שיטות לאפנון וניתוח של Neurogenesis מבוגרים NF-κB תלוי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את תפקודו של גורם השעתוק NF kappa B במוח הבוגר. זה מושג על ידי רבייה ראשונה של עכברים טרנסגניים המעכבים באופן ספציפי את פעילות NF kappa B בנוירונים. השלב השני של ההליך הוא בדיקת ההשלכות ההתנהגותיות של עיכוב NF kappa B באמצעות התבנית המרחבית, ההפרדה או האסמים, מבוך.

השלב השלישי הוא ריבוי זהיר של בעלי החיים, הסרת המוחות וחלוקתם הנכונה. השלב האחרון הוא ניתוח השפעות היסטולוגיות ומבניות, כגון הדמיה של הקרנות סיבים טחבים על ידי צביעה חיסונית. בסופו של דבר, שימוש במבחן ההתנהגות ואחריו היסטולוגיה יכול לתאם שינויים בלמידה התלויה בבליטה המשוננת עם שינויים מבניים ברקמות קשורות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו אגרטל מאדים הוא שקשרי הפרדת דפוסים מרחביים MA מציע את ההזדמנות למדוד באופן ספציפי תהליכי למידה אנטי-תלויים בילדים כמו גם ניוון עצבי והתחדשות באזור מוח זה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירוגנזה של מבוגרים, כגון למידה כהפרדת דפוסים מיוחדים. הדגמת המבוך תיעשה על ידי אנג'לה קולה, טכנאית מהמעבדה שלי.

הזילוף יוצג על ידי פיטר היימן, עמית מחקר. לאחר מכן החתך של המוחות יוצג על ידי טכנאי אולריך KA. ולבסוף, מיקרוסקופ הסריקה הקונפוקלי יוצג על ידי ג'נין מואה, דוקטורנטית במעבדה שלי לבצע את הפרדת הדפוסים המרחבית.

בארנס מבוך בדיקות התנהגותיות על פי הנחיות בינלאומיות ומקומיות. לצורך בדיקה זו, חשוב להשתמש רק בעכברים זכרים בני חצי שנה לפחות. עבור כל סדרת בדיקות, החיות חייבות להיות בטווח של ארבעה ימים ואותו מפעיל צריך לבצע את כל הבדיקות לפני הבדיקה.

יש להאכיל את העכברים בתזונה סטנדרטית כך שהם מונעים על ידי אוכל מתוק. כדי להגדיר את הבדיקה תחילה, השג צלחת לבנה בקוטר 120 ס"מ העשויה מפלסטיק קשיח. רמזי המבוך הנוספים יכולים להיות עשויים מחומרים שונים ועשויים להיות בעלי צורות שונות.

חשוב לציין, הם חייבים להיות בעלי ניגודיות גבוהה כדי להיות מזוהים בבירור על ידי גלגלי הריצה של בעלי החיים. סולמות ומנהרות הם כולם רמזים טובים. מקם את הצלחת מתחת למספר מנורות פלורסנט ניאון בעוצמה בינונית, כך שלעכברים תהיה מוטיבציה לצאת מהאור.

החדר חייב להיות מבוקר לחות ובטמפרטורה קבועה של 22 מעלות צלזיוס. כעת הגדר את מערכת מעקב הווידאו. מקם את המצלמה 115 סנטימטרים מעל מרכז הצלחת.

לאחר מכן, צרף רמזי מבוך נוספים צבעוניים לבד בצבע לבן שמתאים לצלחת. מקם אותם ליד מרכז הבד כך שיהיו גלויים בקלות לבעלי החיים. כעת, נקו בזהירות את הצלחת עם חומר החיטוי המהיר שיכול להסיר כל ריח מההתקנה הניסיונית.

מקם שבעה בתי אוכל צהובים זהים על הצלחת הלבנה. יש לסמן באופן חד משמעי את מיקומם יום לפני תחילת הבדיקות, להרגיל כל עכבר לדיסק. הניחו תגמולים של כדורי מזון מתוק כמו לולאת פרי רבע בתוך כל אחד משבעת בתי המזון לניסוי המגורים.

שים כל עכבר על נקודת ההתחלה של הצלחת ואפשר לו 10 דקות לחקור. הקליטו את החקירה הזו בין עכברים. נקו את הצלחת העגולה ואת בתי המזון בעזרת חומר חיטוי מהיר.

מלאו גם את תגמולי המזון. בשבעת הימים הבאים ברציפות, הפעל את ניסויי הבדיקה לבדיקות. כל הבתים מלבד אחד נסגרים על ידי סרט שקוף לכל הניסוי.

זה תמיד אותו בית. כל בית עדיין עמוס בפרס והמבחן מתנהל כמו מבחן ההתרגלות. בצע את הבדיקות באותה שעה ביום עבור כל בעל חיים כדי למנוע שינויים ביולוגיים.

מאוחר יותר, נתח את ההשהיה, המרחק המכוסה והשגיאות באמצעות סטטיסטיקה מתאימה. תוכנה מגדירה שגיאות כהתקרבות לבית האוכל הלא נכון או יצירת קשר עם הקופסה המתאימה, אך אי כניסה ואחזור התגמול. כדי להשוות בין הקבוצות, השתמש ב-ANOVA דו-כיווני עם מבחן פוסט הוק.

לאחר הרדמת החיה בהזרקה אינטרפריטונאלית של ורטין, יש לחלחל אותה בזהירות בלבביות עם PBS המכיל הפרין ופרופאן. צור חור בחדר השמאלי באמצעות מחט בגודל 26. בצע גם חתך בפרוזדור הימני כדי לאפשר לדם ולזרום שמונה החוצה.

הכנס את מחט הזלוף לחדר השמאלי בחור בזווית ישרה ולעומק של מילימטר עד שניים. השתמש בלחץ הידרוסטטי של 1.2 עד 1.4 מטר והטמע את העכבר במשך שתיים עד ארבע דקות. עקוב אחר הפרין ופרופאן עם 4% פרלדהיד ב-PBS למשך 10 עד 15 דקות.

הזלוף צריך להיות בקצב של 15 מיליליטר לדקה. עכשיו נתחו את המוח. זה צריך להיות לבן חיוור ללא כלי דם אדומים נראים לעין.

קבעו את כל המוחות שנאספו ב-4%para formaldehyde ב-4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. למחרת. Cryo מגן על המוח ב-30% סוכרוז ב-PBS מאחסן אותם בארבע מעלות צלזיוס לפחות 24 שעות לאחר מכן.

המוחות מוקפאים על במת טון קריו וחותכים למקטעים אופקיים בעובי 40 מיקרון. לאחר צביעת החלקים בנוגדנים לחוט עצבי M, ניתן לדמיין את הקרנות הסיבים הטחבים באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי באורך הגל המתאים לנוגדנים הפלואורסצנטיים. התחל את הסריקה בהגדלה נמוכה והתמצא בהקרנות ההיפוקמפוס וסיבי הטחב.

לאחר מכן, בהגדלה גבוהה יותר, אסוף סריקות ניתוח קיסרי ברזולוציה גבוהה של הסיבים הטחבים לניתוח כדי לחקור את הביטוי של הטרנסגן I kappa B alpha AA one. בכפול מוחות של עכברים טרנסגניים בודדו, נחתכו ונצבעו באמצעות נוגדן כנגד סריקת לייזר קונפוקלי GFP. מיקרוסקופיה חשפה ביטוי גבוה של הטרנסגן באזור CA אחד, באזור CA 3 וב-DG כדי לקבוע את סוג התא המוקדם ביותר המבטא את CAMK שני מונעי אלפא I kappa B alpha AA אחד באזור הנוירוגני של ההיפוקמפוס.

קטעי קריו של היפופוטם קמפי מ- I Kappa BTTA. בעלי חיים נצבעו עבור קורטין כפול והניתוח הקונפוקלי הטרנסגני חשף אותות GFP בתאי גרגיר חיוביים צעירים DCX המסומנים על ידי החצים המצביעים על אינדוקציה של ביטוי הטרנסגן על ידי פעילות אלפא של CAMK. חלקים עטרתיים של ההיפוקמפוס של עכברי i kappa BTTA ו- i Kappa B מינוס נצבעו עבור נוירופילמנט M כדי לדמיין הקרנות סיבים טחבים ולחשוף ארגון מורכב ושלפוחית בעכברי I kappa BTTA.

בליטות הסיבים הטחבים נפגעו קשות. בנוסף, עיכוב NF kappa B הוביל להפחתה משמעותית בעובי להב הזרע ולנפח DG קטן יותר כדי לחקור את הסיבות הפוטנציאליות לפגם המבני הדרמטי. פרוסות היפוקמפוס טריות לא קבועות מביקורת ועכברי I kappa BTTA נצבעו בירקן פלואורו C, המאפשר זיהוי ספציפי של מוות תאי עצב

מספר גדל באופן דרמטי של נויריטים מנוונים נצפה בבעלי חיים טרנסגניים כפולים בהשוואה לבקרות טרנסגניות בודדות. יתר על כן, עלייה משמעותית של שלושה תאים חיוביים לקיפאסה שסועים זוהתה בעכברי I kappa BTTA. לעומת זאת, צביעה אימונוהיסטוכימית כנגד DCX חשפה כמויות מוגברות משמעותית של תאים חיוביים ל-DCX במוחם של עכברי I kappa BT.

יתר על כן, תאים חיוביים ל-d CX ב-I kappa B TTA hippo Campi לא היו מסודרים אך ורק באזור התת-גרגירי, אלא נמצאו גם באזורים העמוקים יותר של ה-dg. ואילו האבות החיוביים ל-D CX בחיות הביקורת היו ממוקמים כמעט אך ורק באזור התת-גרגירי. בדיקת הכמות המוגברת של תאים המבטאים DCX הייתה תוצאה של התבגרות של אבות קודמים או ישירות עקב התפשטות של תאים חיוביים DCX.

BRDU הוזרקה תוך צפקית של עכברי BTTA ועכברי ביקורת, אשר לאחר מכן נחתכו בהקפאה ונצבעו ב-DCX ו-BRDU לניתוח התפשטות. BRDU הוזרק פעם אחת ואחריו ניתוח לאחר 24 שעות. לצורך ניתוח ההתמיינות בוצעו שלוש זריקות ביום, ולאחר מכן ניתוח לאחר שבעה ימים לאחר הזרקת BRDU אחת.

לא נצפו הבדלים משמעותיים במספר הכולל של תאים חיוביים ל-BRDU בין חיות I kappa BTTA שליליות לביקורת. לעומת זאת, גישת שלוש הזריקות הסדרתיות חשפה כמות מוגברת בבירור של תאים חיוביים B-R-D-U-D-C-X ב-DG של I capa, BTTA. עכברים שהופרעו בהתמיינות או באינטגרציה של תאים המבטאים DCX עשויים להגדיל את מספר התאים ותאים מסוג 3 עשויים להיות מעורבים כדי לבדוק באופן ספציפי את התנהגותם של העכברים הטרנסגניים הכפולים.

במשימה תלויה ב-DG, הופעל ה-S-P-S-B-M. חיות הביקורת I kappa B חקרו את בתי המזון באופן סדרתי ביום הראשון של הניסוי. לאחר שבעה ימי אימון, החיות הצליחו למצוא את בית האוכל הפתוח ישירות.

לעומת זאת, חיות IA BTTA ממשיכות לחקור את בתי המזון באופן סדרתי גם לאחר האימון. התצפית על עלייה משמעותית במרחקים שעברו ושיעורי השהיה ושגיאות גבוהים יותר בחיות I kappa BTTA בהשוואה לחיות הביקורת i Kappa B מצביעה על כך שלבעלי חיים אלה היו ליקויי למידה חמורים. לאחר הקמתה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך 30 דקות לכל בעל חיים אם היא מבוצעת כראוי לאחר התפתחותה.

טכניקה זו עשויה לסלול את דרכה למדעני מוח אחרים המעוניינים במשימות תלויות בג'ירוסקופים כמו ניוון נוירוגנזה של מבוגרים או התחדשות בעכברים.