Name: ניתוח דינמיקת חלבון באמצעות מימן Exchange ספקטרומטריית מסה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-29T15:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: חקור דינמיקת חלבון באמצעות ספקטרומטריית מסה עם מימן Exchange לזיהוי אתרי קישור ואינטראקציות חלבון-חלבון. שיטה זו מאפשרת הבנה מעמיקה של גמישות קונפורמציונלית ופונקציית חלבונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים מ &#39;Boysen להערות על כתב היד. פרויקט זה מומן על ידי דויטשה Forschungsgemeinschaft (SFB638 ותואר שני 1278/4-1 לMPM, ואשכול של אקסלנס: CellNetworks EXC 81/1). MPM הוא חוקר של האשכול של אקסלנס: CellNetworks.

<ol><li>Saibil, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+studied+by+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Conformational changes studied by cryo-electron microscopy.</a> Nat. Struct. Biol. 7 (9), 711-714 (2000).</li>
<li>Mittermaier, A., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+provide+new+insights+in+NMR+studies+of+protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics.</a> Science. 312 (5771), 224-228 (2006).</li>
<li>Hoofnagle, A. N., Resing, K. A., Ahn, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+analysis+by+hydrogen+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Protein analysis by hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 1-25 (2003).</li>
<li>Wales, T. E., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+exchange+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Mass.+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics.</a> Mass. Spectrom. Rev. 25 (1), 158-170 (2006).</li>
<li>Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+exchange+mass+spectrometry+for+studying+protein+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics.</a> Chem Soc. Rev. 40 (3), 1224-1210 (2011).</li>
<li>Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+structure+effects+on+peptide+group+hydrogen+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange.</a> Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).</li>
<li>Rist, W., Jørgensen, T. J. D., Roepstorff, P., Bukau, B., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+temperature-induced+conformational+changes+in+the+Escherichia+coli+heat+shock+transcription+factor+sigma+32+by+amide+hydrogen+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Mapping temperature-induced conformational changes in the Escherichia coli heat shock transcription factor sigma 32 by amide hydrogen exchange.</a> The Journal of biological chemistry. 278 (51), 51415-51421 (1074).</li>
<li>Englander, J. J., Rogero, J. R., Englander, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+hydrogen+exchange+studied+by+the+fragment+separation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Protein hydrogen exchange studied by the fragment separation method.</a> Anal Biochem. 147 (1), 234-244 (1985).</li>
<li>Zhang, Z., Smith, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+amide+hydrogen+exchange+by+mass+spectrometry%3A+a+new+tool+for+protein+structure+elucidation%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation.</a> Protein Sci. 2 (4), 522-531 (1993).</li>
<li>Cravello, L., Lascoux, D., Forest, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+different+proteases+working+in+acidic+conditions+to+improve+sequence+coverage+and+resolution+in+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+of+large+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom.+%3A+RCM%22%5BJournal%5D)">Use of different proteases working in acidic conditions to improve sequence coverage and resolution in hydrogen/deuterium exchange of large proteins.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. : RCM. 17 (21), 2387-2393 (2003).</li>
<li>Rand, K. D., Zehl, M., Jensen, O. N., Jørgensen, T. J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+hydrogen+exchange+measured+at+single-residue+resolution+by+electron+transfer+dissociation+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+chem%22%5BJournal%5D)">Protein hydrogen exchange measured at single-residue resolution by electron transfer dissociation mass spectrometry.</a> Anal chem. 81 (14), 5577-5584 (2009).</li>
<li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+capture+dissociation+of+electrosprayed+protein+ions+for+spatially+resolved+hydrogen+exchange+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Electron capture dissociation of electrosprayed protein ions for spatially resolved hydrogen exchange measurements.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (35), 11574-11575 (2008).</li>
<li>Yamada, N., Suzuki, E. -I., Hirayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+interface+of+a+large+protein-protein+complex+using+H%2FD+exchange+and+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Identification of the interface of a large protein-protein complex using H/D exchange and Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 16 (4), 293-299 (2002).</li>
<li>Lee, T., Hoofnagle, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Docking+motif+interactions+in+MAP+kinases+revealed+by+hydrogen+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Docking motif interactions in MAP kinases revealed by hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Mol. Cell. 14 (1), 43-55 (2004).</li>
<li>Hasan, A., Smith, D. L., Smith, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-crystallin+regions+affected+by+adenosine+5%27-triphosphate+identified+by+hydrogen-deuterium+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Alpha-crystallin regions affected by adenosine 5'-triphosphate identified by hydrogen-deuterium exchange.</a> Biochem. 41 (52), 15876-15882 (2002).</li>
<li>Lanman, J., Lam, T. T., Emmett, M. R., Marshall, A. G., Sakalian, M., Prevelige, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+interactions+in+HIV-1+maturation+identified+by+hydrogen-deuterium+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Key interactions in HIV-1 maturation identified by hydrogen-deuterium exchange.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (7), 676-677 (2004).</li>
<li>Wang, L., Lane, L. C., Smith, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+structural+changes+in+viral+capsids+by+hydrogen+exchange+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Detecting structural changes in viral capsids by hydrogen exchange and mass spectrometry.</a> Protein Sci. 10 (6), 1234-1243 (2001).</li>
<li>Pan, H., Raza, A. S., Smith, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibrium+and+kinetic+folding+of+rabbit+muscle+triosephosphate+isomerase+by+hydrogen+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Equilibrium and kinetic folding of rabbit muscle triosephosphate isomerase by hydrogen exchange mass spectrometry.</a> J. Mol. Biol. 336 (5), 1251-1263 (2004).</li>
<li>Mazon, H., Marcillat, O., Forest, E., Smith, D. L., Vial, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+dynamics+of+the+GdmHCl-induced+molten+globule+state+of+creatine+kinase+monitored+by+hydrogen+exchange+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Conformational dynamics of the GdmHCl-induced molten globule state of creatine kinase monitored by hydrogen exchange and mass spectrometry.</a> Biochem. 43 (17), 5045-5054 (2004).</li>
<li>Lanman, J., Lam, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+interactions+in+HIV-1+capsid+protein+assembly+by+high-resolution+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of novel interactions in HIV-1 capsid protein assembly by high-resolution mass spectrometry.</a> J. Mol. Biol. 325 (4), 759-772 (2003).</li>
<li>Rist, W., Graf, C., Bukau, B., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amide+hydrogen+exchange+reveals+conformational+changes+in+hsp70+chaperones+important+for+allosteric+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+chem%22%5BJournal%5D)">Amide hydrogen exchange reveals conformational changes in hsp70 chaperones important for allosteric regulation.</a> J. Biol. chem. 281 (24), 16493-16501 (2006).</li>
<li>Graf, C., Stankiewicz, M., Kramer, G., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+and+kinetically+resolved+changes+in+the+conformational+dynamics+of+the+Hsp90+chaperone+machine%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Spatially and kinetically resolved changes in the conformational dynamics of the Hsp90 chaperone machine.</a> EMBO J. 28 (5), 602-613 (2009).</li>
<li>Lee, C. -T., Graf, C., Mayer, F. J., Richter, S. M., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+regulation+of+Hsp90+by+the+co-chaperone+Sti1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the regulation of Hsp90 by the co-chaperone Sti1.</a> EMBO J. 31 (6), 1518-1528 (2012).</li>
<li>Lou, X., Kirchner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deuteration+distribution+estimation+with+improved+sequence+coverage+for+HX%2FMS+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Deuteration distribution estimation with improved sequence coverage for HX/MS experiments.</a> Bioinformatics. 26 (12), 1535-1541 (2010).</li>
<li>Kreshuk, A., Stankiewicz, M., Lou, X., Kirchner, M., Hamprecht, F. A., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+and+analysis+of+bimodal+isotope+peak+distributions+in+H%2FD+exchange+mass+spectrometry+using+HeXicon%5BTitle%5D)+AND+%22Intl.+J.+mass+spectrom%22%5BJournal%5D)">Automated detection and analysis of bimodal isotope peak distributions in H/D exchange mass spectrometry using HeXicon.</a> Intl. J. mass spectrom. 302 (1-3), 125-131 (2011).</li>
<li>Walters, B. T., Ricciuti, A., Mayne, L., Englander, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+back+exchange+in+the+hydrogen+exchange-mass+spectrometry+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Minimizing back exchange in the hydrogen exchange-mass spectrometry experiment.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23 (12), 2132-2139 (2012).</li>
<li>Weis, D. D., Wales, T. E., Engen, J. R., Hotchko, M., Ten Eyck, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+EX1+kinetics+in+H%2FD+exchange+mass+spectrometry+by+peak+width+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of EX1 kinetics in H/D exchange mass spectrometry by peak width analysis.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (11), 1498-1509 (2006).</li>
<li>Fang, J., Rand, K. D., Beuning, P. J., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((False+EX1+signatures+caused+by+sample+carryover+during+HX+MS+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Intl.+J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">False EX1 signatures caused by sample carryover during HX MS analyses.</a> Intl. J. Mass Spectrom. 302 (1-3), 19-25 (2011).</li>
<li>Deng, Y., Smith, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+unfolding+domains+in+large+proteins+by+their+unfolding+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Identification of unfolding domains in large proteins by their unfolding rates.</a> Biochem. 37 (18), 6256-6262 (1998).</li>
<li>Wales, T. E., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+unfolding+of+diverse+SH3+domains+on+a+wide+timescale%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Partial unfolding of diverse SH3 domains on a wide timescale.</a> J. Mol. Biol. 357 (5), 1592-1604 (2006).</li>
<li>Pan, Y., Piyadasa, H., O'Neil, J. D., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+dynamics+of+a+membrane+transport+protein+probed+by+h%2Fd+exchange+and+covalent+labeling%3A+the+glycerol+facilitator%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Conformational dynamics of a membrane transport protein probed by h/d exchange and covalent labeling: the glycerol facilitator.</a> J. Mol. Biol. 416 (3), 400-413 (2012).</li>
<li>Hebling, C. M., Morgan, C. R., Stafford, D. W., Jorgenson, J. W., Rand, K. D., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+analysis+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+nanodiscs+by+hydrogen+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+chem%22%5BJournal%5D)">Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Anal chem. 82 (13), 5415-5419 (2010).</li>
<li>Abzalimov, R. R., Kaplan, D. A., Easterling, M. L., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+conformations+can+be+probed+in+top-down+HDX+MS+experiments+utilizing+electron+transfer+dissociation+of+protein+ions+without+hydrogen+scrambling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Protein conformations can be probed in top-down HDX MS experiments utilizing electron transfer dissociation of protein ions without hydrogen scrambling.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20 (8), 1514-1517 (2009).</li>
</ol>

יש לנו מה למסור.

עקידת שותף אינטראקציה לחלבון באופן בלתי נמנע גורמת לשינויים בנגישות ממס על אתר הקישור. בנוסף, חלבונים רבים עוברים שינויים דינמיים קונפורמציה על כריכה, המשפיעים על אזורים אחרים מאשר הממשק מחייב בפועל. HX-MS היא שיטה חזקה כדי לעקוב אחר שינויים אלה, והוא אפילו מסוגל לחשוף שינויי קונפורמציה בחלבונים על לוחות זמנים ששיטות אחרות לא יכולות לכסות. כדי לבצע בהצלחה HX-MS שלוש נקודות הן קריטיות: 1) הגדרת מערכת אופטימלית; 2)...

מספר המבנים גבישיים של חלבונים וקומפלקסי חלבונים גדל בקצב מהיר בשנים האחרונות. הם מציגים תמונות לא יסולא בפז של הארגון המבני של חלבונים אלה ולספק בסיס לניתוח תפקוד המבנה. עם זאת, הדינמיקה של חלבונים ושינויי קונפורמציה, שהם חיוניים לתפקודם, מתגלה לעתים רחוקות על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרן רנטגן. Cryo-electronmicroscopy, לעומת זאת, הוא מסוגל ללכוד מתחמי חלבון וחלבון בתצורות שונות, אך בדרך כלל לא יכול לפתור את שינויי קונפורמציה לרמת מבנה משני 1. דינמיקה קונפורמציה של חלבונים בתמיסה בפרטים אטומיים יכולה להיפתר רק על ידי תמ"ג, אך בשיטה זו היא עדיין מוגבלת לחלבונים בגדלים קטנים יחסית (בדרך כלל ≤ 30 KDA) וזקוק לריכוז גבוה של חלבונים (≥ 100 מיקרומטר), דבר המקשה ניסויים עם חלבונים נוטים oligomerization או צבירה 2. שיטה אחת שהוא מסוגל לגשר בין קריסטלוגרפיה ברזולוציה הגבוהה של קרני רנטגן, cryo-electronmicroscopy ושאינו מוגבל על ידי גודל חלבון או ריכוז הוא מימן-1 אמיד H / 2 H-חליפין (HX) בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (MS). בשנים האחרונות שיטה זו התפתחה לכלי אנליטי חשוב לניתוח דינמיקת חלבון, קיפול חלבון, חלבון יציבות ושינויי קונפורמציה 3-5. הבסיס המולקולרי של שיטה זו הוא באופי יציב של עמוד השדרה מימנים אמיד בחלבונים, שיחליפו עם אטומי דאוטריום כאשר החלבון ממוקם בD 2 O פתרון. העלייה שלאחר מכן במסת חלבון לאורך הזמן נמדדת עם רזולוציה גבוהה טרשת נפוצה. בפפטידים בלתי מובנים קצרים HX רק תלוי בטמפרטורה, ריכוז זרז (OH -, H 3 O + כלומר pH, ראה איור 3) ורשתות צד חומצת אמינו של שיירים סמוכים בשל אינדוקטיביים, חתולהשפעות alytic וסטריות. השפעות אלה על ch k שער חליפין כימיים הפנימי היו לכמת באלגנטיות על ידי באי et al. 6 ותכנית זמינה (באדיבות ז''אנג), המחשבת ch k לכל חומצת אמינו בתוך פוליפפטיד התלוי בpH וטמפרטורה. ב-pH הניטרלי וטמפרטורות הסביבה ch k הוא בסדר הגודל של 10 1 -10 3 שניות -1. בחלבונים מקופלים HX יכול להיות 2-9 סדר גודל איטי בעיקר בשל קשרי מימן במבנה משני ובמידה קלה בשל גישה מוגבלת של התייבשות OH - יונים לפנים של חלבון מקופל ומהודק. HX בחלבוני ילידים לכן מסבך, החלפה חלקית או גלובלי התגלגלות כימית וקפל שוב למצב הטבעי על פי משוואה (1) ושעיר חליפין שנצפו k תצפיות תלויות באופ k שיעור פתיחה, CL k שער סגירה ואת חילופי הכימיים הפנימיים rate k ch על פי משוואה (2). <img alt="משוואות 1-2" src="/files/ftp_upload/50839/50839eq1-2.jpg"> בתנאי מדינה האם של אופ k הוא הרבה יותר קטן מאשר ch k ויכול להיות מוזנח במכנה. ישנם שני משטרי חילופי קיצוניים בשם EX1 וEX2. אם CL k הוא הרבה יותר קטן מאשר ch k (EX1) השיעור שנצפה הוא כמעט שווה לשיעור הפתיחה וHX מאפשר תצפית מיידית של התגלגלות של אלמנט מבני. כגון משטר חליפין, שבו כל תמורת הפרוטונים אמיד מייד עם פתיחתו של היסוד המבני, היא לצפות בקלות בטרשת הנפוצה על ידי הפצת bimodal של פסגות איזוטופ 7. אם CL k הוא הרבה יותר גדול מch k (EX2) השיעור שנצפה הוא יחסי ch k לפיה המתמיד המידתיות שווה לאיזוני התגלגלות קיפולי אופ K u = k הקבוע CL. בתנאים אלה, אירועי פתיחה וסגירה רבים הם הכרחיים לפני כל החלפת הפרוטונים אמיד לdeuterons, מה שמובילים לעלייה הדרגתית במסה ממוצעת בעת החלוקה איזוטופי נשארה בערך אותו הדבר. משטר EX2 מאפשר קביעת האנרגיה החופשית של התגלגלות ΔG u ולכן היציבות של אלמנט מבני. בתנאי מדינה האם של משטר EX2 הוא נפוץ ביותר. עלייה של pH ובנוסף סוכני chaotropic יכולה להזיז את מנגנון החליפין לEX1. לכן, HX-MS יכול לשמש כדי לחקור התרמודינמית וכן פרמטרים הקינטית של קיפול חלבונים ושינויי קונפורמציה. כפי שצוין לעיל HX הוא במהותו pH וטמפרטורה תלויה ואת חילופי זמן מחצית החיים של פרוטון נחשף ממס לחלוטין מהקבוצה אמיד עמוד השדרה הוא בין 5-400 אלפיות שני ב-pH הפיזיולוגי (pH 7.6) ו30 מעלות צלזיוס, אבל 10 דקות ל&gt; שעות 15 עם ממוצע של&gt; שעה 2 ב-pH 2.9 ו0 °C (פרט לפרוטון של הקשר אמיד עמוד השדרה הראשון של פוליפפטיד, שמחליף עם זמן מחצית חיים של CA. 1-2 דק '). תחת תנאים כאלה איטיים החלפה אפשר לעכל את המדגם באמצעות פרוטאזות (למשל פפסין) הפועלים בתנאים אלה, עם יציאה החוצה לאבד את כל המידע הכלול בdeuterons המשולב. מאז כניסתה של מערכת העיכול פפטי בתנאי החלפה איטיים, ניתן לנתח לא רק את קינטיקה HX הכוללת של חלבונים באורך מלא, אבל HX יכול להיות מקומית לאזורים הספציפיים 8,9. רזולוציה מרחבית כרגע מוגבלת לגודל של שברים פפטי שנוצרו, שהוא באופן כללי בין 10-30 שאריות. עם זאת, שברים חופפים שנוצרו בשל האופי ספציפי של מחשוף ידי פפסין יכולים להוביל לעלייה ברזולוציה מרחבית. בנוסף, כמה פרוטאזות אחרות נמצאו להיות פעילים בתנאים להרוות, לעומת זאת, הרבה פחות יעיל מאשר עכלן 10. increa נוספתניתן להגיע se של רזולוציה מרחבית על ידי פיצול של פפטידים בשלב הגז על ידי שיטות ששמרו את דפוס deuteration כגון ניתוק לכידת אלקטרונים (ECD), ניתוק אלקטרון העברה (ETD) ודיסוציאציה multiphoton אינפרא אדום (IRMPD) 11-13. טכניקות אלו למנוע האובדן של רזולוציה מרחבית בשל הגירת intramolecular פרוטון ("ערבול"), אשר נצפתה על ידי ניתוק הנגרם התנגשות (CID) את טכניקת הפיצול הנפוצה ביותר. עם זאת, שיטות אלו דורשות אופטימיזציה לכל פפטיד בודד ולכן היא עדיין מאתגרת למדי. HX-MS כבר בשימוש כדי לנתח אינטראקציות החלבון ליגנד וחלבונים כולל הרכבה הקופסית נגיפית 14-17. חלבון התגלגלות וקיפול מחדש, כמו גם שינויי קונפורמציה מושרה טמפרטורה נחקרו 7,18,19. זירחון וקונפורמציה הקשורות למוטצית חומצה אמינית אחת משתנים 16,20 וnucleotשינויי ide-induced נותחו 21,22. לכן, שיטה זו נראית מתאימה באופן אידיאלי לניתוח הרכבה ודינמיקה של מכונות מולקולריות. מועמד אחד אטרקטיבי, מנגנון שהוא עניין כללי גדול, הוא מורכב מלווה Hsp90.

<table><tbody><tr><td>maXis QTOF</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nanoAcquity UPLC</td><td>Waters Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shimadzu 10AD-VP</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 יציאות שסתום EPC6W עם מפעיל מיקרואלקטרי</td><td>Valco</td><td>#EPC6W</td><td></td></tr><tr><td>שסתום הזרקה (ידני)</td><td>Rheodyne</td><td>#7725</td><td></td></tr><tr><td>Poros AL20 מדיה</td><td>יישומית Biosystems</td><td>#1-6029-06</td><td></td></tr><tr><td>Poros R2</td><td>Applied Biosystems</td><td>#1-1118-02</td><td></td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>סיגמא</td><td>#P6887</td><td>השתמש במיקרובור פפסין טרי</td></tr><tr><td>(1 מ"מ)</td><td>IDEX</td><td>#C-128</td><td></td></tr><tr><td>מיקרובור (2 מ"מ)</td><td>IDEX</td><td>#C-130B</td><td></td></tr><tr><td>Acquity UPLC BEH C8 Column</td><td>Waters Corp.</td><td>#186002876</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>#5355000.011</td><td></td></tr><tr><td>צינורות (בקטרים שונים)</td><td>אביזרי IDEX</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>IDEX</td><td>#PK-110 עם PK-100</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח דינמיקת חלבון באמצעות מימן exchange ספקטרומטריית מסה

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

כל התהליכים התאיים תלויים בתפקוד של חלבונים. אמנם את הפונקציונליות של חלבון נתון היא התוצאה הישירה של רצף חומצות אמינו הייחודי שלה, היא הבינה שרק על ידי הקיפול של שרשרת פוליפפטיד להסדר יחיד מוגדר תלת ממדים או יותר נפוץ להרכב של תצורות interconverting. חוקר את הקשר בין קונפורמציה בחלבון ותפקודו ולכן הוא חיוני להבנה של איך חלבונים מסוגלים למלא המגוון רחב של משימות שלהם הושלמה. אפשרות אחת ללמוד שינויי קונפורמציה חלבון עובר תוך כדי התקדמות דרך מחזור הפעילות שלה היא מימן-H 1/2 H-Exchange בשילוב עם ספקטרומטריית רזולוציה גבוהה מסה (HX-MS). HX-MS היא שיטה תכליתית וחזקה, שמוסיפה ממד חדש למידע מבני שהושג על ידי למשל קריסטלוגרפיה. הוא משמש כדי ללמוד קיפול חלבונים והתגלגלות, כריכה של mol הקטןligands ecule, אינטראקציות בין חלבונים, שינויי קונפורמציה קשורות לאנזים קטליזה, וallostery. בנוסף, HX-MS משמש לעתים קרובות כאשר כמות החלבון היא מאוד מוגבלת או התגבשות של החלבון היא לא ריאלי. כאן אנו מספקים פרוטוקול כללי ללימוד דינמיקת חלבון עם HX-MS ולתאר כדוגמא כיצד לחשוף את ממשק האינטראקציה של שני חלבונים במתחם.

Hsp90 הוא מלווה מולקולרי בשמרים וחבר של משפחת מלווה Hsp90. על ידי עובר מחזור ATPase מורכב זה מסייע בצעדי קיפול מאוחרים של לקוחות חלבון רבים. קיפול יעיל דורש העברה של לקוחות מHsp70 ואינטראקציה של Sti1/Hop שיתוף המלווה. Sti1 ישירות נקשר Hsp90 ומקל על לקוח מחייב על ידי עיכוב פעילות ATPase של Hsp90. אינטראקציה של Hsp90 עם Sti1 נחקרה לאחרונה באמצעות HX-MS 23. כאן אנו מציגים תוצאות נציג של הניסויים הבסיסיים הבאות בפרוטוקול לעיל. <p class="jove_content" style=";text-align:...

קונפורמציה בחלבון ודינמיקה הן מפתח להבנת הקשר בין מבנה חלבון ותפקודו. חילופי מימן יחד עם ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה הוא שיטה תכליתית כדי ללמוד את הדינמיקה קונפורמציה של חלבונים כמו גם באפיון אינטראקציות החלבון ליגנד וחלבונים, כוללים ממשקי מגע ואפקטי allosteric.

ניתוח דינמיקת חלבון באמצעות מימן Exchange ספקטרומטריית מסה

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לנתח את הגמישות המאשרת בחלבונים ושינויים בהם בתגובה לאינטראקציות סביבתיות, קשירת ליגנד או חלבון. זה מושג על ידי דגירה מוקדמת של החלבון המבוקש בתנאים שונים החשודים כמשפיעים על אישור החלבון, כגון קשירת ליגנד. לאחר מכן תערובת התגובה מדוללת לתחמוצת דאוטריום, מודגרת למרווחי זמן שונים, ולאחר מכן מנותחת על ידי ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית כדי לקבוע את מידת שילוב הדאוטרו בעמוד השדרה של הפפטיד.קבוצות אמיד, מכיוון שבאזורים מוגנים יש ירידה בשילוב של דאוטרוס, השוואת ספקטרום הפפטידים של הניסוי בהיעדר ונוכחות של שותף מקשר מגלה שינוי של ה-OID של הספקטרום עקב הפרש המשקל בין פרוטון לדאוטרון. אזורים המציגים הגנה בולטת לאחר הוספת שותף מקשר הם אתרי קישור פוטנציאליים. בהתאם לכיסוי הרצף ולזמינות של פפטידים חופפים, ניתן לצמצם את אתרי הקישור לכמה חומצות אמינו.שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בקיפול החלבונים ובתחום הדינמיקה של החלבונים, כגון כיצד חלבונים מתקפלים, כיצד הם מתפתחים, כיצד הם מגיבים להשפעות פיזיקליות וכימיות כמו עליית טמפרטורה או מתכות כבדות. כיצד קשירה דומה ואינטראקציות חלבון-חלבון יכולות להשפיע על אישור חלבון. זה גם חשוב מאוד לפיתוח תרופות חלבון לאימות קיפול תקין ולבקרת איכות כללית.בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו עלולים להיתקל במספר קשיים. אם החלבון, למשל, אינו מתעכל היטב על ידי פפסין, כיסוי הרצף יהיה נמוך. אם החלבון נוטה מאוד לצבירה, הוא עלול להצטבר במהלך הדגירה או לאחר הוספת מאגר המרווה ויגרום לעוצמות אות נמוכות בספקטרומטר המסה.בהדגמה זו, נחקור את הקישור של המלווה המולקולרי של השמרים, HP 90 למלווה שלו Sty one באמצעות ספקטרומטריית מסה של חילופי מימן STY אחד נקשר ל-HP 90 ומקל על קשירת הלקוח על ידי עיכוב פעילות ה-ABA של HB 9ty. התחל הליך זה בהכנת מאגרים, דוגמאות וחרוזים כמפורט בפרוטוקול הטקסט. כדי להכין את העמודים להחלפת מימן אמיד, פתח צד אחד של עמוד ההגנה והסר את המסנן בחוזקה.הברג את משפך האריזה על הקצה הפתוח של העמוד. השתמש במתאם בגודל 16 אינץ' כדי לחבר מזרק ריק של חמישה מיליליטר לשקע התחתון של העמוד. הקפד לתקן אותו בחוזקה לעמוד השמירה.מרחו כמה טיפות של חומר חרוזי slurry על גבי המשפך. משוך את הבוכנה של המזרק כדי לשאוב את התרחיץ דרך המשפך לתוך עמוד השמירה. מרחו עוד חומר חרוזי slurry על המשפך והמשיכו בהליך עד שעמוד השמירה יתמלא לחלוטין בחומר חרוזים.לאחר מכן הסר את המשפך לפני הנחת המסנן וטבעת המסנן על הקצה הפתוח בחוזקה. הברג את מכסה העמוד על עמוד השמירה והסר את המזרק מהצד השני. סגור את שני קצוות עמודי השמירה בעזרת תקעים.כדי למנוע התייבשות של חומר עמוד כדי להגדיר את המערכת לספקטרומטריית מסה של חילופי מימן. ראשית חבר את עמוד המלכודת לכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים או למערכת HPLC. אזן את העמודה על ידי הגדרת קצב הזרימה של משאבה A ל-0.4 מיליליטר לדקה עם 0.1% חומצה פורמית כממס.לאחר כיול ספקטרומטר המסה, חבר את שקע ה- HPLC למקור ספקטרומטר המסה. כדי לקבוע תחילה את הפפטידים הפפטיים, חבר את עמודת פפין ולאחר מכן את העמודה האנליטית למערכת. הגדר את הפרמטרים לכרומטוגרפיה וספקטרומטריית מסה בתוכנת הבקרה על ידי בחירת סוג השיפוע ושיטת ספקטרומטריית המסה.בחר שיפוע ארוך כדי להבטיח רזולוציה כרומטוגרפית טובה. אפשר ספקטרום מסה טנדם בספקטרומטר המסה. הכן 100 עד 200 פומו של חלבון הלם חום 90 או HSP 90 ב-100 מיקרוליטר של מאגר H שני ליטר.מוסיפים 100 מיקרוליטר של מאגר מרווה ומערבבים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. הזרקו את דגימת 200 המיקרוליטר ליציאת ההזרקה של שסתום ההזרקה עם מזרק המילטון. העבר את שסתום ההזרקה למצב ההזרקה והתחל את תוכנית הכרומטוגרפיה.לאחר מכן, זהה פפטידים פפטיים של חלבון הלם חום 90 על ידי חיפוש במסד נתונים אחר הפפטידים המתקבלים. הפחת את טמפרטורת המערכת לאפס מעלות צלזיוס על ידי הוספת מי קרח. חזור על שלב זה ללא ספקטרומטריית מסה טנדם ועם השיפוע שישמש לניסוי חילופי המימן בפועל.עבור חלבון הלם חום 90 ו-STI אחד, השתמש בשיפוע של 10 דקות מ-90% ממס, 10% ממס B ל-45% ממס, A 55% ממס B, קבע את זמני השמירה של הפפטידים הפפטיים המזוהים בשיפוע המשמש וצור רשימה הכוללת רצף פפטידים, מטען פפטיד, מצב וזמן שמירה. זה ישמש לזיהוי כל פפטיד לאחר ניסויי חילופי מימן. כדי לזהות ממשקי אינטראקציה של חלבון חלבון, הגדר תחילה את שיטת השיפוע וספקטרומטריית המסה.בתוכנת הבקרה, השתמש בשיפוע ליניארי של 10 דקות מ-90% ממס, 10% ממס B עד 45% ממס. עומס B של 55% ממס שיטת ספקטרומטריית מסה המותאמת לזיהוי בין יחסי מסה למטען של 300 עד 1,500, אם כי רוב הפפטידים יהיו מתחת ליחס מסה למטען של 1000. הגדר את שסתום ההזרקה למצב עומס ואת שסתום שש היציאות.במצב התפלת טעינה, הגדר את קצב הזרימה של משאבת הטעינה ל-0.4 מיליליטר לדקה. לאחר הפעלת הייחוס ללא שינוי ודגימת הבקרה של 100% כמתואר בפרוטוקול הטקסט, הכינו 20 עד 100 פיקו מול של חלבון הלם חום 90 בנפח של 1 עד 5 מיקרוליטר. הוסף מאגר תחמוצת דאוטריום מותאם לטמפרטורה כדי להביא את נפח הדגימה עד 100 מיקרוליטר דגירה לפרק הזמן המדויק שהוגדר בעבר כמתואר בפרוטוקול הטקסט.בעת קביעת הטווח הדינמי של ההחלפה, הוסף 100 מיקרוליטר של קור קרח, הרווה, ופיפטה למעלה ולמטה פעמיים במהירות להזריק את 200 המיקרוליטר לשסתום ההזרקה של ה-HPLC. העבר את שסתום ההזרקה למצב ההזרקה והתחל מיד את תוכנית הכרומטוגרפיה. לאחר שתי דקות, העבר את שסתום שש היציאות ממצב העמסת המלח למצב אלוטה.עשה זאת עבור כל חלבון בנפרד כדי לקבוע את שילוב הדאוטרון בכל פפטיד בהיעדר החלבון המקיים אינטראקציה כדי לקבוע את משטח האינטראקציה לערבב חלבון הלם חום 90 עם עודף של לפחות פי שניים של STI אחד כדי להעביר את שיווי המשקל למצב קשור, דגר את הטמפרטורה הרצויה עד להיווצרות מורכבת בשיווי משקל. לאחר הדגירה, הוסף מאגר תחמוצת דאוטריום מותאם לטמפרטורה כדי להביא את נפח הדגימה עד 100 מיקרוליטר ולדגור לפרק זמן מוגדר בדיוק. לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטר של מאגר מרווה קר כקרח, ופיפטה למעלה ולמטה פעמיים במהירות הזריקו את החלבון ופעלו כמו קודם.נתח את הנתונים שנרכשו עם תוכנה מתאימה והשתמש בזמני השמירה שנקבעו כדי למצוא כל פפטיד בניתוח. חשב את ה-OID של התפלגות האיזוטופים עבור החלבון ללא שינוי ועבור ניסויי חילופי המימן, השווה את השילוב של דאוטרוס של חלבון המטרה בלבד ועם עודף של שותף קשירה. ניתן לעשות זאת באופן אוטומטי עם תוכנה מסחרית או באופן ידני עם תוכנית הגיליון האלקטרוני M, האינטראקציה הישירה של חלבון החלבון בין HS P 90 ל-STI 1 נבדקה על ידי השוואת ספקטרום הפפטיד האחד של STI בהיעדר ונוכחות HS P 90 לאחר תיוג תחמוצת דאוטריום.תרשים ההבדל שהתקבל מגלה שבעיקר פפטידים ב-TPR 2 A ו-TPR 2 B מראים הגנה חזקה בנוכחות HS P 90, מה שמצביע על כך שאזורים אלה מקיימים אינטראקציה עם HS P 90. ניתן בקלות להצדיק את ההגנה ב-TPR 2 A מהמבנה הגבישי של STY אחד TPR שני A TPR שני B בקומפלקס עם פפטיד HS P 90, אשר צבוע בהתאם למספר פרוטוני העמילואיד המוגנים מפני שילוב DEUTERO. לא תמיד נצפית הגנה כה ברורה באינטראקציות חלבון חלבון.ההגנה ב-HSP 90 בנוכחות STI 1 אינה בולטת ואינה מקומית כמו ב-STI one. כל הפפטידים מראים הגנה מוגברת מעט מפני שילוב דאוטרו. מוצג כאן ייצוג מצויר של שמרים HS P 90 צבוע בהתאם למספר פרוטוני האמלי המוגנים מפני שילוב דאוטרון, STY אחד מייצב את HS P 90 ברחבי העולם מכיוון שאף אזור של החלבון לא מראה גמישות רבה יותר בנוכחותו.לא ברור אם שילוב דאוטרון מופחת זה מקורו באינטראקציה ישירה עם סטי אחד או באמצעות השפעות אלוסטריות. עם אישור התיוג הרציף של HSP 90, חילופי מימן, נעשה שימוש בספקטרומטריית מסה כדי לחקור את הדינמיקה של אזורי חלבון שונים. מוצגים כאן הספקטרום של פפטיד 43 עד 62 מתחום קשירת הנוקלאוטידים של HSP 90.בנוכחות ובהיעדר STI אחד, ספקטרום הפפטידים מראה שילוב תלוי זמן של דאוטריום שגדל עם דגירה ארוכה יותר. מידת ההגנה משתנה לאורך זמן הדגירה, ומראה הבדל גדול יותר בזמני הדגירה הקצרים יותר ושערי חליפין כמעט דומים בנקודת הזמן הארוכה ביותר. זה מצביע על רמה נמוכה יותר של ייצוב או אזור של אינטראקציות דינמיות עם דיסוציאציה וסוציאציה תכופות.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על תנאים קבועים בקפדנות ולהכין הכל לפני תחילת תגובת ההחלפה. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כדי לענות על שאלות נוספות כמו מיקום אתרי אינטראקציה בקומפלקסים של חלבונים.

analyzing-protein-dynamics-using-hydrogen-exchange-mass-spectrometry

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

MALDI-TOF ספקטרומטריית מסה נוצל בהצלחה כדי לפקח על חילופי אמיד מימן / דאוטריום בהפעלת חלבון kinase Pak2.

אמיד מימן / דאוטריום Exchange &amp; MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית ניתוח של הפעלת Pak2

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים לספקטרומטריית מסה של חילופי מימן/דאוטריום במצב מוצק (ssHDX-MS) וספקטרומטריית מסה של תיוג פוטוליטי במצב מוצק (ssPL-MS) עבור חלבונים באבקות מוצקות. השיטות מספקות מידע ברזולוציה גבוהה על קונפורמציה של חלבונים ואינטראקציות במצב מוצק אמורפי, שעשוי להיות שימושי בתכנון ניסוח.

Mass spectrometric גישות לחקר מבנה חלבון ואינטראקציות באבקות Lyophilized

גמישות קונפורמציה משחקת תפקיד קריטי בתפקוד חלבון. בזאת, אנו מתארים את השימוש של ספקטרומטריית מסת electrospray יינון הזמן לפתור מצמידה את חילופי המימן-דאוטריום חיטוט השינויים המבניים המהירים שמניעים פונקצית חלבוני הורה אי סדר.

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

אחד התנאים המאתגרים ביותר מתח כי אורגניזמים נתקלים במהלך חייהם כרוכה ההצטברות של חמצון. במהלך סטרס חמצוני, תאים בכבדות להסתמך על מלווים מולקולרית. כאן, אנו מציגים שיטות השתמשו כדי לחקור את מוסדר חמצון-חיזור צבירת נגד הפעילות, כמו גם כדי לעקוב אחר שינויים מבניים המסדירים את הפונקציה המלווה באמצעות HDX-MS.

הגדרת פעילות מוסדר חמצון-חיזור המלווה של Hsp33 ומיפוי השינויים הסתגלותי על Hsp33 באמצעות ספקטרומטר מסה של המרת מימן-דאוטריום

סינתזות Lanthipeptide לזרז תגובות מרובות צעדים במהלך הביוסינתזה של מוצרים טבעיים פפטיד. כאן, אנו מתארים רציף, מלמטה למעלה, מימן-deuterium חילופי ספקטרומטריית מסה (HDX-MS) זרימת עבודה שניתן להפעיל כדי ללמוד את הדינמיקה הקונפורמטיבית של סינתטאז lanthipeptide, כמו גם אנזימים דומים אחרים המעורבים ביוסינתזה של מוצר טבעי פפטיד.

פלטפורמת ספקטרומטריית מסה של חילופי מימן-דיטריום (HDX-MS) לבדיקת אנזימים ביוסינתטיים פפטיד

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור אלקטרופורזה מבוססת אלקטרופורזה נימית מימן / דיוטריום חילופי (HDX) גישה בשילוב עם ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה. גישה זו מאפיינת את ההבדל במבנים מסדר גבוה יותר בין מיני חלבונים שונים, כולל חלבונים במצבים שונים ופרוטאופורמים שונים, על ידי ביצוע HDX דיפרנציאלי בו זמנית והפרדה אלקטרופורטית.

חילופי מימן/דיטריום מבוססי נימי אלקטרופורזה לאפיון קונפורמציה של חלבונים עם ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה

ההרכב המבני של אלפא-סינוקלאין מונומרי משפיע על תפקודו הפיזיולוגי ועל תכונותיו הפיזיקוכימיות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד לבצע ספקטרומטריית מסות חילופי מימן/דאוטריום של אלפיות השנייה וניתוחי נתונים מאוחרים יותר כדי לקבוע מידע קונפורמי על המונומר של חלבון זה בעל הפרעה פנימית בתנאים פיזיולוגיים.

ספקטרומטריית מסות חילופי מימן/דאוטריום של אלפיות השנייה לחקר הדינמיקה המבנית של אלפא-סינוקלאין בתנאים פיזיולוגיים

חנקן הוא נוזל סופר קריטי אפקטיבי לתהליכי מיצוי או ייבוש בשל גודלה הקטן המולקולרי, צפיפות גבוהה במשטר הסופר קריטי כמעט נוזלי, ואדישות כימית. אנו מציגים פרוטוקול ייבוש חנקן סופר קריטי לטיפול הטיהור של חומרים תגובתי, נקבוביים.

עיבוד חנקן סופר קריטי עבור הטיהור של חומרים נקבוביים ריאקטיבי

פרוטוקול עבור אפיון ההרכב הכימי של והבל הפה בזמן אמת באמצעות nanoelectrospray משני יינון מצמידים ברזולוציה גבוהה ספקטרומטר מסה הוכח.

אנליזת נשימה בזמן אמת באמצעות Nanoelectrospray משני יינון מצמידים ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה

פרוטוקול המתואר לסינתזה ידנית של oligo-peptoids ואחריו רצף ניתוח באמצעות ספקטרומטר מסה.

סינתזה וניתוח ספקטרומטר מסה של Oligo-peptoids

חקור דינמיקת חלבון באמצעות ספקטרומטריית מסה עם מימן Exchange לזיהוי אתרי קישור ואינטראקציות חלבון-חלבון. שיטה זו מאפשרת הבנה מעמיקה של גמישות קונפורמציונלית ופונקציית חלבונים.

ניתוח דינמיקת חלבון באמצעות מימן Exchange ספקטרומטריית מסה

גלה סרטונים נוספים