ייצור וטיהור של וקטורים שמקורם באדנווירוס כלבים מסוג 2 שאינם משוכפלים

ב-15 השנים האחרונות, וקטורים שמקורם באדנווירוס כלבים מסוג 2 (CAV2) הוכיחו את יעילותם בהתמרת תאים במבחנה וב-vivo ונמצאים בשימוש נרחב לחיסון וריפוי גנטי. כאן, אנו מתארים הליך לבנייה, ייצור וטיהור של וקטורי CAV2, מה שמוליד תרחיפים נגיפיים בעלי טיטר גבוה.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבנות, לייצר ולטהר וקטורים נגזרים של אדנו-וירוס כלבים מסוג שני. זה מושג על ידי שיבוט תחילה של הגן המעניין לפלסמיד מעבורת. השלב השני הוא השגת פלסמיד גנומי רקומביננטי על ידי רקומבינציה הומולוגית.

לאחר מכן, העגל הפגום הרקומביננטי, שני וירוסים המיוצרים ומוגברים בקו תאים משלים טרנס. השלב האחרון הוא טיהור וריכוז הנגיף הרקומביננטי שנוצר ליישומים מגוונים in vivo ו-in vitro. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה קונפוקלית אימונופלואורסצנטית משמשת להצגת דוגמאות של התמרה ויראלית במוח המכרסם.

היתרון העיקרי של טכניקות אלו על פני שיטות קיימות כגון וקטורים שמקורם בנוירוזה אנושית הוא שאין חסינות קיימת נגד עגל שני באוכלוסיות אנושיות. לכן שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי החיסון או הריפוי הגנטי, כגון הערכת תפקידם של חלבונים המתבטאים באזורים מסוימים במוח. אז הדגמת ההליך הזה תהיה מאי KY וקורין ברגרון.

שני חוקרי פוסט-דוקטורט מהמעבדות שלנו התכוננו להליך זה יום אחד לפני הטרנספקציה על ידי זריעת תאי DKE אחד על צלחת שש בארות מגדלים תאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 ב-DMEM עם גלוקוז גבוה המכיל 7% חום, עגל עוברי מושבת, נתרן בסרום, פירובט, פניצילין וסטרפטומיצין. למחרת, התאים צריכים להיות מתכנסים ב-70 עד 80% לצורך טרנספקציה לעכל שני מיקרוגרם של PCAL GOI ה-cav הרקומביננטי שני פלסמיד גנומי עם ASC אחד כדי לשחרר את הרצף הלא ויראלי של הפלסמיד, בדוק את דפוס ההגבלה המתקבל על ידי 0.8% עיכול אלקטרופורזה של אגרו ג'ל אמור להניב שבר זוג של כ-31 קילו-בסיס המכיל את הגנום הרקומביננטי ושבר זוג שני קילו-בסיס המתאים לעמוד השדרה של הפלסמיד. מערבבים את ה-DNA המעוכל עם 200 מיקרוליטר של מאגר סילון ומערבולת למשך 10 שניות.

הוסף ארבעה מיקרוליטר של סילון ראשוני וערבב על ידי מערבולת במשך 10 שניות. סובב קצרות כדי להסיר טיפות ולדגור למשך 10 דקות. בטמפרטורת החדר, הוסף את תערובת הטרנספקציה טיפתית על תאי DKE one.

מנערים בעדינות את הצלחת כדי לפזר את התערובת באופן שווה ולדגור בחום של 37 מעלות צלזיוס. שבוע לאחר הטרנספקציה אוספים תאים ומדיום תרבית בצינור פוליפרופילן של 15 מיליליטר. לשבש תאים על ידי שלושה מחזורי חשיבה קפואים.

נקה את הליזאט על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-1, 800 פעמים G.אסוף את הסופרנטנט ואחסן במינוס 20 להתפשטות הנגיף לאחר מכן להפצת הנגיף להדביק חד-שכבת קונפלואנט של 80 עד 90% של DKE תאים אחד שגדל בבאר אחת של צלחת שש בארות עם 0.5 מיליליטר של הנגיף המכיל סופרנטנט. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה תחת תסיסה קלה לאחר שעה. הסר את החיסון והחלף אותו ב-1.5 מיליליטר של DMEM שלם המכיל 5% תאי דגירה FCS מומתים בחום ב-37 מעלות צלזיוס למשך שלושה עד ארבעה ימים.

יש לעקוב אחר התאים מדי יום להופעת אפקט ציטופתי או CPE. אם לא נראה CPE ברור. קצרו תאים לאחר ארבעה ימי תרבית וחזרו על ההגברה הנגיפית כאשר CPE ברור משפיע על רוב התאים.

בדרך כלל לאחר שניים עד ארבעה סבבי הגברה ויראליים, אספו תאים עם מדיום תרבית והפשירו שלוש פעמים כפי שהודגם קודם לכן. להדביק 80 עד 90% במקביל. תאי DKE 1 גדלו בשלוש צלחות תרבית רקמה בקוטר 10 סנטימטר תוך שימוש ב-1.5 מיליליטר של וירוס המכיל סופרנטנט לכל מנה לאחר שלושה עד ארבעה ימים כאשר CPE הושלם.

תאי קציר מכלים אלה בקוטר 10 סנטימטר משבשים אותם בשלושה מחזורי פריסטייל ומנקים את הליזאט על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות ב -1, 800 פעמים. G אוספים סופרנטנט ומאחסנים במינוס 20 עבור Cav בקנה מידה גדול שתי הגברה כדי להתחיל בהליך ההגדלה מדביקים 80 עד 90% חד-שכבות קונפלואנט של DKE אחד תאים הגדלים ב-40 צלחות תרבית רקמות בקוטר 10 סנטימטר לכל מנה משתמשים ב-0.1 מיליליטר של וירוס המכיל סופרנטנט מדולל במיליליטר אחד של DMEM שלם ללא תאי דגירה של FCS ב-37 מעלות צלזיוס למשך שלוש עד ארבע שעות תחת תסיסה קלה. לאחר שלוש עד ארבע שעות, הוסיפו חמישה מיליליטר של DMEM מלא בתוספת 5% FCS ודגרו במשך שלושה ימים.

לאחר שלושה ימים, קצרו תאים נגועים מ-40 צלחות של 10 סנטימטר בצינורות פוליפרופילן של 50 מיליליטר, תאי גלולה ב-1, 200 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. Resus משהה אותם ב-15 מיליליטר של תאים משבשים בינוניים DMEM על ידי שלושה מחזורי הקפאה-הפשרה. הסר פסולת תאים על ידי צנטריפוגה ב -1, 800 פעמים G למשך 10 דקות.

יש לאחסן את הסופרנטנט במינוס 20 לפני טיהור החלקיקים הנגיפיים לטיהור חלקיקים נגיפיים. הכן שיפוע צזיום כלוריד לא רציף בשפופרת UltraClear של 14 מיליליטר. ראשית, שפכו שני מיליליטר מתמיסת צזיום כלוריד בצפיפות גבוהה יותר לתחתית הצינור.

לאחר מכן הוסף לאט לאט שני מיליליטר של תמיסת צזיום כלוריד בצפיפות נמוכה יותר על גבי התמיסה הראשונה. טען בזהירות את הסופרנטנט הנגיפי על גבי שיפוע הצזיום כלוריד. מלאו את הצינור בשמן מינרלי עד שניים עד שלושה מילימטרים מהצנטריפוגה העליונה ברוטור SW 40 מתנדנד למשך שעה ו -30 דקות ב -130, 000 פעמים גרם ו -18 מעלות צלזיוס לאחר צנטריפוגה.

שני פסים לבנים נראים בבירור בממשק בין שתי שכבות תמיסת הצזיום כלוריד. בעזרת מחט 21 ומזרק אוספים בצד לנקב את הרצועה התחתונה המכילה שני חלקיקים בוגרים. נסה ככל האפשר להימנע מאיסוף הרצועה העליונה המתאימה לחלקיקים נגיפיים ריקים.

הכן שיפוע צזיום כלוריד רציף בצינור שקוף של 14 מיליליטר על ידי ערבוב החלקיקים הנגיפיים הקולקטיביים עם תמיסת צזיום כלוריד. מלאו את הצינור בשמן מינרלי עד שניים עד שלושה מילימטרים מהצנטריפוגה העליונה ברוטור SW 40 מתנדנד למשך 18 שעות בטמפרטורה של 130, 000 פעמים G ו- 18 מעלות. לאחר הצנטריפוגה, אסוף את העגל הלבן המכיל פס אחר פס ניקוב עם מזרק כפי שהודגם קודם לכן.

שוב, נסה להימנע מאיסוף הרצועה העליונה שנותרה. זה אמור להיות קל יותר בשיפוע הרציף הזה שמפריד בין שתי הרצועות טוב יותר. הנפח הכולל של המתלה שנאסף לא יעלה על שני מיליליטר.

לאחר מכן יש לאזן עמודה cidex G 25 PD 10 עם 30 מיליליטר PBS. טען את התרחיף הנגיפי על העמוד והשליך את הזרימה דרך ה-elute עם 500 שברים מיקרוליטר של PBS אוספים שברים חמישה עד שבעה, המכילים בדרך כלל את שני חלקיקי ה-cav המומלחים. ניתן לזהות בקלות את הנגיף המכיל שברים מכיוון שיש ריח מבורך.

לבסוף, הוסף 150 מיקרוליטר גליצרול ל-1.5 מיליליטר של תרחיף CAV 2 ואחסן ב-Eloqua במינוס 80 מעלות צלזיוס כדי לטטר cav 2 על ידי דילול נקודת קצה, להפשיר כמות של וירוס מטוהר על קרח ולבצע דילול סדרתי פי עשרה החל מ-10 למינוס שתיים עד 10 למינוס 12 ב-DEM ללא סרום. הוסיפו 50 מיקרוליטר מכל דילול ויראלי לחמש בארות של צלחת של 96 בארות, הוסיפו 1.5 כפול 10 ל-DKE הרביעי, תא אחד לכל באר דגרו את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך חמישה ימים ביום החמישי. מעקב לאחר הדבקה אחר הופעת CPE על ידי תצפית מיקרוסקופית.

טיטרים זיהומיים נקבעים כמינונים זיהומיים של תרבית רקמה חציונית באמצעות השיטה הסטטיסטית קריאה וגברים לפני ייצור וקטורים ויראליים. גנום CAV שני רקומביננטי הנושא קלטת ביטוי לטרנסגן נבנה באמצעות טכניקות ביולוגיה מולקולרית סטנדרטיות. ראשית, הגן המעניין משובט בפלסמיד מעבורת כקלטת ביטוי עם מקדם מוקדם של ציטומגלווירוס ואות פוליאדנילציה המוקף בשני CAV שני רצפים גנומיים נגזרים המייצגים את רצפי המטרה של רקומבינציה במעלה הזרם ובמורד הזרם.

בשלב שני, קלטת הביטוי מוכנסת מפלסמיד המעבורת לגנום CAV 2 על ידי רקומבינציה הומולוגית. הכנסת קלטת הביטוי של GOI תוביל למחיקת ה- EA וחלק מהגן E one B בגנום הרקומביננטי. לאחר קבלת הפלסמיד הגנומי הרקומביננטי, חלקיקים נגיפיים מיוצרים באמצעות CAV שני E אחד המשלים תאי DKE one.

ניתן לדמיין בקלות אפקט ציטופתי ברור הנובע מהכמות הגדולה של חלקיקים נגיפיים המיוצרים בתאים נגועים על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר או על ידי ביטוי טרנסגנים. דוגמה זו היא של GFP המבטא CAV שני וקטור. לאחר מספר סבבי הגברה ויראלית באמצעות תאי DKE אחד טריים, חלקיקים נגיפיים מטוהרים על ידי אולטרה-צנטריפוגה על שיפועי צזיום כלוריד.

חלקיקים נגיפיים מרוכזים מופיעים כשתי רצועות זוהרות בתוך שיפוע הצזיום. הרצועה התחתונה מתאימה ל-cav 2 רקומביננטי בוגר שיש לאסוף. בעוד שהרצועה העליונה מכילה חלקיקים ריקים שאינם זיהומיים שיש להימנע מהם.

ניתן להשתמש בווקטור העגל הרקומביננטי שנוצר כדי להמיר כמעט את כל סוגי התאים במגוון רחב של מינים, במבחנה או במבחנה. מוצגת כאן דוגמה אחת ליישום שבה GFP המבטא CAV 2 הוזרק על ידי מונית סטריאו לאזורים שונים במערכת העצבים המרכזית של העכבר. מכיוון שפרוטוקול זה מניב טיטר גבוה ומלאי ויראלי טהור וטהור הזרקת מלאי ויראלי של מיקרוליטר אחד בלבד של GFP מדולל PBS המבטא CAV שני וקטור בפיתול המשונן, או DG, מוביל להתמרה עצבית של 40 עד 50%.

יתר על כן, בשל היכולת של C two להיות מועבר לאחור באקסונים הזרקה של שני מיקרוליטרים של GFP מדולל PBS המבטא CAV שני וקטור בסטריאטום מאפשר התמרה של כמעט 80% מנוירוני ה-AAL של כושי סטרי בתת-הסאבים, nigra pars compacta לאחר פיתוחיו. טכניקות אלה סוללות את הדרך לחוקרים בתחומים או בחיסונים או במדעי המוח לחקור אנטיגנים חדשים ותפקוד גנים במוח במודלים רבים ומגוונים של בעלי חיים. אז אל תשכח שעבודה עם שני וקטורים נגזרים של CAF יכולה להיות מסוכנת וזהירה ביותר, כגון אמצעי בלימה וטיפול נכון בפסולת, כולל ציוד מגן אישי ועבודה במכסי זרימה למינאריים ב-BSL יש לנקוט תמיד בשתי מעבדות בעת ביצוע הליך זה.