Name: הקמת הריכוז החיידקי המינימלי של סוכן מיקרוביאלית לתאים פלנקטוניים (MBC-P) ותאי ביופילם (MBC-B) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-02T20:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: למדו להשוות עמידות חיידקים פלנקטוניים וביופילמיים לסוכנים מיקרוביאליים באמצעות צלחת מיקרוטיטר 96-באר. שיטה זו מאפשרת לקבוע את הריכוז החיידקי המינימלי ולהבין את הגנת הביופילם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחבר רוצה להודות ללי ג'אנג, שיאן-ג'י לי, אהרון הינץ ואולם קלייטון על העזרה הערכית בכתב היד הזה. מבחנים אלה פותחו בתחילה במעבדתו של ג'ורג' אוטול, בית הספר לרפואה גייזל בדארטמות'. המחקר במעבדתו של ד"ר מאה נתמך על ידי מענקים ממועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה וסיסטיק פיברוזיס קנדה.

1. MBC-B
<ol><li>
גידול ביופילם (מותאם מאוטול9).
	<ol>
<li>לגדל תרבות של זן סוג פראי של עניין זן מוטציה במשך 16 שעות במדיום עשיר ב 37 °C (69 °F).</li>
		<li>לדלל את תרבויות לילה רווי 1:100 לתוך מדיום טרי עבור בדיקות עמידות לאנטיביוטיקה. מדיום סטנדרטי עבור P. aeruginosa הוא M63 בינוני מינימלי בתוספת מגנזיום גופרתי ארגינין (ראה טבלה 1). מדיום זה מגרה היווצרות של ביופילם חזק יותר.</li>
		<li>מוסיפים 100 מיקרוליטר מהדילול לבאר בצלחת מיקרוטיטר של 96 באר (ראו טבלה 1). מאז מבחנים אלה מבוצעים בדרך כלל משולש עבור כל זן, צריך להיות 24 בארות של כל זן.</li>
		<li>דגירה צלחת microtiter במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
חשיפת הביופילם בעל המבנה הקדם-מעוצב לשיפוע ריכוזי של אנטיביוטיקה
	<ol>
<li>הכן סדרה 10x דילול של אנטיביוטיקה עבור 7 בארות. דוגמה: עבור אנטיביוטיקה tobramycin, הריכוזים הסופיים בבארות הם 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125, ו 0.006 מ"ג / מיליליטר 5-8 . מתוך מלאי של 25 מ"ג / מ"ל, להכין 10x דילול של 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, ו 0.06 מ"ג / מיליליטר. תשאירו על הקרח.</li>
		<li>הסר את supernatant בילה (המכיל תאים פלנקטוניים) באמצעות פיפטה רב ערוצית (ראה טבלה 1).</li>
		<li>הוסף 90 μl M63 (Mg / Arg) לכל בארות.</li>
		<li>הוסף 10 μl של כל ריכוז אנטיביוטי 10x על מנת להשיג את הריכוזים הסופי הרצוי. הוסף 10 מים μl (ללא שליטה באנטיביוטיקה) לבאר הסופית עבור כל שכפול ומתח.</li>
		<li>דגירה צלחת microtiter במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
רענון המדיה ומתן אפשרות לניתוק תאים חיים.
	<ol>
<li>הסר את supernatant בילה (המכיל תאים פלנקטוניים) באמצעות פיפטה רב ערוצית.</li>
		<li>הוסף 115 μl M63 (Mg / Arg) לכל בארות.</li>
		<li>דגירה צלחת microtiter במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מבחנים לתאים חיים.
	<ol>
<li>תווית שתי צלחות אגר LB לכל צלחת microtiter 96-גם.</li>
		<li>לעקר את המכשיר multiprong (ראה טבלה 1)על ידי טבילת שיניים 100% אתנול והעברת שיניים על פני הלהבה הפתוחה של מבער Bunsen. חוזר. תן לשיניים להתקרר מעט. באמצעות המכשיר multiprong, להעביר ~ 3 μl (סכום זה נשמר בדרך כלל על קצות השיניים) של תרבות פלנקטונית מכל באר של צלחת microtiter אל פני השטח של צלחת אגר LB.</li>
		<li>דגירה צלחות אגר LB במשך 16 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>לקבוע ריכוז בקטריצילי מינימלי של האנטיביוטיקה על ידי זיהוי, לפי עין, את הניתוק לצמיחת חיידקים (איור 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. MBC-P
<ol><li>
הכנת זנים חיידקיים
	<ol>
<li>לגדל תרבות של זן סוג פראי של עניין זן מוטציה במשך 16 שעות במדיום עשיר ב 37 °C (69 °F).</li>
		<li>לדלל את תרבויות לילה רווי 1:100 לתוך מדיום טרי עבור בדיקות עמידות לאנטיביוטיקה. מדיום סטנדרטי עבור P. aeruginosa הוא M63 בינוני מינימלי בתוספת מגנזיום גופרתי ארגינין (ראה טבלה 1).</li>
		<li>הוסף 90 μl של דילול לבאר בצלחת microtiter 96-היטב (ראה טבלה 1). מאז מבחנים אלה מבוצעים בדרך כלל משולש עבור כל זן, צריך להיות 24 בארות של כל זן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
חשיפת תאים פלנקטוניים לשיפוע ריכוז של אנטיביוטיקה
	<ol>
<li>הכן סדרת דילול 10x של אנטיביוטיקה עבור 7 בארות. דוגמה: עבור אנטיביוטיקה tobramycin, הריכוזים הסופיים בבארות הם 0.032, 0.016, 0.008, 0.004, 0.002, 0.001, ו 0.0005 מ"ג / מיליליטר. מתוך מלאי של 25 מ"ג / מ"ל, להכין דילול של 0.32, 0.16, 0.08, 0.04, 0.02, 0.01, ו 0.005 מ"ג / מיליליטר. תשאירו על הקרח.</li>
		<li>הוסף 10 μl של כל ריכוז אנטיביוטי 10x על מנת להשיג את הריכוזים הסופי הרצוי. הוסף 10 מים μl (ללא שליטה באנטיביוטיקה) לבאר הסופית עבור כל שכפול ומתח.</li>
		<li>דגירה צלחת microtiter במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מבחנים לתאים חיים.
	<ol>
<li>תווית שתי צלחות אגר LB לכל צלחת microtiter 96-גם.</li>
		<li>לעקר את המכשיר multiprong (ראה טבלה 1)על ידי טבילת שיניים 100% אתנול והעברת שיניים על פני הלהבה הפתוחה של מבער Bunsen. חוזר. תן לשיניים להתקרר מעט. באמצעות המכשיר multiprong, להעביר ~ 3 μl (סכום זה נשמר בדרך כלל על קצות השיניים) של תרבות פלנקטונית מכל באר של צלחת microtiter אל פני השטח של צלחת אגר LB.</li>
		<li>דגירה צלחות אגר LB במשך 16 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>לקבוע ריכוז בקטריצילי מינימלי של האנטיביוטיקה על ידי זיהוי, לפי עין, את החתך לצמיחת חיידקים (איור 2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard-eighth edition. , Ninth Edition, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2009).</li>
<li>Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Antimicrob.+Agents%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> Int. J. Antimicrob. Agents. 35 (4), 322-332 (2010).</li>
<li>Mah, T. F., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+biofilm+resistance+to+antimicrobial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents.</a> Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).</li>
<li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-specific+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm-specific antibiotic resistance.</a> Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).</li>
<li>Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).</li>
<li>Zhang, L., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Involvement+of+a+Novel+Efflux+System+in+Biofilm-Specific+Resistance+to+Antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Involvement of a Novel Efflux System in Biofilm-Specific Resistance to Antibiotics.</a> J. Bacteriol. 190 (13), 4447-4452 (2008).</li>
<li>Zhang, L., Hinz, A. J., Nadeau, J. P., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+tssC1+Links+Type+VI+Secretion+and+Biofilm-specific+Antibiotic+Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa tssC1 Links Type VI Secretion and Biofilm-specific Antibiotic Resistance.</a> J. Bacteriol. 193 (19), 5510-5513 (2011).</li>
<li>Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biofilm-Specific+Antibiotic+Resistance+Gene%2C+ndvB%2C+is+Important+for+Expression+of+Ethanol+Oxidation+Genes+in+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Biofilm-Specific Antibiotic Resistance Gene, ndvB, is Important for Expression of Ethanol Oxidation Genes in Pseudomonas aeruginosa Biofilms.</a> J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).</li>
<li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2437(2011).</li>
<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug+tolerance+of+biofilms+and+persister+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multidrug tolerance of biofilms and persister cells.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 322, 107-131 (2008).</li>
<li>Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-First Informational Supplement. 31, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2011).</li>
<li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and Analyzing Static Biofilms. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMerritt%2C+JH+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22">Curr. Protoc. Microbiol</a>. 1, J. Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1B.1.1-1B.1.17 (2005).</li>
<li>Ramey, B. E., Parsek, M. R. Chapter 1. Growing and analyzing biofilms in fermenters. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRamey%2C+BE+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22">Curr. Protoc. Microbiol</a>. 1, J. Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1B.3.1-1B.3.14 (2005).</li>
</ol>

המחברת מצהירה כי אין לה אינטרסים כלכליים מתחרים.

עמידות לאנטיביוטיקה בתאים פלנקטוניים מוגדרת כעלייה בריכוז המעכב המינימלי (MIC) של אנטיביוטיקה עקב שינוי קבוע בתאים (למשל מוטציה). המנגנונים של התנגדות או סובלנות ספציפיים לביופילם שזוהו עד כה הם תוצאה של ביטוי של גנים מסוג בר בתוך biofilms. לפיכך, ההגדרה הקלאסית של התנגדות אינה חלה על ביופילמים. עם זאת, קבוצה נוספת של הגדרות הוצגה: מנגנוני התנגדות למנוע את האנטיביוטיקה גישה ליעדה, בעוד מנגנוני סובלנות לסגור את המטרות שלאנטיביוטיקה 10. מנגנוני עמידות לאנטיביוטיקה ספציפיים לביופילם מקיפים את שתי ההגדרות...

מבחני עמידות לאנטיביוטיקה פותחו בתחילה כדי לנסות עמידות של תרבויות פלנקטוניות (שחייה חופשית) של חיידקים. מכיוון שזיהומים חיידקיים רבים כרוכים בביופילמים (תאים המחוברים לפני השטח), התעניינו בפיתוח שיטה לעמידות לאנטיביוטיקה ספציפית לביופילם. עם זאת, רוב מבחני עמידות לאנטיביוטיקה אינם מתאימים למדידת ההתנגדות של biofilms. לדוגמה, קביעת הריכוז המעכב המינימלי (MIC) הוא תקן הזהב לקביעת עמידות לאנטיביוטיקה של תרביות חיידקים פלנקטוניים 1. זה assay כרוך ערבוב תרבות פלנקטונית מדוללת עם סדרת דילול של אנטיביוטיקה.  ריכוז האנטיביוטיקה המעכבת את הצמיחה הנראית לעין של התאים הפלנקטוניים הוא ה- MIC. מאז בדיקה זו מסתמכת על עיכוב של צמיחה, מעצם הגדרתו, זה לא יכול לעבוד עם תרביות biofilm, אשר דורש בחינת הרגישות האנטיביוטית של תאים בביופילם גדל מראש. במקום למדוד עיכוב גדילה, מבחני MBC-B המתוארים כאן קובעים את ריכוז האנטיביוטיקה שהורג תאים שכבר קיימים בביופילם. לכן, זו assay שואפת לחקות טיפולים אנטיביוטיים של זיהומים biofilm הוקמה, ולספק תצוגה רלוונטית יותר של עמידות לאנטיביוטיקה חיידקי vivo.
מאז biofilms הם בדרך כלל עמידים יותר לאנטיביוטיקה מאשר תרבויות פלנקטוניות 2-4 , היה צורך לתכנן שיטה המקשרת ישירות את עמידות לאנטיביוטיקה של biofilm לזה של תרבות פלנקטונית. לכן מטרה נוספת של שיטה זו היא להיות מסוגל להשוות ישירות את רמת עמידות לאנטיביוטיקה בין תאים פלנקטוניים וביופילם. מבחני MBC-P ו- MBC-B המתוארים כאן מאפשרים זאת מכיוון שהתאים מתרבתים בתנאים דומים. השתמשנו בשיטה זו כדי לחקור מספר גנים חשובים לעמידות לאנטיביוטיקה ספציפית לביופילם 5-8 .

<table><tbody><tr><td> <עמ>1x&nbsp; M63 </td><td></td><td></td><td> הכנה כ-5x&nbsp; מלאי M63 על ידי המסה של 15 גרם KH2PO4, 35g K2HPO4 ו-10g (NH4)2SO4 ב-1 ליטר מים. אין צורך בחיטוי מלאי זה וניתן לאחסן אותו בטמפרטורת החדר. לדלל פי 5&nbsp; מלאי 1:5, חיטוי, קירור, ואז הוסף את הרכיבים הרצויים. </td></tr><tr><td> KH2PO4 </td><td>Fisher</td><td>P285-500</p</td><td>> </td></tr><tr><td> K2HPO4 </td><td>פישר</td><td>P288-500</td><td> </td></tr><tr><td> (NH4)2SO4 </td><td>Sigma</td><td>A5132</td><td> </td></tr><tr><td> מגנזיום גופרתי </td><td>פישר</td><td>M63-500</td><td> הוסף לריכוז סופי של 1 מ"מ.&nbsp; יש להכין כציר של 1 מיליון במים ובחיטוי. </td></tr><tr><td> Tobramycin </td><td>Sigma</td><td></td><td> מכינים 50 מ"ג/m&nbsp; מניות. Aliquot ואחסן בכתובת -</טווח>20&deg;C. </td></tr><tr><td> ארגינין </td><td>סיגמא</td><td>A5131</td><td> הוסף ל-0.4% ריכוז סופי.&nbsp; הכינו כציר של 20% במים ומסננים לעקר.&nbsp; מקור פחמן/אנרגיה חלופי זה יכול להחליף גלוקוז וחומצות קסאמינו </td></tr><tr><td> 96-well microtiter plates </td><td>Corning</td><td>3595</td><td> סטרילי, תחתית שטוחה, אידוי נמוך </td></tr><tr><td> Tranferpette (פיפטה רב-ערוצית) </td><td>BrandTech</td><td>2703610</td><td> 8-channel, 20-200 &mu; l </td></tr><tr><td> Multiprong device </td><td>Dan-Kar</td><td>MC48</td><td> 48 משתלבים ב-&frac12; של צלחת מיקרוטיטר של 96 בארות </td></tr></tbody></table>

הקמת הריכוז החיידקי המינימלי של סוכן מיקרוביאלית לתאים פלנקטוניים (mbc-p) ותאי ביופילם (mbc-b)

Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells (MBC-P) and Biofilm Cells (MBC-B)

פרוטוקול זה מאפשר השוואה ישירה בין התנגדות פלנקטונית וביופילם לזן חיידקי שיכול ליצור ביופילם במבחנה. חיידקים מחוסנים לתוך בארות של צלחת מיקרוטיטר 96-היטב. במקרה של בדיקה פלנקטונית, דילול סדרתי של הסוכן מיקרוביאלית של בחירה מתווספים השעיות חיידקים. ב biofilm assay, פעם מחוסן, החיידקים נשארים ליצור biofilm על פני תקופה מוגדרת של זמן. תאים לא מחוברים מוסרים מן הבארות, התקשורת מתחדשת ודילול סדרתי של הסוכן מיקרוביאלית של בחירה מתווספים. לאחר חשיפה לסוכן מיקרוביאלית, התאים הפלנקטוניים הם assayed לצמיחה. עבור מבחני הביופילם, התקשורת מתרעננת עם מדיה טרייה חסרה את הסוכן מיקרוביאלית ותאי הביופילם נשארים להתאושש. הכדאיות של תאי הביופילם מתבצעת לאחר תקופת ההחלמה. MBC-P עבור הסוכן מיקרוביאלית מוגדר כריכוז הנמוך ביותר של סמים שהורג את התאים בתרבות הפלנקטונית.  לעומת זאת, MBC-B עבור זן נקבע על ידי חשיפת biofilms מעוצבים מראש לריכוזים הולכים וגדלים של חומר מיקרוביאלית במשך 24 שעות. MBC-B מוגדר כריכוז הנמוך ביותר של חומר מיקרוביאלית שהורג את התאים בביופילם.

מבחני MBC-P ו- MBC-B בוצעו, והשוו את הרגישות של סוג הפרא PA14 עם PA14 ∆ndvB. טוברמיצין שימש כאנטיביוטיקה. מוצגות תוצאות המתאימות לשלב 1.4.4 (איור 1) ולצעד 2.3.4 (איור 2). PA14 ו- ∆ndvB חוסנו לתוך מבחני MBC-P ו- MBC-B המשולש. לאחר השלמת שלבים 1.0-1.4 של פרוטוקול MBC-B ושלבים 2.0-2.3 של פרוטוקול MBC-P, התאים קיימא היו מצופים על צלחת אגר LB. ריכוזים של tobramycin(μg /ml) מסומנים בצד שמאל של התאים. MBC-B עבור PA14 הוא...

פרוטוקול זה מאפשר השוואה ישירה בין התנגדות פלנקטונית וביופילם לזן חיידקי שיכול ליצור ביופילם במבחנה באמצעות צלחת מיקרוטיטר 96 באר. חיידקי פלנקטוניים או ביופילם נחשפים לדילול סדרתי של הסוכן האנטי-מיקרוביאלי המועדף. הכדאיות נפגעת על ידי צמיחה על צלחות אגר.

הקמת הריכוז החיידקי המינימלי של סוכן מיקרוביאלית לתאים פלנקטוניים (MBC-P) ותאי ביופילם (MBC-B)

This protocol allows for a direct comparison between planktonic and biofilm resistance for a bacterial strain that can form a biofilm in vitro. Bacteria ...

הליך זה משווה ישירות עמידות לפלנקטון וביופילם עבור זן חיידקים שיכול ליצור ביופילם. ראשית, הקימו ביופילם, חידשו את המדיה והחילו דילול סדרתי של החומר האנטי-מיקרוביאלי הנבחר. לאחר מכן אפשר לתאים להתאושש במדיום טרי.כעת בדוק את כדאיות התאים על ידי ציפוי על מקדחת LB. בסופו של דבר, קביעת הריכוז החיידק המינימלי של תאי פלנקטון וביופילם משמשת כדי להראות את העלייה בעמידות הנובעת מגידול בביופילם. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהם מזהמים בארות סמוכות, או שהם לא מצליחים לתת לשיניים של המכשיר הרב-כיווני להתקרר מספיק כדי שלא יהרגו את החיידקים.תרבית, סוג הבר וזן החיידקים המוטנטי במשך 16 שעות במדיום עשיר ב-37 מעלות צלזיוס, מדללת את תרביות הלילה הרוויות למדיום טרי כמו M 63, מדיום מינימלי, בתוספת מגנזיום, סולפט וארגינין. ואז אלוקווה. 100 מיקרוליטר לבאר.הקצאת 24 בארות לכל זן, דגירה למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הכינו 10 x תמיסות מלאי של סדרת דילול של אנטיביוטיקה לשבע בארות ואחסנו על קרח. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, הסר את הסופרנטנט המשומש המכיל תאים פלנקטוניים.לאחר מכן הוסף 90 מיקרוליטר של M 63 לכל הבארות והוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת מלאי האנטיביוטיקה המתאימה לבקרה ללא אנטיביוטיקה. ובכן, לכל שכפול ומאמץ, הוסיפו 10 מיקרוליטר מים. דגרו את לוחית המיקרו טיטר למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.בעזרת פיפטה רב-ערוצית, הסר את הסופרנטנט המשומש המכיל תאים פלנקטוניים. הוסף 115 מיקרוליטר של M 63 לכל הבארות והמשיך לגדל את התרבויות למשך 24 שעות. ב-37 מעלות צלזיוס.סמן צלחת מקדחה אחת של פאונד לכל חצי 96. ובכן צלחת מיקרוטיטר כדי לעקר את המכשיר הרב-כיווני, טבלו אותו באתנול 100% והעבירו את השיניים על פני הלהבה הפתוחה של מבער בונסן. תנו לשיניים להתקרר מעט.בעזרת קצות השיניים. העבירו תרבית פלנקטון מכל באר של לוחית המיקרוטיטר אל פני השטח של צלחת מקדחה LB. הנח את לוחות המקדחה LB בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.לאחר מכן קבע חזותית את החתך לצמיחת חיידקים כריכוז החיידקים המינימלי של תרבית האנטיביוטיקה, סוג הבר וזן החיידקים המוטנטי למשך 16 שעות בתווך עשיר ב-37 מעלות צלזיוס, לדלל את תרביות הלילה הרוויות 1 עד 100 למדיום טרי לבדיקות עמידות לאנטיביוטיקה לכל באר של צלחת מיקרוטיטר 96 בארות. הוסף 90 מיקרוליטר מדילול החיידקים. עכשיו לחשוף את התאים הפלנקטוניים לשיפוע ריכוז של אנטיביוטיקה.התחל עם 10 x תמיסות מלאי של סדרת דילול של אנטיביוטיקה כמו טוברמיצין מיצין. הוסף 10 מיקרוליטר של גבעולי האנטיביוטיקה בהתאם לתכנון הניסוי. לאחר מכן הוסף 10 מיקרוליטר מים לבארות הבקרה ללא אנטיביוטיקה עבור כל שכפול וזן.דגרו את לוחית המיקרוטיטר למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לבדוק תאים חיים. התחל בתיוג צלחת מקדחה אחת של LB עבור כל מחצית של צלחת מיקרוטיטר 96 באר. עקר את המכשיר הרב-כיווני על ידי התלקחות עם 100% אתנול.חזור על הפעולה פעם אחת. לאחר מכן באמצעות המכשיר הרב-שיניים, העבירו כשלושה מיקרוליטר של תרבית פלנקטון מכל באר של לוחית המיקרוטיטר אל פני השטח של לוחית מקדחה LB. דגרו את הצלחות בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.לאחר מכן קבע את הריכוז החיידק המינימלי של האנטיביוטיקה על ידי זיהוי העין של החתך לצמיחת חיידקים. בניסוי זה, נעשה שימוש בשתי בדיקות ריכוז חיידקים מינימליות שונות כדי להשוות את הרגישות של PA 14 מסוג בר עם זן מוטנטי חסר עמידות לאנטיביוטיקה. ג'ין NDVB.כאן, ריכוזי החיידקים המינימליים של האנטיביוטיקה טוברמיצין נמדדו עבור הביופילם. ה-MBCB עבור PA 14 הוא 100 מיקרוגרם למיליליטר בהשוואה ל-12.5 מיקרוגרם למיליליטר עבור המוטאנט. לעומת זאת, הריכוזים החיידקיים המינימליים של טוברמיצין עבור התאים הפלנקטוניים היו שמונה מיקרוגרם למיליליטר הן עבור PA 14 והן עבור מוטנט.לאחר שליטה, ניתן לסיים את ה-NBCB תוך כשעה, בחלוקה על פני חמישה ימים.

establishing-minimal-bactericidal-concentration-an-antimicrobial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

בדיקות אבחון רגישות מיקרוביאלית הנוכחי מסתמך על צמיחה של planktonic מבודד ב מזין, עשיר תנאים אירוביים. כאן, אנו מעסיקים בינוני חלופה כיח מלאכותית ללמוד הרגישות מיקרוביאלית של Pseudomonas aeruginosa biofilms תחת שני תנאים אירוביים ו microaerophilic נציג נוסף של הריאה סיסטיק פיברוזיס.

שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; בתנאי רלוונטיים יותר ריאות סיסטיק פיברוזיס

סרטון זה מדגים שיטה מבוססת צלחת מיקרוטיטר לקביעת הריכוז המעכב המינימלי (MIC) של אנטיביוטיקה לבדיקה נגד חיידקים. עם הוספת תרחיף של הפתוגן החיידקי Pseudomonas aeruginosa לצלחת מיקרוטיטר המכילה דילולים סדרתיים של אנטיביוטיקה לבדיקה, ומעכב ייצור פיומלנין על ידי החיידקים, נמדדת הצפיפות האופטית של הבארות כדי לחשב את הריכוז המעכב המינימלי של האנטיביוטיקה, ואת ההשפעה של מעכב ייצור פיומלנין על הרגישות לאנטיביוטיקה של החיידקים.

שיטת צלחת מיקרוטיטר להערכת הריכוז המעכב המינימלי של אנטיביוטיקה

ייצור פיומלנין חיידקי מביא לעמידות מוגברת לעקה חמצונית ולאלימות. אנו מדווחים על טכניקות שניתן להשתמש בהן כדי לקבוע עיכוב של ייצור פיומלנין ולבדוק את העלייה ברגישות כתוצאה מכך לעקה חמצונית בחיידקים, כמו גם לקבוע ריכוז מעכב מינימלי של אנטיביוטיקה (MIC).

שיטות לעכב קטריאלי Pyomelanin ייצור וקבעו את הגידול המקביל ברגישות לסטרס חמצונים

מחקר זה מציג את הפיתוח של מתודולוגיות הניתנות לשחזור לחקר מעכבי ביופילם והשפעותיהם על Bacillus subtilis multicellularity.

מתודולוגיות לימוד<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilms כמודל לאפיון מולקולה קטנה Biofilm מעכבי

פרוטוקול זה מציג מתודולוגיה לביצוע צמיחת ביופילם ומדידות ביומסה באמצעות התקני לוח PCR עמוקים בהרכבה עצמית עבור הקרנת ביופילם סטטית של מכסה 96-היטב.

ייצור ביופילם ביומסה חיידקית גדולה יותר באמצעות מכשירי מיקרופלאט עמוק באר עמוקה צלחת PCR

פרוטוקול זה מתאר גישה המשלבת שיטות סטטיות ודינמיות להערכת יעילותן של חומצות פרוקסי אורגניות למיגור ביופילמים בתעשיית החלב. גישה זו עשויה לשמש גם לבדיקת יעילותן של פורמולציות ביולוגיות או כימיות חדשות לשליטה בביופילמים.

הערכת יעילותן של חומצות פרוקסי אורגניות למיגור ביופילמים חלביים בגישה המשלבת שיטות סטטיות ודינמיות

אנו מציגים ארבע שיטות להערכת הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של ננו-חלקיקים ומשטחים ננו-מבניים באמצעות טכניקות in vitro . שיטות אלה יכולות להיות מותאמות לחקר האינטראקציות של ננו-חלקיקים ומשטחים ננו-מבניים שונים עם מגוון רחב של מיני מיקרובים.

הערכת פעילויות אנטי-מיקרוביאליות של ננו-חלקיקים ומשטחים ננו-מבניים במבחנה

פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה לפיתוח ביופילם כדורי. השיטה ניתנת להרחבה לנפחי תרבות שונים, ומאפשרת אימוץ קל למטרות ניסוי שונות. תכנון השיטה מאפשר הערכה איכותית או כמותית של פוטנציאל יצירת הביופילם של מספר מינים מיקובקטריאליים.

גידול ביופילם מיקובקטריאלי כמודל לחקר עמידות מיקרוביאלית

מתודולוגיה זו מאפשרת הקמת מודל ביופילם פולימיקרוביאלי בסיסטיק פיברוזיס לבדיקת רגישות מיקרוביאלית במעבדות מחקר וקליניות. מודל זה מספק תוצאות מדויקות ואמינות על פני מגוון תפוקות.

פיתוח מודל ביופילם של מושבה פולימיקרוביאלית לבדיקת אנטי-מיקרוביאלים בסיסטיק פיברוזיס

פרוטוקול זה מספק מסגרת שיטתית להערכת האופן שבו פיטוכימיקלים יכולים לשפר את ההשפעות החיידקיות של ביוצידים מסורתיים באמצעות מודלים של פעילות חיידקית ובדיקות אינטראקציה קומבינטוריות, שמטרתן לזהות תערובות סינרגטיות המשפרות את השליטה במיקרואורגניזמים ומפחיתות את השימוש הכולל בביוצידים.

In-Vitro הערכת השפעות ההגברה של מולקולות שמקורן בצמחים על ביוצידים קונבנציונליים

למדו להשוות עמידות חיידקים פלנקטוניים וביופילמיים לסוכנים מיקרוביאליים באמצעות צלחת מיקרוטיטר 96-באר. שיטה זו מאפשרת לקבוע את הריכוז החיידקי המינימלי ולהבין את הגנת הביופילם.

הקמת הריכוז החיידקי המינימלי של סוכן מיקרוביאלית לתאים פלנקטוניים (MBC-P) ותאי ביופילם (MBC-B)

גלה סרטונים נוספים