ניתוח דינמיקת חלבון באמצעות מימן Exchange ספקטרומטריית מסה

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לנתח את הגמישות המאשרת בחלבונים ושינויים בהם בתגובה לאינטראקציות סביבתיות, קשירת ליגנד או חלבון. זה מושג על ידי דגירה מוקדמת של החלבון המבוקש בתנאים שונים החשודים כמשפיעים על אישור החלבון, כגון קשירת ליגנד. לאחר מכן תערובת התגובה מדוללת לתחמוצת דאוטריום, מודגרת למרווחי זמן שונים, ולאחר מכן מנותחת על ידי ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית כדי לקבוע את מידת שילוב הדאוטרו בעמוד השדרה של הפפטיד.

קבוצות אמיד, מכיוון שבאזורים מוגנים יש ירידה בשילוב של דאוטרוס, השוואת ספקטרום הפפטידים של הניסוי בהיעדר ונוכחות של שותף מקשר מגלה שינוי של ה-OID של הספקטרום עקב הפרש המשקל בין פרוטון לדאוטרון. אזורים המציגים הגנה בולטת לאחר הוספת שותף מקשר הם אתרי קישור פוטנציאליים. בהתאם לכיסוי הרצף ולזמינות של פפטידים חופפים, ניתן לצמצם את אתרי הקישור לכמה חומצות אמינו.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בקיפול החלבונים ובתחום הדינמיקה של החלבונים, כגון כיצד חלבונים מתקפלים, כיצד הם מתפתחים, כיצד הם מגיבים להשפעות פיזיקליות וכימיות כמו עליית טמפרטורה או מתכות כבדות. כיצד קשירה דומה ואינטראקציות חלבון-חלבון יכולות להשפיע על אישור חלבון. זה גם חשוב מאוד לפיתוח תרופות חלבון לאימות קיפול תקין ולבקרת איכות כללית.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו עלולים להיתקל במספר קשיים. אם החלבון, למשל, אינו מתעכל היטב על ידי פפסין, כיסוי הרצף יהיה נמוך. אם החלבון נוטה מאוד לצבירה, הוא עלול להצטבר במהלך הדגירה או לאחר הוספת מאגר המרווה ויגרום לעוצמות אות נמוכות בספקטרומטר המסה.

בהדגמה זו, נחקור את הקישור של המלווה המולקולרי של השמרים, HP 90 למלווה שלו Sty one באמצעות ספקטרומטריית מסה של חילופי מימן STY אחד נקשר ל-HP 90 ומקל על קשירת הלקוח על ידי עיכוב פעילות ה-ABA של HB 9ty. התחל הליך זה בהכנת מאגרים, דוגמאות וחרוזים כמפורט בפרוטוקול הטקסט. כדי להכין את העמודים להחלפת מימן אמיד, פתח צד אחד של עמוד ההגנה והסר את המסנן בחוזקה.

הברג את משפך האריזה על הקצה הפתוח של העמוד. השתמש במתאם בגודל 16 אינץ' כדי לחבר מזרק ריק של חמישה מיליליטר לשקע התחתון של העמוד. הקפד לתקן אותו בחוזקה לעמוד השמירה.

מרחו כמה טיפות של חומר חרוזי slurry על גבי המשפך. משוך את הבוכנה של המזרק כדי לשאוב את התרחיץ דרך המשפך לתוך עמוד השמירה. מרחו עוד חומר חרוזי slurry על המשפך והמשיכו בהליך עד שעמוד השמירה יתמלא לחלוטין בחומר חרוזים.

לאחר מכן הסר את המשפך לפני הנחת המסנן וטבעת המסנן על הקצה הפתוח בחוזקה. הברג את מכסה העמוד על עמוד השמירה והסר את המזרק מהצד השני. סגור את שני קצוות עמודי השמירה בעזרת תקעים.

כדי למנוע התייבשות של חומר עמוד כדי להגדיר את המערכת לספקטרומטריית מסה של חילופי מימן. ראשית חבר את עמוד המלכודת לכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים או למערכת HPLC. אזן את העמודה על ידי הגדרת קצב הזרימה של משאבה A ל-0.4 מיליליטר לדקה עם 0.1% חומצה פורמית כממס.

לאחר כיול ספקטרומטר המסה, חבר את שקע ה- HPLC למקור ספקטרומטר המסה. כדי לקבוע תחילה את הפפטידים הפפטיים, חבר את עמודת פפין ולאחר מכן את העמודה האנליטית למערכת. הגדר את הפרמטרים לכרומטוגרפיה וספקטרומטריית מסה בתוכנת הבקרה על ידי בחירת סוג השיפוע ושיטת ספקטרומטריית המסה.

בחר שיפוע ארוך כדי להבטיח רזולוציה כרומטוגרפית טובה. אפשר ספקטרום מסה טנדם בספקטרומטר המסה. הכן 100 עד 200 פומו של חלבון הלם חום 90 או HSP 90 ב-100 מיקרוליטר של מאגר H שני ליטר.

מוסיפים 100 מיקרוליטר של מאגר מרווה ומערבבים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. הזרקו את דגימת 200 המיקרוליטר ליציאת ההזרקה של שסתום ההזרקה עם מזרק המילטון. העבר את שסתום ההזרקה למצב ההזרקה והתחל את תוכנית הכרומטוגרפיה.

לאחר מכן, זהה פפטידים פפטיים של חלבון הלם חום 90 על ידי חיפוש במסד נתונים אחר הפפטידים המתקבלים. הפחת את טמפרטורת המערכת לאפס מעלות צלזיוס על ידי הוספת מי קרח. חזור על שלב זה ללא ספקטרומטריית מסה טנדם ועם השיפוע שישמש לניסוי חילופי המימן בפועל.

עבור חלבון הלם חום 90 ו-STI אחד, השתמש בשיפוע של 10 דקות מ-90% ממס, 10% ממס B ל-45% ממס, A 55% ממס B, קבע את זמני השמירה של הפפטידים הפפטיים המזוהים בשיפוע המשמש וצור רשימה הכוללת רצף פפטידים, מטען פפטיד, מצב וזמן שמירה. זה ישמש לזיהוי כל פפטיד לאחר ניסויי חילופי מימן. כדי לזהות ממשקי אינטראקציה של חלבון חלבון, הגדר תחילה את שיטת השיפוע וספקטרומטריית המסה.

בתוכנת הבקרה, השתמש בשיפוע ליניארי של 10 דקות מ-90% ממס, 10% ממס B עד 45% ממס. עומס B של 55% ממס שיטת ספקטרומטריית מסה המותאמת לזיהוי בין יחסי מסה למטען של 300 עד 1,500, אם כי רוב הפפטידים יהיו מתחת ליחס מסה למטען של 1000. הגדר את שסתום ההזרקה למצב עומס ואת שסתום שש היציאות.

במצב התפלת טעינה, הגדר את קצב הזרימה של משאבת הטעינה ל-0.4 מיליליטר לדקה. לאחר הפעלת הייחוס ללא שינוי ודגימת הבקרה של 100% כמתואר בפרוטוקול הטקסט, הכינו 20 עד 100 פיקו מול של חלבון הלם חום 90 בנפח של 1 עד 5 מיקרוליטר. הוסף מאגר תחמוצת דאוטריום מותאם לטמפרטורה כדי להביא את נפח הדגימה עד 100 מיקרוליטר דגירה לפרק הזמן המדויק שהוגדר בעבר כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

בעת קביעת הטווח הדינמי של ההחלפה, הוסף 100 מיקרוליטר של קור קרח, הרווה, ופיפטה למעלה ולמטה פעמיים במהירות להזריק את 200 המיקרוליטר לשסתום ההזרקה של ה-HPLC. העבר את שסתום ההזרקה למצב ההזרקה והתחל מיד את תוכנית הכרומטוגרפיה. לאחר שתי דקות, העבר את שסתום שש היציאות ממצב העמסת המלח למצב אלוטה.

עשה זאת עבור כל חלבון בנפרד כדי לקבוע את שילוב הדאוטרון בכל פפטיד בהיעדר החלבון המקיים אינטראקציה כדי לקבוע את משטח האינטראקציה לערבב חלבון הלם חום 90 עם עודף של לפחות פי שניים של STI אחד כדי להעביר את שיווי המשקל למצב קשור, דגר את הטמפרטורה הרצויה עד להיווצרות מורכבת בשיווי משקל. לאחר הדגירה, הוסף מאגר תחמוצת דאוטריום מותאם לטמפרטורה כדי להביא את נפח הדגימה עד 100 מיקרוליטר ולדגור לפרק זמן מוגדר בדיוק. לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטר של מאגר מרווה קר כקרח, ופיפטה למעלה ולמטה פעמיים במהירות הזריקו את החלבון ופעלו כמו קודם.

נתח את הנתונים שנרכשו עם תוכנה מתאימה והשתמש בזמני השמירה שנקבעו כדי למצוא כל פפטיד בניתוח. חשב את ה-OID של התפלגות האיזוטופים עבור החלבון ללא שינוי ועבור ניסויי חילופי המימן, השווה את השילוב של דאוטרוס של חלבון המטרה בלבד ועם עודף של שותף קשירה. ניתן לעשות זאת באופן אוטומטי עם תוכנה מסחרית או באופן ידני עם תוכנית הגיליון האלקטרוני M, האינטראקציה הישירה של חלבון החלבון בין HS P 90 ל-STI 1 נבדקה על ידי השוואת ספקטרום הפפטיד האחד של STI בהיעדר ונוכחות HS P 90 לאחר תיוג תחמוצת דאוטריום.

תרשים ההבדל שהתקבל מגלה שבעיקר פפטידים ב-TPR 2 A ו-TPR 2 B מראים הגנה חזקה בנוכחות HS P 90, מה שמצביע על כך שאזורים אלה מקיימים אינטראקציה עם HS P 90. ניתן בקלות להצדיק את ההגנה ב-TPR 2 A מהמבנה הגבישי של STY אחד TPR שני A TPR שני B בקומפלקס עם פפטיד HS P 90, אשר צבוע בהתאם למספר פרוטוני העמילואיד המוגנים מפני שילוב DEUTERO. לא תמיד נצפית הגנה כה ברורה באינטראקציות חלבון חלבון.

ההגנה ב-HSP 90 בנוכחות STI 1 אינה בולטת ואינה מקומית כמו ב-STI one. כל הפפטידים מראים הגנה מוגברת מעט מפני שילוב דאוטרו. מוצג כאן ייצוג מצויר של שמרים HS P 90 צבוע בהתאם למספר פרוטוני האמלי המוגנים מפני שילוב דאוטרון, STY אחד מייצב את HS P 90 ברחבי העולם מכיוון שאף אזור של החלבון לא מראה גמישות רבה יותר בנוכחותו.

לא ברור אם שילוב דאוטרון מופחת זה מקורו באינטראקציה ישירה עם סטי אחד או באמצעות השפעות אלוסטריות. עם אישור התיוג הרציף של HSP 90, חילופי מימן, נעשה שימוש בספקטרומטריית מסה כדי לחקור את הדינמיקה של אזורי חלבון שונים. מוצגים כאן הספקטרום של פפטיד 43 עד 62 מתחום קשירת הנוקלאוטידים של HSP 90.

בנוכחות ובהיעדר STI אחד, ספקטרום הפפטידים מראה שילוב תלוי זמן של דאוטריום שגדל עם דגירה ארוכה יותר. מידת ההגנה משתנה לאורך זמן הדגירה, ומראה הבדל גדול יותר בזמני הדגירה הקצרים יותר ושערי חליפין כמעט דומים בנקודת הזמן הארוכה ביותר. זה מצביע על רמה נמוכה יותר של ייצוב או אזור של אינטראקציות דינמיות עם דיסוציאציה וסוציאציה תכופות.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על תנאים קבועים בקפדנות ולהכין הכל לפני תחילת תגובת ההחלפה. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כדי לענות על שאלות נוספות כמו מיקום אתרי אינטראקציה בקומפלקסים של חלבונים.