Name: ממברנה דיי הדמיה אפשרית של ventromedial היפותלמוס נוירונים מעכברים בוגרים ללמוד גלוקוז חישה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-27T22:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: חקור חישת גלוקוז בנוירונים של ההיפותלמוס הוונטרומדיאלי בעכברים בוגרים באמצעות הדמיית צבע רגיש לממברנה. שיטה זו מאפשרת מדידת פעילות נוירונלית בתגובה לשינויים בריכוזי גלוקוז.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063

<ol><li>Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-sensing+neurons%3A+are+they+physiologically+relevant%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant?</a> Physiol. Behav. 76, 403-413 (2002).</li>
<li>Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemia+impairs+glucose+and+insulin+regulation+of+nitric+oxide+production+in+glucose-inhibited+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemia impairs glucose and insulin regulation of nitric oxide production in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus.</a> Am. J. Physiol. 293, 592-600 (2007).</li>
<li>Canabal, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose%2C+insulin%2C+and+leptin+signaling+pathways+modulate+nitric+oxide+synthesis+in+glucose-inhibited+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Reg.+Integr.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glucose, insulin, and leptin signaling pathways modulate nitric oxide synthesis in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus.</a> American journal of physiology. Reg. Integr. Comp. Physiol. 292, 1418-1428 (2007).</li>
<li>Murphy, B. A., Fakira, K. A., Song, Z., Beuve, A., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMP-activated+protein+kinase+and+nitric+oxide+regulate+the+glucose+sensitivity+of+ventromedial+hypothalamic+glucose-inhibited+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">AMP-activated protein kinase and nitric oxide regulate the glucose sensitivity of ventromedial hypothalamic glucose-inhibited neurons.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C750-C758 (2009).</li>
<li>Murphy, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fasting+enhances+the+response+of+arcuate+neuropeptide+Y-glucose-inhibited+neurons+to+decreased+extracellular+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fasting enhances the response of arcuate neuropeptide Y-glucose-inhibited neurons to decreased extracellular glucose.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296, C746-C756 (2009).</li>
<li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucokinase+is+a+critical+regulator+of+ventromedial+hypothalamic+neuronal+glucosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucokinase is a critical regulator of ventromedial hypothalamic neuronal glucosensing.</a> Diabetes. 55, 412-420 (2006).</li>
<li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prior+hypoglycemia+enhances+glucose+responsiveness+in+some+ventromedial+hypothalamic+glucosensing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Reg.+Integr.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Prior hypoglycemia enhances glucose responsiveness in some ventromedial hypothalamic glucosensing neurons.</a> Reg. Integr. Comp. Physiol. 294, R784-R792 (2008).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. (2004).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , 4th edn, Academic Press. (1998).</li>
<li>Song, Z., Levin, B. E., McArdle, J. J., Bakhos, N., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+pre-+and+postsynaptic+influences+on+glucosensing+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Convergence of pre- and postsynaptic influences on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus.</a> Diabetes. 50, 2673-2681 (2001).</li>
<li>Song, Z., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+glucose+and+lactate+on+glucosensing+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Differential effects of glucose and lactate on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus.</a> Diabetes. 54, 15-22 (2005).</li>
</ol>

יש לנו מה למסור.

המפתח ליכולת ללמוד פעילות של נוירונים מעכברים בוגרים הוא היכולת לנתק את תאי העצב בריאים. דיסוציאציה של נוירונים ההיפותלמוס מעכברים בוגרים קשה יותר בכמה שלבים עיקריים בפרוטוקול בהשוואה לנוירונים מעכברים לנוער. יש לנו להתגבר על בעיה זו במספר הדרכים. מה שהופך את פרוסות 500 מוח מיקרומטר עבות ממזער את הנזק מכאני לתאי עצב בהשוואה ל 250-350 מיקרומטר הפרוסות הרגילות המשמשות לרקמת מוח מעכברים צעירים יותר. עם זאת, פרוסות עבות יותר דורשות תשומת לב רבה יותר לזלוף לב ועיכול פפאין של רקמת המוח....

המוח מווסת הומאוסטזיס אנרגיה באמצעות נוירואנדוקריניים ומערכת עצבים אוטונומית. ההיפותלמוס ventromedial (VMH), מורכב מגרעין ventromedial (VMN) וגרעין מקושת (ARC), הוא חשוב לרגולציה של הומאוסטזיס אנרגיה המרכזית. נוירונים חישת הגלוקוז מיוחדים, בתוך VMH, לקשר פעילות עצבית והומאוסטזיס הגלוקוז פריפרית 1. ישנם שני סוגים של גלוקוז חישת תאי עצב; גלוקוז נרגשים (GE) נוירונים להגדיל בעוד גלוקוז עכבות הנוירונים (GI) להקטין את פעילותם עם עלייה ברמת סוכר תאית. נוירונים גלוקוז VMH חישה בדרך כלל למדו באמצעות אלקטרופיזיולוגיה או הדמיה צבע סיד / קרום פוטנציאלי רגישה. טכניקת מהדק תיקון אלקטרו נחשבת סטנדרטי במחקר של vivo לשעבר פעילות עצבית זהב. בטכניקה זו, אלקטרודה micropipette זכוכית מחוברת לממברנת התא באמצעות עמידות גבוההחותם (GΩ). אלקטרודות מהדק תיקון מאפשרות הקלטה בזמן אמת של תדר פוטנציאל פעולה (מהדק הנוכחי) או מוליכות יון (מהדק מתח) שינויים בתוך תא עצב יחיד. בעוד טכניקת מהדק התיקון מספקת מידע מפורט בנוגע לשינויים בconductances ערוץ יון מסוים, חסרון עיקרי הוא שרק אחד הנוירון עלול נצפה בכל פעם. זה לוקח בערך 30-45 דקות של הקלטה כדי לוודא שאחד הוא הקלטה מתא עצב חישת הגלוקוז, עוד לפני שמתחיל טיפול ניסיוני ספציפי. יתר על כן, תאי עצב במערכת העיכול ומהווים GE &lt;20% מכלל האוכלוסייה העצבית VMH. הרכבה את הבעיה היא חוסר, במקרים רבים, של סמן סלולארי זיהוי לנוירונים אלה. לפיכך, ברור כי למרות מתן מידע בעל ערך חשמלי שטכניקות אחרות לא יכולים, ניתוח מהדק תיקון הוא מייגע, זמן רב ותשואה נמוכה. השימוש בדימות פלואורסצנטי של תאי עצב VMH ניתקו מאפשרת לחקר hundreds של נוירונים בו זמנית. צבעים רגישים סידן ניתן להשתמש כדי למדוד שינויי סידן תוך תאי, אשר בעקיפין לתאם לשינויים בפעילות עצבית. צבעים רגישים פוטנציאל הממברנה משמשים לניטור שינויי פוטנציאל הממברנה. מדידת פוטנציאל הממברנה תאית היא מדד ישיר יותר של פעילות עצבית בהשוואה לשינויים ברמות סידן תוך תאי. יתר על כן, הדמיה קרום פוטנציאל צבע (MPD) שעלול להיות מזהה שינויים קטנים יותר בפוטנציאל הממברנה שבו ירי פוטנציאל פעולה לא משתנים ורמות סידן תוך תאי לא יכולות לשנות. שתי טכניקות ההדמיה הקרינה אלה נעשו שימוש כדי לחקור תאי עצב חישת הגלוקוז VMH מעכברים לנוער 2-7. אמנם תוצאות הן פחות מפורטות מאלו שהושגו עם אלקטרופיזיולוגיה מהדק תיקון, כוחו של ניסויי הדמיה הוא שהם בו זמנית להעריך אוכלוסייה גדולה של תאים שבהכרח כוללים מספר משמעותי של תאי עצב חישת הגלוקוז. i ההדמיה MPDזה שימושי במיוחד לחקר תאי עצב במערכת העיכול שהם יותר אחיד מקומיים לאורך כל VMH; וכך לספק אוכלוסייה מתאימה ללמוד בVMH ניתק (~ GI 15%). בניגוד לכך, בעוד שנוירונים GE בצפיפות מקומיים לventrolateral-VMN ותא באזור בין עניי ARC וVMN, הם לא מייצגים את מספר משמעותי של תאי עצב בתוך VMH (&lt;1% GE). יתר על כן, על ידי לימוד נוירונים בודדים, astrocytic ואפקטי presynaptic בוטלו. זה יכול להיות יתרון בחקר ההשפעות של נוירון הצו ראשון, כמו גם חסרון שכן קשרים ותהליכים פיסיולוגיים הולכים לאיבוד. גורם מגביל בשני אלקטרופיזיולוגיה מהדק התיקון והדמיה לצבוע MPD / סידן הוא הצורך בשימוש בבעלי חיים צעירים (למשל. עכברים או חולדות &lt;8 שבועות של גיל). זה בעיקר בשל רקמת חיבור מוגברת בשילוב עם ירידת כדאיות עצבית המתרחשת עם גיל. בהרבעת אלקטרופיזיולוגיה מוח פרוסהies, רקמת חיבור מוגברת עושה את זה יותר קשה לדמיין את תאי העצב. רקמת חיבור גדל גם עושה את זה יותר קשה לנתק מספר גדול של תאי עצב בריאים לבדיקות הדמיה. יתר על כן, נוירונים מבעלי חיים צעירים לשרוד זמן רב יותר בזמן או הקלטת מהדק תיקון או הדמיה. עם זאת, השימוש בעכברים צעירים יכול להיות מגבלה העיקרית. פעילות ו / או תגובות לשליחים עצביים או חומרים מזינים במחזור עצבי משתנות עם גיל. לדוגמא, מאז מאזן אנרגיה קשור באופן הדוק למצב פוריות, נוירונים ההיפותלמוס ויסות מאזן אנרגיה עשויים להגיב באופן שונה ב- vs מראש חיות postpubescent. בנוסף, מחלות רבות דורשות טיפול לטווח ארוך או לא להתבטא עד לבגרות. דוגמאות מובהקות של מחלות כאלה הן השמנה או סוכרת מסוג 2 סוכרת תזונתית. מאז הם האמינו נוירונים חישת הגלוקוז לשחק תפקיד במחלות אלה פיתחנו מתודולוגיה לculturing הצלחת נוירונים VMH בוגר בריאים לשימוש בexp ההדמיה MPDeriments.

<table><tbody><tr><td>Neurobasal-A בינוני (מותאם אישית)</td> <td>Invitrogen</td><td>0050128DJ</td><td>מותאם אישית ללא גלוקוז</td></tr><tr><td>ללא גלוקוז-Hibernate-A בינוני (מותאם אישית)</td> <td>BrainBits</td><td></td><td>בהתאמה אישית ללא גלוקוז</td></tr><tr><td>פטרפטומיצין פניצילין (20,000 U/ml)</td> <td>Invitrogen</td><td>15140</td><td>ספקים אחרים מקובלים</td></tr><tr><td>Stericup יחידות מסנן ואקום (0.22 &mu; m)</td> <td>Millipore</td><td></td><td>ספקים אחרים מקובלים</td></tr><tr><td>25 מ"מ כיסויי זכוכית</td><td>Warner</td><td>#1 25 מ"מ עגול</td><td></td></tr><tr><td>18 מ"מ כיסויי זכוכית</td><td>Warner</td><td>#1 18 מ"מ עגול</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>B27 מינוס אינסולין (50x)</td><td>Invitrogen</td><td>0050129SA</td><td></td></tr><tr><td>סכין גילוח</td><td>VWR</td><td>55411</td><td></td></tr><tr><td>תא ויברטום ותא קירור</td> מערכת <td>חיתוך</td><td></td><td>Vibratome</td> Series 1000</tr><tr><td>להבי ויברטום</td> מזרק <td>Polysciences</td><td>22370</td><td>או להבי קצה כפול מספקים אחרים מקובל</td></tr><tr><td>Papain, מתלה</td><td>Worthington</td><td>LS003124</td><td></td></tr><tr><td>BSA, מתאים לתרבית תאים</td><td>Sigma</td><td></td><td>אחר ספק מקובל</td></tr><tr><td>DNAse, לתרבית תאים</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>צילינדרים שיבוט מקובלים של ספק</td></tr><tr><td>, 6 מ"מ x 8 מ"מ</td><td>Bellco Glass</td><td>2090-00608</td><td></td></tr><tr><td>צבע פוטנציאלי ממברנה (כחול)</td> <td>התקנים מולקולריים</td><td>R8042</td><td></td></tr><tr><td>מחמם בשורה</td><td>Warner</td><td>SF-28</td><td></td></tr><tr><td>משאבות מזרק</td><td>WPI</td><td>sp100i</td><td>ספק אחר מקובל</td></tr><tr><td>תא</td><td>סגור וורנר</td><td>צינורות פוליאתילן RC-43C</td><td></td></tr><tr><td></td><td>וורנר</td><td>PE-90</td><td></td></tr><tr><td>מטמורף</td><td>התקנים</td><td></td> מולקולריים <td>תוכנת ניתוח תמונה חלופית מקובלת</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>BX61 WI</td><td> בשימוש עם 10X&nbsp; אובייקטיבי</טווח></עמ> </td></tr><tr><td></td><td>פוטומטריה</td><td>מצלמה מגניב הצמד HQ</td><td></td></tr><tr><td>צר Cy3 סט מסננים</td><td>Chroma</td><td>41007a</td><td></td></tr><tr><td>מערכת תאורה</td><td>Sutter Instruments</td><td>Lambda DG-4</td><td></td></tr></tbody></table>

ממברנה דיי הדמיה אפשרית של ventromedial היפותלמוס נוירונים מעכברים בוגרים ללמוד גלוקוז חישה

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

מחקרים של פעילות עצבית לעתים קרובות מבוצעים באמצעות נוירונים ממכרסמים פחות מ -2 חודשים של גיל בשל הקשיים הטכניים הקשורים לרקמת חיבור גוברת וירידה בכדאיות עצבית המתרחשות עם גיל. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה לניתוק של נוירונים ההיפותלמוס בריאים מעכברים בגיל מבוגר. היכולת ללמוד נוירונים מעכברים בוגרים בגיל מאפשרת שימוש במודלי מחלה המתבטא בגיל מאוחר יותר והוא עשוי להיות יותר מבחינה התפתחותית מדויק ללימודים מסוימים. דימות פלואורסצנטי של נוירונים ניתקו יכולה לשמש כדי לחקור את הפעילות של אוכלוסייה של נוירונים, בניגוד לשימוש באלקטרופיזיולוגיה ללמוד נוירון בודד. התכונה זו שימושית במיוחד כאשר לומד אוכלוסייה עצבית הטרוגניות שבהן הסוג העצבי הרצוי הוא נדיר כגון לתאי עצב גלוקוז חישת ההיפותלמוס. אנו מנוצלים הדמיה לצבוע פוטנציאל הממברנה של נוירונים ההיפותלמוס ventromedial מבוגרים ללמוד את התגובות שלהם לצ&#39;הnges ברמת הגלוקוז החוץ תאי. הם האמינו נוירונים חישת הגלוקוז לשחק תפקיד בויסות מאזן אנרגיה מרכזית. היכולת ללמוד חישת הגלוקוז במכרסמים מבוגרים היא שימושית במיוחד מאז דומיננטיות של מחלות הקשורות לאיזון מתפקד אנרגיה (למשל. השמנת יתר) עם עלייה בגיל.

הנתיחה המדויקת של VMH הרחק מאזורי ההיפותלמוס אחרים היא חשובה כדי להשיג תוצאות עקביות. הכללת אזורים אחרים יכולה לדלל את האוכלוסייה העצבית VMH, שינוי% מתאי עצב depolarized המחושב. יתר על כן, תאי עצב חישת הגלוקוז זוהו באזורי ההיפותלמוס אחרים, כגון ההיפותלמוס לרוחב, שעשויות להיות שונה מבחינה תפקודית ואופן מכניסטי מתא עצב גלוקוז חישת VMH. איור 1 מדגים את המקומות אנטומיים הנכונים לנתיחה תקינה. בעקבות הפרוטוקול לעיל, יכולה להיות מנותקת רקמת המוח המכילה את אזור VMH הנכון....

פעילותם של נוירונים בודדים מעכברים בגיל מבוגרים ניתן ללמוד על ידי מתנער נוירונים מאזורים מסוימים במוח ובאמצעות הדמיה לצבוע פוטנציאל הממברנה ניאון. על ידי תגובות בדיקות לשינויים ברמת סוכר, טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור את רגישות הגלוקוז של נוירונים ההיפותלמוס ventromedial מבוגרים.

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את חישת הגלוקוז בנוירונים היפותלמוסיים מדיאליים גחוניים או VMH מעכברים מבוגרים, תוך שימוש בצבע רגיש לפוטנציאל הממברנה כמדד לפעילות עצבית. זה מושג על ידי ביצוע תחילה של זלוף לב כדי לשטוף דם ממוחו של עכבר מורדם לפני הסרת המוח. השלב השני הוא ליצור פרוסות מוח עטרה ולנתח את ה-VMH.לאחר מכן, נוירוני ה-VMH מנותקים ומתורבתים על פתקי כיסוי. השלב האחרון הוא למדוד את הקרינה של הנוירונים כאשר הגלוקוז יורד בנוכחות צבע פוטנציאלי של הממברנה. בסופו של דבר, כל שינוי נוירונים בקרינה משמש לכימות התגובה של אותו נוירון מעוכב גלוקוז לשינויי גלוקוז.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון אלקטרופיזיולוגיה, הוא היכולת לחקור נוירונים מעכברים בוגרים. זה מאפשר לנו לחקור מצבי מחלה בבגרות. התחל בהליך זה על ידי הנחת המוח המנותח על הצ'אק בתא הוויברם כאשר הוויברם מוגדר למהירות איטית ברמה שתיים ומשרעת גבוהה ברמה תשע, חתוך פרוסות ב-300 עד 500 מיקרון עד שתגיע לאזור ההיפותלמוס.לאחר מכן חותכים פרוסות דקות ב-100 מיקרון מהאחורי לקדמי כדי לבודד את אזור ה-VMH המדויק. שימו לב היטב לשינויים אנטומיים ב- bgma מינוס 2.30 מילימטרים. החדר השלישי מופרד לחלקים גביים וגחוניים. קורונה.ברגע שחתכי הרוחב של נתיך החדר השלישי חתכו שתי פרוסות של 500 מיקרון, פרוסות אלה יכילו את האזור הנכון של VMH. מעבירים את הפרוסות הללו לצלחת פטרי על קרח המכילה מצע תרבית. לאחר מכן נתח את ה-VMH.השתמש בפיפטה כדי להעביר בעדינות את חתיכות ה-VMH למיליליטר של מצע תרבית על קרח. בשלב זה, הסר את אמצעי התרבית המכיל את ה-VMH מהקרח ואפשר התאקלמות לטמפרטורת החדר. הוסף 20 יחידות למיליליטר פאפ לארבעה מיליליטר של מצע תרבית, ואז הפוך לערבוב והניח באמבט מים של 34 מעלות צלזיוס בדוק וערבב על ידי היפוך כל דקה עד שמצע העיכול כבר לא מעונן.לאחר מכן, סנן אותו לבקבוק סטרילי והעביר את הרקמה לאמצעי העיכול. לאחר מכן, עכל את הרקמה על ידי ניעור ב-100 סל"ד ב-34 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. במהלך העיכול, הכינו מיליליטר אחד של חומר המכיל 8% אלבומין בסרום בקר על ידי המסה של 80 מיליגרם BSA במיליליטר אחד של מצע תרבית, וסינון לתוך צינור חרוטי.שטפו את הרקמה על ידי העברתה לחמישה מיליליטר של אמצעי תרבית בצינור חרוטי והפיכתה לאט. לאחר מכן, הוסף 30 מיקרוליטר של אנזים ה-DNA לשישה מיליליטר של תרבית, מדיה וערבוב כדי ליצור מצע טציה. לאחר מכן שאפו את אמצעי הכביסה והוסיפו שלושה מיליליטר של אמצעי הכביסה.השתמש בפיפטות הזכוכית כדי למשוך בסדר מהגדול לקטן ביותר טריטר בעדינות 10 פעמים, ולאחר מכן המתן ארבע דקות עד שחתיכות גדולות יותר יתייצבו. לאחר מכן, השתמש בפיפטה השנייה כדי להעביר את שני המיליליטר העליונים המכילים את תרחיף התא המנותק לצינור חרוטי חדש. הוסף שני מיליליטר של tri media tri 10 פעמים והמתן שלוש דקות.השתמש בפיפטה השלישית כדי להעביר את שני המיליליטר העליונים למתלה התא. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של tri media tri rate חמש פעמים והמתן שתי דקות. השתמש בפיפטה הרביעית כדי להעביר את שני המיליליטר העליונים למתלה התא.כעת שכב את תרחיף התאים המנותק על גבי ה-8% BSA, והיזהר לא לערבב אותם. לאחר מכן צנטריפוגה 1000 סל"ד למשך חמש דקות. לאחר מכן, הנח את גלילי השיבוט של שישה על שמונה מילימטר במרכז כל החלקת כיסוי יבשה לחלוטין.לאחר מכן שאפו והשעו מחדש את הגלולה ב -440 מיקרוליטר של אמצעי גידול חמים. לאחר מכן, מלאו את גלילי השיבוט במתלה העצבי והניחו אותו בחממה למשך 20 דקות. הסר את גלילי השיבוט ושטוף את הפסולת בעדינות רבה.לאחר מכן מלאו כל צלחת בשני מיליליטר של מצע גידול ואפשרו לתאים להתאושש לפחות שעה אחת לפני ביצוע בדיקות כלשהן בהליך זה, הכינו את תמיסת ההקלטה והתאימו את ה-pH ל-7.4. כעת הוסף ארבעה מיליליטר של מאגר טמפרטורת החדר לבקבוקון MPD כחול לערבב היטב והוסף לו חמישה מיקרוליטר צבע לכל מיליליטר של תמיסת הקלטה. לאחר מכן, דגרו את התאים בשני מיליליטר של תמיסת רישום גלוקוז של 2.5 מילי-מולרית עם צבע בטמפרטורה של 34 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות מוגנות מפני אור.לאחר מכן מלאו את משאבות המזרק בתמיסת רישום גלוקוז של 2.5 או 0.1 מילימולרית ואת מערכת השפע בתמיסת רישום גלוקוז של 2.5 מילימולרית חבר את הצינור ממזרקים של 60 מיליליטר לסעפת. יש לחבר את צינור הפלט של סעפת לתנור מוטבע, ולאחר מכן צינורות פוליאתילן, אשר מחוברים לאחר מכן לתא סגור.נקה את הבועות על ידי הפעלת מערכת הזילוף והקשה עם חפץ קשיח במידת הצורך. לאחר מכן הגדר את קצב הזלוף ל-0.5 מיליליטר לדקה והשתמש באור מינימלי למשך הזמן הקצר ביותר האפשרי להגדרת המערכת. לאחר מכן, העבירו תלוש כיסוי של 25 מילימטר עם נוירונים דבקים לתא הסגור.היזהר לא לאפשר לכיסוי להחליק להתייבש ולא להכניס בועות אוויר. יישר את ההחלקה בחריצים של החלק התחתון. הנח כמה טיפות של תמיסת הקלטה לאורך הצדדים והתאם בעדינות את החלק העליון כדי להחזיק את החלקת הכיסוי במקומה.לאחר מכן השתמש בטפטפת כדי למלא את החדר בתמיסת הקלטה ולהניח מעליה החלקת כיסוי של 18 מילימטר. הכנס בעדינות את הטבעת הלבנה לתא כדי להחזיק את החלקת הכיסוי הקטנה יותר במקומה. לאחר מכן, לחץ על הטבעת הלבנה כלפי מטה לאט מאוד ובקלילות כדי למנוע הכנסת בועות אוויר לתא הסגור.הפעל את משאבת המזרק לתמיסת רישום הגלוקוז של 2.5 מילימולריות. לאחר מכן לחץ כלפי מטה על הטבעת הלבנה והתחבר לתא הסגור. שחרר לאט לחץ מהטבעת הלבנה והתחבר לצינור המוביל למיכל פסולת.עבור מרכז הדמיה MPD, הנוירונים משתמשים באור שדה בהיר נמוך. נסה למזער את משך הזמן שהתאים נחשפים לאור ולאפשר למערכת הזלוף לפעול במשך 10 דקות לייצוב הטמפרטורה, המיקוד ושיווי המשקל בזמן ההתחלה. פתחו את תוכנית METAMORPH וצלמו תמונת שדה בהירה של הנוירונים בהגדלה פי 10.השתמש בפונקציית המיקוד האוטומטי כדי לצלם שלוש ערימות של תמונות פלואורסצנטיות ולקבוע את המיקוד בטווח של חמישה מיקרון. בתום תקופת ההתחלה של 10 דקות, בדוק את המיקוד פעם נוספת, ולאחר מכן התחל להקליט תמונות פלואורסצנטיות כל 30 שניות למשך 40 דקות. קבעו קו בסיס של גלוקוז של 2.5 מילימולרית למשך 10 דקות.לאחר מכן הפחיתו את רמת הגלוקוז למשך 15 דקות, ולבסוף חזרו ל-2.5 מילי-מולרי גלוקוז למשך 15 דקות. אחרי הקלטת כל התמונות הפלואורסצנטיות, צלמו תמונת שדה בהיר של הנוירונים. האיור הזה מראה תמונה בשדה בהיר של תאי העצב הבריאים של VMH מעכבר בוגר.תמונה זו צולמה 24 שעות לאחר הדיסוציאציה ושימשה להדמיית MPD. כמה דוגמאות לתאי עצב שישמשו או לא ישמשו לניתוח מסומנות כמוצגות. להלן עקבות הפלואורסצנטיות המייצגות של MPD של נוירון במערכת העיכול המסומן בירוק ותא עצב שאינו במערכת העיכול המסומן על ידי תאים כתומים הוחדרו לתמיסת רישום גלוקוז של 2.5 מילימולרית למשך 10 דקות, ואחריה ירידה ל-0.1 מילי-מולרי G למשך 15 דקות וחזרה ל-2.5 מילי-מולרי G למשך 15 דקות.איור זה מציג את אחוז נוירוני ה-VMH הבוגרים, אשר מתפרקים באופן הפיך בתגובה לירידה בגלוקוז שזוהתה באמצעות הדמיית MPD פלואורסצנטית. גודל שינוי הגלוקוז נמצא בקורלציה חיובית עם אחוז הנוירונים הדפולריזציה בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון R-T-P-C-R של תא יחיד כדי לזהות חלבונים ספציפיים המתבטאים על ידי נוירונים של חישת גלוקוז.

membrane-potential-dye-imaging-ventromedial-hypothalamus-neurons-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בפרוטוקול זה, אנו מעדכנים את ההתקדמות האחרונה בתחום ההדמיה...

תגובות סידן הדמיה בנוירונים GFP-tagged של פרוסות מוח עכבר ההיפותלמוס

הסרטון מדגים טכניקה למדידת ספיגת הגלוקוז בתאי עצב מוטוריים של זחל  Drosophila  באמצעות חיישן גלוקוז תוך-תאי מבוסס העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית (FRET). לאחר ניתוח הזחלים כדי לחשוף את חוט העצב הגחוני, הנוירונים המוטוריים נראים דרך הקרינה הנפלטת על ידי הפלואורופור התורם של החיישן. כאשר מגורה עם גלוקוז, FRET בין התורם של החיישן לפלואורופורים המקבלים מפעיל את פליטת הקרינה מהמקבל, ומאפשר השוואה של ספיגת הגלוקוז בין זחלי בקרה לזחלים מוטנטיים עם חילוף חומרים מוגבר של גלוקוז.

הערכת ספיגת גלוקוז בתאי העצב המוטוריים של זחלי דרוזופילה עם חילוף חומרים מווסת של גלוקוז

מקור: Changou, C. A., et. al. תמונות חיות של סחר בחלבון GLUT4 בנוירונים היפותלמוסיים ראשוניים של עכברים באמצעות מיקרוסקופ דה-קונבולוציה. J. Vis. Exp. (2017). סרטון זה מציג את ההדמיה של טרנסלוקציה של GLUT4 המושרה על ידי אינסולין בנוירונים היפותלמוסיים, תוך שימוש במיקרוסקופ דה-קונבולוציה כדי ללכוד ולנתח דינמיקת סחר ב-GFP-GLUT4 ברזולוציה גבוהה.

הדמיית סחר בחלבון GLUT4 בנוירונים היפותלמוסיים ראשוניים של עכבר באמצעות מיקרוסקופ דה-קונבולוציה

למרות החשיבות הפונקציונלית ורפואית של...

מניפולציה גנטית של העכבר באמצעות פיתוח היפותלמוס<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

מתוארת שיטה להדמיית שינויים בפוטנציאל הממברנה באמצעות מחווני מתח מקודדים גנטית.

ממברנה הדמיה פוטנציאלית עם שני סוגי חיישני מתח פלורסנט מקודדים גנטיים

פרוטוקול זה מתאר שיטה עבור השגחה של אמת ירוק פלורסצנטיות חלבון (GFP) מתויג גלוקוז טרנספורטר 4 (GLUT4) חלבון סחר על גירוי האינסולין, אפיון התפקיד הביולוגי של CCR5 ב האינסולין – GLUT4 איתות עם מיקרוסקופ Deconvolution.

תמונות בשידור חי של GLUT4 חלבון בבני אדם העכבר נוירונים היפותלמי העיקרי באמצעות מיקרוסקופ Deconvolution

פרוטוקול זה לומד את התפקיד של ליגנד (מוטיב C-C) כימוקין 5 (CCL5) בהיפותלמוס על-ידי אספקת אנטגוניסט, MetCCL5, לתוך המוח העכבר באמצעות מערכת מיקרו-osmotic משאבת אינפוזיה המוח. זה עיכוב ארעית של פעילות CCL5 התפרץ היפותלמי אינסולין איתות, המוביל גלוקוז סובלנות ורגישות לאינסולין מערכתית היקפיים.

לומדים את האות ההיפותלמוס אינסולין סובלנות גלוקוז היקפי עם מערכת עירוי רציף סמים לתוך המוח העכבר

הדמיית in vivo היא כלי רב עוצמה לחקר הביולוגיה בבריאות ובמחלות. פרוטוקול זה מתאר הדמיה טרנס-אימונית של רשתית העכבר באמצעות מיקרוסקופ סטנדרטי של שני פוטונים. הוא גם מדגים שיטות שונות של הדמיה חיה כדי לתייג פלואורסצנטיות קבוצות תאים מרובות של הרשתית.

הדמיה טרנס-אימונית של שני פוטונים In vivo של רשתית העכבר

ספיגת הגלוקוז מוגברת בתאי העצב המוטוריים של Drosophila המושפעים מחלבון מחייב DNA TAR (TDP-43), כפי שצוין על ידי חיישן גלוקוז מבוסס FRET, מקודד גנטית.

מדידת ספיגת גלוקוז במודלים של דרוסופילה של פרוטאינופתיה TDP-43

תקשורת מעיים-מוח, המתאפשרת על ידי העצב התועה, חיונית לתקשורת בין המערכת האנדוקרינית של מערכת העיכול לבין המוח. עם זאת, אם הזרקת גלוקוז תוך קיבתי יכול לשנות את פעילות קליפת המוח עדיין לא מובן. כאן, אנו מציעים פרוטוקול מקיף לצפייה בשינויים בפעילות קליפת המוח לאחר הזרקת גלוקוז לתריסריון.

ניתוח בזמן אמת של תקשורת עצבית בין המעי למוח: קליפת המוח דינמיקה רחבה של סידן בתגובה לגירוי גלוקוז במעיים

חקור חישת גלוקוז בנוירונים של ההיפותלמוס הוונטרומדיאלי בעכברים בוגרים באמצעות הדמיית צבע רגיש לממברנה. שיטה זו מאפשרת מדידת פעילות נוירונלית בתגובה לשינויים בריכוזי גלוקוז.

ממברנה דיי הדמיה אפשרית של ventromedial היפותלמוס נוירונים מעכברים בוגרים ללמוד גלוקוז חישה

גלה סרטונים נוספים