 מיליליטר של DMEM טרי 10% FBS ב-24 שעות לאחר הטרנספקציה ניתן לצפות בבארות בקרה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להעריך את יעילות הטרנספקציה ופעילות T 7 פולימראז לפני שתמשיך בתרבית משותפת של תאי היונקים הנגועים עם פיברובלסטים של עופות. בדרך כלל משתמשים בצלחת תרבית רקמה של 100 מילימטר של פיברובלסטים של עובר עוף או ברווז לכל שתי בארות מועברות. הקפידו להתכונן מספיק מראש.צלחות תרבית רקמה 100 מילימטר של תאי עופות לכל ניסיונות ההצלה להצלה יעילה של הנגיף. מדיום DMEM 10% FBS מתווסף עם נוזל טויק 5% אלן ומגנזיום כלוריד 30 מילימולר. לאחר שטיפת תאי היונקים פעמיים עם טריפסין מחומם XPBS מסתכל על התאים עם 0.2 מיליליטר טריפסין EDTA עד שהם מתנתקים.השעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של ה-DMEM התוסף והעבירו לצלחת תרבית רקמה של 100 מילימטר בשלושה מיליליטר של אותו מדיום. לאחר שטיפת תאי העופות פעמיים עם טריפסין XPBS מחומם, עיני התאים עם מיליליטר אחד של טריפסין EDTA ודגירה למשך דקה עד שתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהתאים מתנתקים. השעו מחדש את תאי העופות על ידי הוספת שמונה מיליליטר מהמדיום המוכן.לאחר מכן הוסף ארבעה מיליליטר מתאי העופות המותאמים לתאי היונקים בצלחת תרבית רקמה של 100 מילימטר לנפח כולל של שמונה מיליליטר. נערו בעדינות את התאים בתרבית משותפת בצלחת 100 מילימטר כדי להבטיח פיזור אחיד ולאחר מכן הניחו אותם בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלושה עד ארבעה ימים. ביצים נגועות כאשר כל התאים בתרבית משותפת מושפעים מהאפקט הציטופתי עקב זיהום נגיפי MVAT 7.בשלב זה, הסר מיליליטר אחד של תרבית הרקמה והוסף אותו לצנטריפוגה של צינור DPH. תרבית הרקמה סופרנטנטנט למשך דקה אחת ב -12,000 סל"ד בצנטריפוגה על שולחן. כדי להסיר פסולת תאית, נר את הביצים באמצעות קופסת מנורות קלה כדי לראות את הממשק בין שק האוויר לחלל אלן טויק.סמן את גבול הממשק והימנע מלוקליזציה של כלי הדם. ריססו 70% אתנול על הביצים כדי ליצור תנאים סטריליים. יוצרים בעדינות חור בקליפת הביצה במקום המסומן.לאחר מכן יש לחסן 500 מיקרוליטר של החרטום באמצעות מזרק של מיליליטר אחד, ולכוון את המחט אנכית וישירות לתוך חלל אלן טואיק. אוטמים את הניק בקליפת הביצה בשעווה מומסת או פרפין. דוגרים על הביצים במשך יומיים-שלושה בחום של 37 מעלות צלזיוס.דגרו על הביצים הנגועות במשך שעתיים עד ארבע שעות או לילה בארבע מעלות צלזיוס על מנת להרוג את עובר התרנגולת ולקרוש את הדם. מרססים את הביצים באתנול 70% כדי לשמור על תנאים סטריליים. הקש בזהירות על החלק האפיקלי של הביצה מעל חלל האוויר בעזרת כף.לאחר שקליפת הביצה נסדקת, הסר את השברים בעזרת מלקחיים וחשוף במלואו את קרום ה-LAN toic. חשוף את חלל ה-LAN toic על ידי כריתת קרום אף אוזן גרון בעזרת מלקחיים ומספריים, הימנעות מנזק לכלי הדם ולעץ האלון. דחף בזהירות את העובר כלפי מטה בעזרת מרית ואסוף את נוזל ה-LAN הזורם כלפי מעלה עם פיפטה של 10 מיליליטר.הימנע מפגיעה בקרום החלמון. העבירו את נוזל ה-LAN לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר על קרח. הבהירו את נוזל ה-LAN על ידי צנטריפוגה למשך חמש דקות ב-1500 סל"ד.העבירו את הסופרנטנט לצינור טרי מבלי להפריע לגלולה. אחסן את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס עד שבוע עד לבדיקת נוכחות NDV על ידי בדיקת אומת המגלוטינין. ניתן לקבוע את נוכחות הנגיף בנוזל אלן טויק מביצים נגועות באופן מקרוסקופי על ידי יכולתם להמגלוטינין שמונה דגימות בקרה שליליות של תאי דם אדומים בטורקיה כגון XPBS אחד או נוזל אלן טויק לא נגוע, כמו גם דגימות בקרה חיוביות כגון נוזל אל טויק מכל נגיף NDV צריכות תמיד להיכלל בכל בדיקת HA כדי לאמת אותה.כדי לבצע את בדיקת ה-HA, פיפטה 50 מיקרוליטר של XPBS אחד לבאר בצלחת V תחתונה של 96 בארות, ואז פיפטה 50 מיקרוליטר של דגימות נוזל ה-LAN לתוך הבארות בעמודה הראשונה של הצלחת. בצע דילול סדרתי כפול דרך שאר הצלחת והשליך את 50 המיקרוליטר הנוספים האחרונים מהבארות. בעמודה האחרונה, חלקו 50 מיקרוליטר של 0.5% כדוריות דם אדומות טורקיות ב-XPBS אחד לכל באר נענעו בעדינות את הצלחת על ידי הקשה דגרו את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 עד 45 דקות או עד שנוצרת גלולה שקופה בבארות הבקרה השליליות.ניתן לעקוב אחר השלבים המוקדמים בהליך ההצלה של NDV, במיוחד יעילות הטרנספקציה והזיהום ב-MVAT 7 המוצג כאן. תמונות פלואורסצנטיות ושדה בהירות מייצגות של 5 49 תאים שהועברו עם PAGs GFP או נגועים ב-MVAT 7 והועברו עם P שמונה GFP מכונן. ביטוי GFP המונע על ידי PCAs הוא אינדיקטור ליעילות הטרנספקציה, בעוד שביטוי GFP מונע על ידי מקדם T 7 על ידי אתר P הוא בקרה לזיהום MVAT שבע ו-T שבע פולימראז.התמונות מראות יעילות זיהום טרנספקציה וטרנספקציה המספיקות להצלה מוצלחת של NDV לאחר סבבי ההגברה בתרביות קו-יונקים של עופות וביצים עובריות, נוכחות של נגיף שניצל מזוהה על ידי בארות חיוביות בבדיקת HA. NDV משרה המגלוטינין על ידי קישור אריתרוציטים ובכך מונע את שקיעתם בתחתית הבאר בצורת V. לכן, ניתן להבחין בקלות בחוסר פעילות של HA על ידי היווצרות כדור עגול אדום של כדוריות דם אדומות כפי שמוצג כאן בבקרה השלילית ותוצאה שלילית אחת משלוש דגימות לא ידועות שהתקבלו לאחר הצלה.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להציל את נגיף מחלת ניוקאסל רקומביננטי מ- CDNA עם יכולת שחזור גבוהה.

rescue-of-recombinant-newcastle-disease-virus-from-cdna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הצלה של שפעת וירוסים מ-DNA פלסמיד היא טכניקה ניסויית בסיסי וחיוני המאפשר לחוקרים שפעת לייצר וירוסים רקומביננטי ללמוד היבטים מרובים הביולוגיה של נגיף השפעת, וכן לשמש וקטורים או חיסונים פוטנציאליים.

הדור של וירוס שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמיד

מערכת גנטיקה הפוכה עבור זן בקעת נגיף קדחת-12 MP החיסון הוא כלי שימושי ליצירת נוספים MP-12 מוטנטים עם הנחתה מוגברת immunogenicity. אנו מתארים את הפרוטוקול כדי לייצר ולאפיין שמוטציות NSS.

באמצעות גנטיקה הפוכה כדי לתפעל את ג&#39;ין NSS של וירוס קדחת עמק השבר MP-12 מסננים כדי לשפר את בטיחות חיסון והיעילות

Source: Yuan, M., et al. A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the process of performing a fluorescent plaque assay using recombinant vaccinia virus encoding red fluorescent protein (RFP) in fibroblast cells, followed by plaque isolation and purification for further analysis.

Fluorescence-Based Detection and Purification of Recombinant Vaccinia Virus

הצלת Arenaviruses רקומביננטי מcDNAs המשובטים, גישה המכונה להפוך גנטיקה, מאפשרת לחוקרים לחקור את התפקיד של מוצרים גנטיים נגיפיים ספציפיים, כמו גם את תרומתו של תחומים ושאריות הספציפיים השונים שלהם, להיבטים רבים ושונים של הביולוגיה של arenavirus . כמו כן, להפוך טכניקות גנטיקה בשורות תאי ה-FDA (Vero) לפיתוח חיסון מספק אפשרויות חדשות לייצור חיסונים יעילים ובטוחים כדי להילחם Arenaviruses פתוגניים אדם.

דור של Arenavirus רקומביננטי לפיתוח חיסון בתאי Vero-FDA

ב-15 השנים האחרונות, וקטורים שמקורם באדנווירוס כלבים מסוג 2 (CAV2) הוכיחו את יעילותם בהתמרת תאים במבחנה וב-vivo ונמצאים בשימוש נרחב לחיסון וריפוי גנטי. כאן, אנו מתארים הליך לבנייה, ייצור וטיהור של וקטורי CAV2, מה שמוליד תרחיפים נגיפיים בעלי טיטר גבוה.

ייצור וטיהור של וקטורים שמקורם באדנווירוס כלבים מסוג 2 שאינם משוכפלים

כאן, מוצג פרוטוקול ליצירת כרומוזום מלאכותי חיידקי זיהומי המכיל cDNA באורך מלא של ה-RNA הגנומי החיובי של נגיף דלקת המוח היפני. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה לבניית cDNA פונקציונלי של נגיפי RNA חיוביים אחרים, מה שהופך אותו לכלי גנומי רב עוצמה לחקר ביולוגיה של נגיפים.

חיידקים מלאכותיים כרומוזומים: Genomics כלי פונקציונלי לחקר חיובי גדיל RNA וירוסים

אנו מתארים שיטה ליצירת, הגברה גנטית שונה וירוסים syncytial הנשימה (RSVs) ואת וזמינותו של פלאק ממוטב עבור RSVs. אנו ממחישים לפרוטוקול זה על-ידי יצירת שני וירוסים רקומביננטי בהתאמה לאפשר כימות של שכפול RSV ולחיות ניתוח של RSV הכללה וגופי בגרגרים הכללה גופים הקשורים דינמיקה.

דור, הגברה, טיטור של Recombinant וירוסים Syncytial הנשימה

המגיפה האחרונה של וירוס Zika מדגיש את החשיבות של הקמת גישות גנטיות הפוכה לפתח חיסונים ו/או אסטרטגיות טיפוליות. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול כדי להציל וירוס מדבק רקומביננטי Zika מתוך שיבוט באורך מלא cDNA התאספו בכרומוזום מלאכותי חיידקי תחת השליטה של cytomegalovirus ירוס האדם המוקדם מיידית היזם.

הצלה של וירוס רקומביננטי Zika מתוך כרומוזום מלאכותי בקטריאלי cDNA שיבוט

כאן אנו מספקים הליך מפורט לייצור, טיהור וכימות של נגיף מחלת ניוקאסל רקומביננטי בעל טיטר גבוה. פרוטוקול זה מניב באופן עקבי &gt; 6 × 109 יחידות יוצרות פלאק/מ"ל, ומספק כמויות נגיפיות המתאימות למחקרים בבעלי חיים in vivo . מתוארים מבחני בקרת איכות נוספים להבטחת בטיחות in vivo .

ייצור של נגיף מחלת ניוקאסל רקומביננטי בעל טיטר גבוה מנוזל אלנטואי

מאמר פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה של מיקרו-הזרקה של רטרו-וירוס RCAS(A) בעדשת עוף עוברית ככלי לחקר תפקוד באתרו וביטוי חלבונים במהלך התפתחות העדשה.

מיקרו-הזרקה של רטרו-וירוס רקומביננטי RCAS(A) לעדשת עוף עוברית

מאמר זה מציג שיטה פשוטה להכנת אנטיגן של 4 יחידות המגלוטינציה לבדיקה סרולוגית של נגיף מחלת ניוקאסל. על ידי קביעה מדויקת של טיטר ההמגלוטינציה של האנטיגן, בשילוב עם שיטת טיטרציה לאחור קפדנית יותר, ותהליך התאמה מוגדר היטב, הוא משפר את יעילות הבדיקה, מפחית תוצאות חיוביות כוזבות ומשפר את מעקב המחלות בעופות.

אופטימיזציה של הכנת אנטיגן לבדיקת עיכוב המגלוטינציה של סרולוגיה של נגיף מחלת ניוקאסל

למדו את שיטת ההצלה של וירוס ניוקאסל רקומביננטי מ-cDNA באמצעות זיהוי תאי יונקים ושתל פלסמידים. שיטה זו מאפשרת פיתוח וקטורים לחיסונים ולטיפולים גנטיים.

הצלה של וירוס רקומביננטי ניוקאסל מחלות מcDNA

גלה סרטונים נוספים