הקמת הריכוז החיידקי המינימלי של סוכן מיקרוביאלית לתאים פלנקטוניים (MBC-P) ותאי ביופילם (MBC-B)

הליך זה משווה ישירות עמידות לפלנקטון וביופילם עבור זן חיידקים שיכול ליצור ביופילם. ראשית, הקימו ביופילם, חידשו את המדיה והחילו דילול סדרתי של החומר האנטי-מיקרוביאלי הנבחר. לאחר מכן אפשר לתאים להתאושש במדיום טרי.

כעת בדוק את כדאיות התאים על ידי ציפוי על מקדחת LB. בסופו של דבר, קביעת הריכוז החיידק המינימלי של תאי פלנקטון וביופילם משמשת כדי להראות את העלייה בעמידות הנובעת מגידול בביופילם. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהם מזהמים בארות סמוכות, או שהם לא מצליחים לתת לשיניים של המכשיר הרב-כיווני להתקרר מספיק כדי שלא יהרגו את החיידקים.

תרבית, סוג הבר וזן החיידקים המוטנטי במשך 16 שעות במדיום עשיר ב-37 מעלות צלזיוס, מדללת את תרביות הלילה הרוויות למדיום טרי כמו M 63, מדיום מינימלי, בתוספת מגנזיום, סולפט וארגינין. ואז אלוקווה. 100 מיקרוליטר לבאר.

הקצאת 24 בארות לכל זן, דגירה למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הכינו 10 x תמיסות מלאי של סדרת דילול של אנטיביוטיקה לשבע בארות ואחסנו על קרח. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, הסר את הסופרנטנט המשומש המכיל תאים פלנקטוניים.

לאחר מכן הוסף 90 מיקרוליטר של M 63 לכל הבארות והוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת מלאי האנטיביוטיקה המתאימה לבקרה ללא אנטיביוטיקה. ובכן, לכל שכפול ומאמץ, הוסיפו 10 מיקרוליטר מים. דגרו את לוחית המיקרו טיטר למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

בעזרת פיפטה רב-ערוצית, הסר את הסופרנטנט המשומש המכיל תאים פלנקטוניים. הוסף 115 מיקרוליטר של M 63 לכל הבארות והמשיך לגדל את התרבויות למשך 24 שעות. ב-37 מעלות צלזיוס.

סמן צלחת מקדחה אחת של פאונד לכל חצי 96. ובכן צלחת מיקרוטיטר כדי לעקר את המכשיר הרב-כיווני, טבלו אותו באתנול 100% והעבירו את השיניים על פני הלהבה הפתוחה של מבער בונסן. תנו לשיניים להתקרר מעט.

בעזרת קצות השיניים. העבירו תרבית פלנקטון מכל באר של לוחית המיקרוטיטר אל פני השטח של צלחת מקדחה LB. הנח את לוחות המקדחה LB בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.

לאחר מכן קבע חזותית את החתך לצמיחת חיידקים כריכוז החיידקים המינימלי של תרבית האנטיביוטיקה, סוג הבר וזן החיידקים המוטנטי למשך 16 שעות בתווך עשיר ב-37 מעלות צלזיוס, לדלל את תרביות הלילה הרוויות 1 עד 100 למדיום טרי לבדיקות עמידות לאנטיביוטיקה לכל באר של צלחת מיקרוטיטר 96 בארות. הוסף 90 מיקרוליטר מדילול החיידקים. עכשיו לחשוף את התאים הפלנקטוניים לשיפוע ריכוז של אנטיביוטיקה.

התחל עם 10 x תמיסות מלאי של סדרת דילול של אנטיביוטיקה כמו טוברמיצין מיצין. הוסף 10 מיקרוליטר של גבעולי האנטיביוטיקה בהתאם לתכנון הניסוי. לאחר מכן הוסף 10 מיקרוליטר מים לבארות הבקרה ללא אנטיביוטיקה עבור כל שכפול וזן.

דגרו את לוחית המיקרוטיטר למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לבדוק תאים חיים. התחל בתיוג צלחת מקדחה אחת של LB עבור כל מחצית של צלחת מיקרוטיטר 96 באר. עקר את המכשיר הרב-כיווני על ידי התלקחות עם 100% אתנול.

חזור על הפעולה פעם אחת. לאחר מכן באמצעות המכשיר הרב-שיניים, העבירו כשלושה מיקרוליטר של תרבית פלנקטון מכל באר של לוחית המיקרוטיטר אל פני השטח של לוחית מקדחה LB. דגרו את הצלחות בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.

לאחר מכן קבע את הריכוז החיידק המינימלי של האנטיביוטיקה על ידי זיהוי העין של החתך לצמיחת חיידקים. בניסוי זה, נעשה שימוש בשתי בדיקות ריכוז חיידקים מינימליות שונות כדי להשוות את הרגישות של PA 14 מסוג בר עם זן מוטנטי חסר עמידות לאנטיביוטיקה. ג'ין NDVB.

כאן, ריכוזי החיידקים המינימליים של האנטיביוטיקה טוברמיצין נמדדו עבור הביופילם. ה-MBCB עבור PA 14 הוא 100 מיקרוגרם למיליליטר בהשוואה ל-12.5 מיקרוגרם למיליליטר עבור המוטאנט. לעומת זאת, הריכוזים החיידקיים המינימליים של טוברמיצין עבור התאים הפלנקטוניים היו שמונה מיקרוגרם למיליליטר הן עבור PA 14 והן עבור מוטנט.

לאחר שליטה, ניתן לסיים את ה-NBCB תוך כשעה, בחלוקה על פני חמישה ימים.