הפעלה של שלט מגנטי של בדיקות מיקרומטר

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבצע שתי מדידות של התכונות הפיזיקליות המקומיות של ביופילם חיידקי בקנה מידה מיקרומטרי. לשם כך, מוכנסים חלקיקים מגנטיים לתוך ביופילם בצמיחה כדי לשמש כגששים שניתן להפעיל מרחוק מבלי להפריע לתכונות המבניות של הביופילם. לאחר מכן, נעשה שימוש בפינצטה מגנטית ייעודית כדי להפעיל כוח מוגדר על כל חלקיק.

בחלקיקים המוטמעים בתוך הביופילם, נמדד תזוזת החלקיקים המושרה על ידי משיכה מגנטית באמצעות מיקרוסקופיית וידאו, כדי להסיק את הפרמטרים הוויסקו-אלסטיים המקומיים ולספק את ההתפלגות המרחבית התלת-ממדית של התכונות המכניות של הביופילם. התוצאות המתקבלות מראות את ההטרוגניות המכנית של ביופילם של e coli ומספקות רמזים לגבי רכיבי הביופילם התומכים בתכונות הפיזיקליות שלו. לפיכך, היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון מיקרוסקופיה, רחולוגיה או בדיקת ביופילם שלם, הוא שהיא מדווחת על ההתפלגות המרחבית של התכונות המכניות in situ מבלי להפריע למבנה המקורי של החומר.

כדי להכין חלקיקים מגנטיים עבור פרוטוקול זה, ערבבו ב-vortex את מבחורת המלאי של חלקיקים בגודל 2.8 µm כדי להשעות אותם. לאחר מכן, העבירו 10 µL למבחורת מיקרו-צנטריפוגה. כדי לשטוף את החלקיקים, הוסיפו 190 µL של מצע מינימלי וסובבו את המבחורת, הניחו אותה על מעמד דגימות מגנטי, המתינו להיווצרות של משקע ושאבו את תמיסת העילאי.

חזור על שלב שטיפה זה פעמיים נוספות והשעה מחדש את החרוזיים ב-190 µL של מצע מינימלי. לאחר מכן, הוסף 950 µL של M 63 B one עם 0.4% glucose ל-50 µL של תמיסת החרוזיים השטופה כדי להתאים את ריכוז החלקיקים לכ-5 מיליון חרוזיים למיליליטר. כדי להכין את התעלה, השתמש בחיתוך זכוכית יהלום כדי לחתוך שני קפילריים מזכוכית בורוסיליקט ריבועים באורך 10 סנטימטרים כדי לקבל שתי פיסות באורך שמונה סנטימטרים.

בעזרת חותך זכוכית, חתכו זכוכית למשקוף לחצי. לאחר מכן, בעזרת דבק ציאנואקרילט בעל פעולה מהירה או דבק סופר, הצמידו את שתי הנימיות לשני חלקי משקוף הזכוכית כפי שמוצג בדיאגרמה זו. במרחק של שני סנטימטרים זה מזה עם בליטה של סנטימטר אחד בכל קצה, עקרו באוטוקלאב את המערך כולו ואת כל הפיתולים הדרושים.

עבור חיבור התעלות המשך, אספו את החומרים הסטריליים הבאים תחת מCב מלבני (laminar flow hood): את צינורות התעלה והמחברים המותקנים, שני מסנני בועות או מלכודות בועות פדיאטריים, שני תסמיכים, מזרקים של 30 milliliter מלאים ב-M 63 B ו-1.4% glucose, ואת בקבוק הפסולת.

חברו את שתי הקפילריות באופן דומה. בעזרת אחת הפרובות, חברו את בקבוק הפסולת לקצה של קפילרית אחת.

לאחר מכן, באמצעות מחברי Luer lock כנקודות חיבור, חברו את הקצה השני של הנימים למלכודת בועות שהוכנה באופן עצמאי, או ממלכודת אחת למלכודת שתיים. לאחר מכן, חברו את המזרק M 63 B one בנפח 30 milliliters למלכודת שתיים. בשלב הבא, מלאו את המערכת בתמיסת M 63 B one סטרילית עם 0.4% glucose.

התקינו את המזרק במשאבת המזרקים והפעילו את משאבת המזרקים בקצב הגבוה בכ-5 mL לשעה מהקצבים הניסיוניים. עקבו בזהירות אחרי בועות בתוך המעגל והסִירו אותן במידת הצורך. נתקו וחברו מחדש את המעגל בעת ביצוע פעולה זו.

הקפידו להסיר בועות אוויר לפני ובזמן החדרת תערובת התאים והחלקיקים לתוך הפקעת; מומלץ להציב את המכל מעל הקפילריות, דבר שיסייע לצמיחה רציפה של הביופילם. אפשרו למצע לזרום דרך המערכת במשך 10 עד 15 דקות. בינתיים, בתוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה, ערבבו 1 mL של תרחיף חיידקים בצפיפות אופטית של 0.5 עם 1 mL של תמיסת החרוזיים השטופים שהוכנה מוקדם יותר.

הפסיקו את הזרימה, חברו מחדש את הצינוריות ולאחר מכן סגרו את התופסנים. כעת, מלאו מזרק של 1 mL בתערובת חרוזי החיידקים והחדירו אותה אל הקפילריה. לאחר מלכוד בועות המתו domaćית, העבירו את המערך אל המיקרוסקופ.

התקינו את הקפילריה על במה המיקרוסקופ והניחו את מיכל הפסולת במפלס גבוה מעט. הניחו את משאבת המזרקים על המשטח לצד המיקרוסקופ. המתינו 15 עד 20 דקות כדי לאפשר לחיידקים לשקוע ולהיקשר לפני השטח של הקפילריה.

לאחר שהחיידקים נצמדו לקפילרה, פתחו את התסביבים, כווננו את קצב הזרימה במשאבת המזרקים והתחילו את הזרימה. במהלך 24 עד 48 שעות יתפתח ביופילם על פני השטח של הקפילרה; התמקדו במישור התחתון של הקפילרה והתחילו בהקלטת תמונות הדגימה בשיטת time lapse. בדרך כלל, תדירות רכישה של שתי תמונות לדקה תספק דיווח הולם על צמיחת הביופילם.

סרטון זה מציג את השלב הראשוני של הביופילם מיד לאחר הזרקת תערובת התאים והחלקיקים. ברכישת הנתונים מהנימי (capillary), התדירות היא תמונה אחת לשנייה, והסרטון מוצג ב-10 פריימים לשנייה. לאחר ארבע שעות של גדילה, החלקיקים התנתקו בהדרגה מהפני השטח והתפזרו בנפח הביופילם.

החצים הכחולים מסמנים אירועי ניתוק. כאן, תדירות הרכישה היא שתי תמונות לדקה, והסרט מוצג ב-15 פריימים לשנייה. לאחר 20 שעות של גדילה, ניתן לעקב אחר תריסר חלקיקים המפוזרים באופן אחיד במישור מוקד.

סרטון זה צולם במישור אמצעי, 20 מיקרומטר מעל תחתית הנימי. שתי תמונות נרכשו בכל דקה. הסרטון מוצג בקצב של 15 פריימים לשנייה.

ברגע שהביופילם הזרוע בחלקיקים מגנטיים גדל באופן ידני, הברג את הפינצטה המגנטית אל במה המיקרוסקופ. כדי להבטיח יצירת מדרגי שדה מגנטי מתאימים באזור התצפית, ודא שהפינצטה ממוקמת כפי שמוצג בדיאגרמה זו, שבה אזור המדידה המסומן באדום ממוקם במרחק של 300 micrometers מקצות הקטבים השמאלי והימני של הפינצטה לאורך ציר ה-Y. תחתית הקפילרית ממוקמת 200 micrometers מתחת לתחתית הפינצטה.

כדי לבצע שלב זה, השתמשו בבקרת תנועת ה-XY שלב המיקרוסקופ כדי לקרב את קצה הקוטב המגנטי השמאלי אל הקצה השמאלי של הנימיור. באותו שדה ראייה, כווננו את מיקום הקוטב למרחק של 300 micrometers מקצה הנימיור באמצעות חוגיית ה-x של המניפולטור המיקרומטרי השמאלי של הפינצטה. בצעו את אותה הפעולה בצד ימין.

לאחר מכן, כוון את מיקום הפינצטה לאורך ציר Z ביחס לתחתית הנימי. ראשית, יישר את תחתית הקטבים עם תחתית הנימי והזז את הקטבים 200 micrometers למעלה.

באמצעות חוגה Z של המיקרו-מניפולטור, הגדירו את פרמטרי מחולל הפונקציות ל-24 שניות של אות אפס ו-16 שניות של ארבעה אמפר. זרם ישר עם טריגר. שלחו לסוגר האור של השדה בהיר לאחר 20 שניות.

לסנכרון אותות, חברו את הפינצטה למחולל הפונקציות באמצעות מגבר ההספק. שימו לב לחבר את הקטבים כהלכה בטור כדי להשיג עקומות זחילה המפוזרות מרחבית. הגדירו ראשית מרחבית, וקבעו את ראשית ציר Z בחלקו התחתון הפנימי של הנימיות.

רשמו את מיקום בקרת ה-Z של המיקרוסקופ. לאחר מכן, אתרו את נקודת המפגש של ציר x וציר Y, המוגדרים על ידי קצה הנימיון וקצה ה-pole piece בהתאמה. זוהי נקודת ראשית הניתוח.

רשמו את הקואורדינטות. כל הקואורדינטות בהמשך יימדדו ביחס למקור זה. לאחר צמיחת הביופילם, השתמשו בכפתור כוונון הפוקוס העדין כדי להתאים את המיקום האנכי של הקפילריה, כך שהמישור הראשון יהיה ממוקם 4 עד 7 מיקרומטרים מעל תחתית הקפילריה.

פרוסה זו תואמת לפרוסת הביופילם שבה מקור מערכת הצירים המרחבית ממוקם בפינה השמאלית העליונה. לאחר מכן, הפעל את מחולל הזרם והפעל ידנית את רצף רכישת התמונות. כדי להתחיל את רצף האירועים ה-42, זרם התמונות שנרכש כאן תואם למישור ושדה XY נתונים.

לאחר לכידת הרצף, העבירו את הנימיול כדי להקליט וידאו של השדה החדש. המשיכו לחזור על תהליך זה עד לקבלת כל סרטוני הווידאו הדרושים לניתוח הנתונים. פתחו את התמונות בתוכנת Image J או בתוכנה מקבילה למעקב אחר חלקיקים עבור כל הערימות (stacks) שנרכשו עבור כל החלקיקים.

המירו את התמונות לקבצי טקסט על ידי מעקב אחר תזוזת חלקיקים. לאחר מכן, באמצעות תוכנה לטיפול בנתונים, שרטטו את עקומות התזוזה והמירו את עקומות התזוזה לעקומות ציות (compliance curves), שבהן הציות הכולל של החומר JFT מחושב כפונקציה של הזמן לפי נוסחת הציות המוצגת כאן. נוסחה זו מתארת את הקשר בין המאמץ המופעל לבין המעוות של החומר עבור חלקיק היסטורי של כדורים, או כשהוא מוטמע בתוך תוואי ויסקו-אלסטי ובלתי דחיס כפי שנקבע בעבר על ידי חוקרים ועמיתיהם. מהתאמת עקומת ציות הזחילה (creep compliance curve) למודל בורגרס הכללי עבור חומרים ויסקו-אלסטיים, גזרו את הפרמטרים הוויסקו-אלסטיים J zero J one at the zero at the one prime כדי לספק את ההתפלגות המרחבית של התכונות הוויסקו-אלסטיות של הביופילם. עקומות זחילה נאספו בעומקים שונים בביופילם בנפח מיקרוסקופי של בערך 200 על 200 על 40 מיקרומטרים קובים. תוצאות טיפוסיות מוצגות כאן.

ערכי J zero, הגמישות האלסטית, מוצגים כפונקציה של ציר Z לאורך העומק וציר y לאורך ממד צדדי של הביופילם. כל נקודה תואמת לחשאיקה עבורה ניתוח עקומת זחילה סיפק ערך J zero. הנתונים חושפים כי הגמישות המקומית משתנה לאורך עומק הביופילם בטווח של כמעט שלושה סדרי גודל.

בנוסף, נצפתה הטרוגניות לטרלית חזקה בכל גבהי הביופילם. הנתונים מספקים גם את התפלגות ערכי הגמישות (compliance), המראים צורה נרחבת ואסימטרית. השוואת תוצאות אלו לאלו שהתקבלו בעבר עבור פולימרים ביולוגיים אחרים מרמזת כי התכונות המכניות של הביופילם נתמכות על ידי ג'לי פולימר בעלי קישוריות צולבית גבוהה.

ב-C בוצעו שתי מדידות של תכונות מקומיות בביופילם תחת תנאים סביבתיים שונים, כגון קצב זרימה נמוך יותר כפי שניתן לראות כאן. ערכי הציות (compliance) של ביופילם שגדל ב-0.1 milliliter per hour עדיין מראים פרופיל מכני הטרוגני מאוד. אך התלות הברורה בעומק Z של קשיחות הביופילם שנצפתה בביופילם שגדל ב-one milliliter per hour נעלמה.

תוצאות אלו מדגימות את ההשפעה המשמעותית של התנאים החיצוניים על ארגון הביופילים. לאחר צפייה בסרטון, צריכה להיות לך הבנה טובה של אופן מיפוי התכונות הוויסקוזיים של הביופילים תחת תנאי גידול מבוקרים לחלוטין.