אינדוקציה של קרצינומה של תאי מעבר שלפוחית ​​השתן פולשנית בMUC1 עכברים הטרנסגניים חיסוניים אנושיים שלמים: מודל לפיתוח חיסוני

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לגרום ביעילות לתגובת לימפוציטים T ציטוטוקסית המכוונת לאנטיגן הקשור לגידול בסרטן שלפוחית השתן. זה מושג על ידי השראת סרטן שלפוחית השתן בעכברים המבטאים את האנטיגן הקשור לגידול האנושי. לאחר מכן, מוזרק חיסון פפטידי לעכברים ונוצרת תגובת לימפוציט T ציטוטוקסית ספציפית אחת.

לאחר מכן מבודדים את הגידול והטחול בסרום ומנתחים את הרקמות לאיתור ציטוקינים, אנטיגנים ותגובה חיסונית בהתאמה. שימוש במולטיפלקס כתם מערבי, מיקרו-חרוז פלואורומטרי, אימונוהיסטוכימיה של בדיקה חיסונית וניתוח נקודה חיה מאפשר לנו לבדוק את היעילות של חיסון פפטיד נגד סרטן שלפוחית השתן. שלום, אני ד"ר גרגורי ווץ, מדען חוקר במערכת הבריאות של אוניברסיטת קליפורניה דייוויס בסקרמנטו, קליפורניה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו בהשוואה לשיטות קיימות כמו xenografts, הוא ש-xenografts דורשים מארחים מדוכאי חיסון, בעוד שהמודל שלנו משתמש בעכבר טרנסגני שלם חיסוני המבטא אנטיגן הקשור לגידול אנושי שהוא המטרה של החיסון הפפטידי. ידגימו איתי את הטכניקות דניאל V והדוקטורים צ'אגה ואודרי גוטיירז, כולם מדעני מחקר עמיתים, והמעבדה של ד"ר מייקל דה גרגוריו ומערכת הבריאות של אוניברסיטת קליפורניה בדייוויס. לפני מתן המנה הראשונה של N בוטיל, N ארבע הידרוקסי, בוטיל ניטרוסאמין או O-H-B-B-N כדי לגרום לסרטן שלפוחית השתן, בצע דימום תת-לסתי על כל עכבר כדי לאסוף דם מלא וצינורות קרישת דם ואפשר 30 דקות לקרישת הדם.

החל משמונה שבועות באמצעות מחטי נירוסטה 20 מד, יש לתת את ה-O-H-V-B-N דרך הפה חמישה ימים בשבוע למשך 12 שבועות. בשבוע 20, השתמש ב-600 מיקרוליטר של תמיסת מלח סטרילית של 0.9% כדי להרכיב מחדש כל בקבוקון של חיסון פפטיד ליופילי והשהה מחדש ביסודיות על ידי שאיבת התמיסה דרך מחט בגודל 0.5 אינץ' 27 שש פעמים באמצעות מי מלח. התאם את הריכוז כך שהמינון הרצוי יינתן בנפח של 100 מיקרוליטר לאחר המנה האחרונה של O-H-B-B-N ומתן החיסון על בסיס שבועי למשך מחזור של שמונה שבועות על ידי שימוש במחט בגודל 25 כדי להזריק 100 מיקרוליטר של החיסון שמונה שבועות לאחר המנה האחרונה של O-H-B-B-N.

לאחר המתת חסד של כל העכברים על ידי חנק פחמן דו חמצני, הניחו כל עכבר על לוח חיתוך והצמידו את כל ארבעת הגפיים. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים ומספריים, בצע חתך אופקי באזור הבטן העליונה. הכנס את המספריים לחתך שבין שכבת האפידרמיס לדופן הבטן, ובעזרת מלקחיים הפרד בעדינות את העור מהרקמה הבסיסית.

בצע חתך אנכי מהחתך האופקי בעקבות הציר האמצעי לכיוון הקצה הקדמי של העכבר. לאחר מכן הפרד את העור מכלוב הצלעות ובעזרת מזרק מיליליטר אחד ומחט בגודל 22, נקב את הלב ואסוף דם במשיכה חלקה ויציבה באמצעות מלקחיים ומספריים. חותכים ומקלפים את שאר שכבת האפידרמיס בתוך ארון בטיחות ביולוגי.

חותכים את דופן הבטן והצפק ואספטיים. הסר את הגידול בשלפוחית השתן עבור אימונוהיסטוכימיה או IHC וכתם מערבי עבור IHC. הניחו את דגימת הגידול בשלפוחית השתן בקלטת רקמות וקבעו אותה בפורמין צונן למשך הלילה.

בטמפרטורת החדר, אסוף את הטחול לניתוח כדאיות התא ונקודת שכיבה לביצוע הבדיקה החיסונית של חיידק פלואורו מטרי. השתמש ב-200 מיקרוליטר של מאגר בדיקה כדי להרטיב מראש. צלחת תחתונה של 96 בארות, המאפשרת למסנן להיספג לחלוטין.

לאחר מכן השתמש במנגנון ואקום של צלחת 96 בארות כדי לנקז בעדינות את המסנן והשתמש במגבות נייר כדי לייבש את תחתית הצלחת בדם באמצעות פיפטה פיפטה רב-ערוצית 25 מיקרוליטר של מטריצת סרום לבארות שהוקצו לחסר ולתקנים ופיפטה 25 מיקרוליטר של מאגר בדיקה לבארות שהוקצו לבקרות ולא ידועות. לאחר מכן פיפטה 25 מיקרוליטר מהתקנים הריקים, בקרות ולא ידועים לבארות שהוקצו בהתאמה. מערבלים את תערובת החרוזים למשך 20 שניות ומעבירים את החרוזים למאגר.

ואז פיפטה 25 מיקרוליטר מתערובת החרוזים לכל אחד. מכסים היטב את הצלחת כדי להגן עליה מפני אור ומנערים את הצלחת על שייקר ב-500 סל"ד למשך שעתיים בטמפרטורת החדר, מסננים את הצלחת ומשתמשים ב-200 מיקרוליטר PBST כדי לשטוף אותה פעמיים לפני ניקוז וייבוש. להכנת תמיסת הנוגדנים לגילוי, שלב את הכמות הנדרשת של 0.1% PBST ונוגדני זיהוי בצינור של 15 מיליליטר ומערבולת למשך 10 שניות.

ואז פיפטה 25 מיקרוליטר לכל אחד. ובכן מנערים את הצלחת בחום של 500 סל"ד למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן מסננים ושוטפים את הצלחת עם 200 מיקרוליטר של 0.1% PBST פעמיים מסננים ומכתימים פיפטה יבשה 25 מיקרוליטר מהסטרפטוקוס הטרי שהוכן , AVID ו- FICO eryn או SAPE לכל אחד, מניחים היטב את הצלחת על שייקר הצלחת ודוגרים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ב -500 סל"ד.

מסננים ושוטפים עם PBST פעמיים. כדי להשעות את החרוזים, הוסיפו 100 מיקרוליטר של 0.1% PBST לכל באר ונערו במהירות של 500 סל"ד למשך שתי דקות לפחות. השתמש במכונת Luminex LX 200 כדי לקרוא ולנתח את הצלחת בארון בטיחות ביולוגי.

עבדו את הטחול של העכבר דרך מסננות רקמת ניילון של 100 מיקרומטר לחמישה מיליליטר של PBS סטרילי בצלחות פטרי סטריליות. שכבו את ה-PLE aytes על שלושה מיליליטר של מדיום הפרדת לימפוציטים בצינורות סטריליים של 15 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינורות ב-600 GS למשך 15 דקות.

כדי להפריד את הלימפוציטים מתאי הדם האדומים, העבירו את הלימפוציטים השכבתיים מעל השיפוע לצינורות סטריליים חדשים של 15 מיליליטר בצינורות צנטריפוגות בורג של 1.5 מיליליטר. השתמש במגיב כדאיות ספירה כדי לבצע דילול סדרתי של הלימפוציטים. ואז נתח על המוזה.

הכן מפת צלחת של הדגימות והתנאים עבור לוחית הספוט של הברית על ידי הכנת הצלחת לפי פרוטוקול היצרן ופיפטה 100 מיקרוליטר של פפטיד בינוני או פפטיד מקושקש לכל אחד. ובכן מוסיפים 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים ומדגרים את הצלחת ב -37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. עקוב אחר פרוטוקול היצרן לבדיקת נקודתית ALI והשתמש במיקרוסקופ החיתוך כדי לנתח את לוחית הספוט של Aly שפותחה.

כמת את התוצאות על ידי ספירת מספר הכתמים הצבעוניים המתאימים לכל אנליט בכל באר. הכתמים תואמים למספר התאים היוצרים כתמים בכל באר באינדוקציה של מודל העכבר הטרנסגני שלנו עם החומר המסרטן הכימי. O-H-B-B-N הביא לשיעור גבוה של אירועי סרטן שלפוחית השתן של קרצינומה של תאי מעבר או TCC עם קרצינומה כלשהי של תאי קשקש או SCC, הדומה לסרטן שלפוחית השתן בבני אדם כפי שמוצג באיור זה.

שמונה שבועות לאחר השראת O-H-B-B-N, שיעור ההיארעות של סרטן שלפוחית השתן עבור עכברים טרנסגניים או TG ועכברים מסוג בר היה 67% צביעת המטין ואאוזין אישרה את נוכחותם של TCCs ו-SCCs עם TCCs הדומיננטיים ביחס של שניים לאחד. בין אלה, ראינו מגוון של גידולים לא פולשניים בדרגה נמוכה וגבוהה עד בדרגה גבוהה. כל דגימות סרטן שלפוחית השתן של מאך 1 היו חיוביות לביטוי מאך אחד על ידי IHC.

במהלך פיתוח המודל, רמות הציטוקינים הדלקתיים בסרום נוטרו באופן סדרתי בין שבוע 8 ל-28. ראינו שרמות הציטוקינים הדלקתיים עלו עם הזמן מהאינדוקציה ועד סוף המחקר. דפוס ציטוקינים זה דומה מאוד למה שראינו בעבר במודל סרטן הריאות שלנו, מה שמצביע על כך שהעלאת רמות הציטוקינים הדלקתיים עשויה להיות בקורלציה עם התפתחות הגידול.

כדי להעריך את תגובת הציטוקינים בסרום לחיסון הפפטיד, 15 עכברים מחוסנים ו-14 עכברי TG שטופלו בפלצבו הומתו ונאסף דם בסוף המחקר. 24 שעות לאחר הטיפול האחרון בחיסון. ניתוח מולטיפלקס מראה רמות גבוהות יותר של ציטוקינים בסרום אחד של TNF אלפא אינטרפרון גמא IL, שניים IL 12 ו-IL 17 בקבוצת החיסון.

בהשוואה לקבוצת הפלצבו, רמות TNF אלפא אינטרפרון גמא ו-IL 17 היו גבוהות משמעותית בעכברים שקיבלו חיסון. תוצאות אלה מצביעות על תגובת ציטוקינים מקוטבת לחיסון הפפטיד על מנת להעריך את התגובה החיסונית TH 1, TH 2 לחיסון הפפטיד. ציטים SP הוערכו על ידי אינטרפרון גמא IL ארבע נקודות ALI המוצגות כאן היא הערכה של לימפוציטים מבודדים לכדאיות לאחר זריעת לוחות נקודתיים של ALI עם לימפוציטים ברי קיימא, התוצאות בניסוי זה היו תגובת גמא אינטרפרון ברורה וספציפית לפפטיד, המאשרת את התגובה החיסונית TH one לחיסון הפפטיד לאחר פיתוחו.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האימונולוגיה של הסרטן לחקור אימונותרפיה חדשה תוך שימוש במודל פרה-קליני של סרטן שלפוחית השתן מתקדם.