הפעלה של שלט מגנטי של בדיקות מיקרומטר באתר 3D מיפוי של תכונות פיסיקליות biofilm חיידקים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבצע ב-C שתי מדידות של התכונות הפיזיקליות המקומיות של ביופילם חיידקי בקנה מידה מיקרומטרי. לשם כך, חלקיקים מגנטיים מוחדרים לביופילם גדל כדי לשמש כבדיקות שניתן להפעיל מרחוק מבלי להפריע לתכונות המבניות של הביופילם. לאחר מכן משתמשים בפינצטה מגנטית ייעודית כדי להפעיל כוח מוגדר על כל חלקיק.

בהטמעה בסרט הביופילם, תזוזת החלקיקים הנגרמת על ידי המשיכה המגנטית מנוטרת באמצעות מיקרוסקופ וידאו כדי לגזור את הפרמטרים הויסקו-אלסטיים המקומיים ולספק את ההתפלגות המרחבית התלת-ממדית של התכונות המכניות של הביופילם. מתקבלות תוצאות המראות את ההטרוגניות המכנית של ביופילם אי קולי ונותנות רמזים לגבי אילו רכיבי ביופילם תומכים בתכונות הפיזיקליות של הביופילם. אז היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מיקרוסקופיה, קולוגיה או צמחייה ביולוגית שלמה, הוא שהיא מדווחת על ההתפלגות המרחבית של התכונות המכניות באתרן מבלי להפריע למבנה המקורי של החומר.

כדי להכין חלקיקים מגנטיים לפרוטוקול זה, בקבוקון המלאי של וורטקס מכיל חלקיקים של 2.8 מיקרומטר כדי להשעות אותם מחדש. לאחר מכן העבירו 10 מיקרוליטר לצינור מיקרו צנטריפוגה. לאחר מכן כדי לשטוף את החלקיקים, הוסיפו 190 מיקרוליטר של מדיום מינימלי וסובבו את הצינור, הניחו אותו על מתלה דגימה מגנטי, המתינו להיווצרות גלולה ושאבו את תמיסת הסופרנט.

חזור על שלב כביסה זה פעמיים נוספות והשהה מחדש את החרוזים ב -190 מיקרוליטר של מדיום מינימלי. לאחר מכן, הוסף 950 מיקרוליטר של M 63 B אחד עם 0.4% גלוקוז ל-50 מיקרוליטר של תמיסת החרוזים השטופים כדי להתאים את ריכוז החלקיקים לכ-5 מיליון חרוזים למיליליטר. להכנת התעלה, השתמש בחותך זכוכית יהלום כדי לחתוך שני נימי זכוכית סיליקט מרובעים באורך 10 סנטימטרים לקבלת שתי חתיכות באורך שמונה סנטימטרים.

בעזרת חותך הזכוכית חותכים שקופית זכוכית לשניים. לאחר מכן באמצעות דבק ציאנואקרילט מהיר או דבק סופר, חבר את שני החלקים הנימים לשני חלקי שקופיות זכוכית כפי שמוצג בתרשים זה. שני סנטימטרים זה מזה עם תלייה של סנטימטר אחד משני הקצוות אוטוקלאב את כל ההתקנה ואת הצינורות הדרושים.

לחיבור ערוץ נוסף, אסוף את החומרים הסטריליים הבאים מתחת למכסה זרימה לנארי. צינורות התעלה והמחברים המותקנים, שני מסנני בועות לילדים או מלכודות. שני מהדקים, מזרקים של 30 מיליליטר מלאים ב-M 63 B, 1.4% גלוקוז ובקבוק הפסולת.

חבר את שני הנימים באותו אופן. באמצעות אחד הצינורות. חבר את בקבוק הפסולת לקצה נימי אחד.

לאחר מכן השתמש במחברי נעילת פיתוי כצמתים, חבר את הקצה השני של הנימים למלכודת הבועות הביתית או לכוד אחד וללכוד אחד כדי ללכוד שניים. לאחר מכן חבר את מזרק 30 מיליליטר M 63 B אחד למלכודת שתיים. הבא למלא את ההתקנה ב-M 63 B סטרילי אחד עם 0.4% גלוקוז.

התקן את המזרק על משאבת המזרק והפעל את משאבת המזרק בקצב של כחמישה מיליליטר לשעה הגבוה משיעורי הניסוי. עקוב בזהירות אחר כל הבועות במעגל והסר אותן במידת הצורך. נתק וחבר מחדש את המעגל תוך כדי ניסיון הליך זה.

הקפד להסיר בועות לפני וכאשר הכנסת תערובת חלקיקי התא לצינור, זה עוזר למקם את האשפה מעל הנימים, וזה יעזור לצמיחה מתמשכת של הביופילם. אפשר למדיום לזרום דרך המערכת למשך 10 עד 15 דקות. בינתיים, בצינור מיקרו צנטריפוגה, מערבבים מיליליטר אחד של תרחיף החיידקים בצפיפות אופטית 0.5 עם מיליליטר אחד מתמיסת החרוזים השטופה שהוכנה קודם לכן.

כבה את הזרימה, חבר מחדש את הצינור ואז סגור את המהדקים. לאחר מכן, מלאו מזרק של מיליליטר אחד בתערובת חרוזי החיידקים והכניסו אותו לנימים. לאחר מלכודת הבועות הביתית, העבירו את המנגנון למיקרוסקופ שם.

התקן את הנימים על במת המיקרוסקופ והנח את מיכל הפסולת ברמה מעט גבוהה יותר. הניחו את משאבת המזרק על השיש ליד המיקרוסקופ. אפשר למנגנון לעמוד במשך 15 עד 20 דקות כדי לאפשר לחיידקים להתיישב ולהיצמד לפני השטח של הנימים.

לאחר שהחיידקים נצמדו לנימים, פתח את המהדקים והתאם את קצב הזרימה על משאבת המזרק והתחל את הזרימה. במהלך 24 עד 48 שעות, יתפתח ביופילם על פני השטח הנימים, יתמקד במישור התחתון הנימי ויתחיל בהקלטת דולג הזמן של תמונות הדגימה. בדרך כלל תדירות רכישה של שתי תמונות לדקה תדווח כראוי על צמיחת הביופילם.

סרטון זה מציג את השלב הראשוני של הביופילם מיד לאחר הזרקת תערובת חלקיקי התא. ברכישת הנימים, התדר הוא תמונה אחת לשנייה, והסרט מוקרן ב-10 פריימים לשנייה. לאחר ארבע שעות של צמיחה, חלקיקים מתנתקים בהדרגה מפני השטח כדי להתפזר לנפח הביופילם.

החצים הכחולים סימנו אירועי ניתוק. כאן, תדירות הרכישה היא שתי תמונות לדקה, והסרט מוקרן ב-15 פריימים לשנייה. לאחר 20 שעות של צמיחה, ניתן לנטר תריסר חלקיקים המפוזרים באופן שווה במישור מוקד.

הסרט הזה צולם במישור אמצעי, 20 מיקרומטר מעל הקרקעית הנימים. שתי תמונות נרכשו בדקה. הסרט מוקרן ב-15 פריימים לשנייה.

לאחר שהביופילם שנזרע בחלקיקים מגנטיים גדל באופן ידני, הברג את הפינצטה המגנטית על במת המיקרוסקופ. כדי להבטיח ששיפועי השדה המגנטי המתאימים נוצרים באזור התצפית, ודא שהפינצטה ממוקמת כפי שמוצג בתרשים זה שבו אזור המדידה המוצג באדום ממוקם 300 מיקרומטר מהקצוות של הקטבים הימניים השמאליים של הפינצטה לאורך ציר ה-Y. החלק התחתון של הנימים ממוקם 200 מיקרומטר מתחת לתחתית הפינצטה.

כדי להשיג שלב זה, השתמש בבקרת התנועה XY של שלב המיקרוסקופ כדי להביא את קצה הקוטב המגנטי השמאלי ואת הקצה השמאלי של הנימים. באותו שדה תצפית, כוונן את מיקום המוט במרחק של 300 מיקרומטר מקצה הנימים באמצעות חוגת ה-x של מניפולטור המיקרום השמאלי של הפינצטה. בצע את אותה פעולה בצד ימין.

לאחר מכן כוונן את מיקום הפינצטה לאורך ציר Z ביחס לתחתית הנימים. ראשית, יישר את החלק התחתון של הקטבים עם החלק התחתון של הנימים והזיז את הקטבים. 200 מיקרומטר למעלה.

באמצעות חוגת Z של המניפולטור המיקרו, הגדר את הפרמטרים של מחולל הפונקציות ל-24 שניות של אות אפס ו-16 שניות של ארבעה אמפר. זרם ישר עם הדק. שלח לתריס אור השדה הבהיר לאחר 20 שניות.

לסנכרון אותות, חבר את הפינצטה למחולל הפונקציות באמצעות מגבר הכוח. שימו לב לחבר כראוי את הקטבים בסדרה כדי לרכוש עקומות זחילה מפוזרות מרחבית. קח מקור מרחבי, קח את מקור ציר Z בתחתית הפנימית של הנימים.

שימו לב למיקום הבקרה של המיקרוסקופ Z. לאחר מכן אתר את הצומת של ציר x ו-Y, המוגדרים על ידי קצה הנימים וקצה חתיכת המוט בהתאמה. זהו מקור הניתוח.

רשום את הקואורדינטות. כל הקואורדינטות יילקחו ביחס למקור זה להלן. לאחר שהביופילם גדל, באמצעות כפתור בקרת המיקוד העדין, התאימו את המיקום האנכי של הנימים כך שהמישור הראשון ימוקם ארבעה עד שבעה מיקרומטרים מעל החלק התחתון של הנימים.

פרוסה זו תואמת לפרוסת הביופילם שבה מקור הייחוס המרחבי ממוקם בפינה השמאלית העליונה. לאחר מכן הפעל את הגנרטור הנוכחי והפעל ידנית את רצף רכישת התמונה. כדי להתחיל את רצף האירועים ה-42, זרם התמונה שנרכש כאן מתאים למישור נתון ולשדה XY.

לאחר לכידת הרצף, הזז את הנימים כדי לצלם וידאו של השדה החדש. המשך לחזור על תהליך זה כדי להשיג את כל הסרטונים הנדרשים לניתוח הנתונים. פתח את התמונות בתמונה J או בתוכנת מעקב חלקיקים מקבילה עבור כל הערימות שנרכשו בכל החלקיקים.

המר את התמונות לקבצי טקסט על ידי מעקב אחר תזוזה של חלקיקים. לאחר מכן, באמצעות תוכנת טיפול בנתונים, צייר את עקומות התזוזה והמר את עקומות התזוזה לעקומות תאימות שבהן התאימות הכוללת של החומר JFT מחושבת כפונקציה של זמן על פי נוסחת התאימות המוצגת כאן, נוסחה זו מתארת את הקשר בין הלחץ המופעל למתח החומר עבור חלקיק היסטורי של אדומים, או משובץ בתווך הויסקו-אלסטי והבלתי ניתן לדחיסה כפי שנקבע בעבר, ועמיתיו לעבודה מהתאמת עקומת תאימות הזחילה למודל ההמבורגרים הכללי לחומרים ויסקו-אלסטיים גוזרים את הפרמטרים הויסקו-אלסטיים J אפס J אחד באפס בראשוני אחד כדי לספק את ההתפלגות המרחבית של התכונות הויסקו-אלסטיות של עקומות הזחילה של הביופילם נאספו בעומקים שונים בנפח מיקרו ביופילם של כ-200 על ידי 200 על 40 מיקרומטר מעוקב. תוצאות אופייניות מוצגות כאן.

הערכים של J אפס, התאימות האלסטית ניתנים כפונקציה של ציר Z לאורך העומק וציר y לאורך ממד רוחבי של הביופילם. כל נקודה מתאימה לחרוז שעבורו ניתוח עקומת זחילה סיפק ערך J אפס. הנתונים מראים כי היענות מקומית משתנה לאורך עומק הביופילם על פני כמעט שלושה סדרי גודל.

כמו כן, הטרוגניות רוחבית חזקה התרחשה בכל גבהי הביופילם. הנתונים מספקים גם את התפלגות ערכי התאימות, המציגים צורה נרחבת וא-סימטרית. השוואת תוצאות אלה לאלו שהתקבלו בעבר על פולימרים ביולוגיים אחרים מצביעה על כך שהתכונות המכניות של הביופילם נתמכות על ידי ג'לים פולימריים צולבים מאוד.

ב-C שתי מדידות של ביופילם, תכונות מקומיות בוצעו גם בתנאים סביבתיים שונים, כגון קצב זרימה נמוך יותר כפי שניתן לראות כאן. ערכי התאימות של ביופילם שגדל ב-0.1 מיליליטר לשעה עדיין מציגים פרופיל מכני הטרוגני ביותר. אבל התלות הברורה בעומק Z של קשיחות הביופילם שנצפתה בביופילם שגדל במיליליטר אחד לשעה נעלמה.

תוצאות אלו מדגימות את ההשפעה המשמעותית של התנאים החיצוניים על ארגון הביופילם צפייה בסרטון. אתה צריך להבין היטב כיצד למפות את תכונות הויסקו של מכון הביופילם בתנאי גידול מבוקרים לחלוטין.