Name: גידול בתאי גזע עצבי מאזורים קונבנציונליים ולא קונבנציונליים של המוח מכרסם מבוגרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-18T20:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: למדו לגדול תאי גזע עצביים ממבוגרים מכרסמים באמצעות שיטת תרבית מונולייר. שיטה זו מאפשרת לחקור את פוטנציאל ההתחדשות העצמית וההתמיינות של התאים לשימוש ברפואה רגנרטיבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה (בחלקו) על ידי הלמהולץ ברית ICEMED - ההדמיה וריפוי מחלות מטבוליות הסביבה, באמצעות קרן היוזמה והרשת של הלמהולץ האיגוד, מענק מKroener-Fresenius הקרן אחרת, ומענק מForschungsgemeinschaft דויטשה ( SFB 655: תאים לרקמות).

העבודה שומרת על מגילת Helsinski והצהרת בעלי החיים ארוו. בעלי חיים המשמשים לאיסוף רקמות וכל השיטות הרלוונטיות היו במעקב על פי ההנחיות של מתקן בעלי החיים באוניברסיטת דרזדן. בעלי חיים טופלו ושוכנו על פי ההנחיות פדרלי הגרמנית לשימוש וטיפול בבעלי חיים במעבדה, והמחקר אושר על ידי דרזדן Landesdirektion. נא להתייעץ עם המדיניות של המוסד שלך וטרינרים (IACUC או לוח אחר) אודות המתודולוגיה המתת חסד מתאימה. ניתן למצוא מניות ספציפיות וריכוזים של חומרים כימיים עבודה בלוחות מגיב מלווים בפרוטוקול זה. 1. הכנת צלחת תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנות מעילים עם נפח מספיק של 75 מיקרוגרם / מיליליטר פולי-L-ornithine (כלומר 2 / טוב מיליליטר של צלחת 6 היטב) לילה בחממת תרבות תא 2 ימים לפני המועד המתוכנן לנתיחה. </li><li&gt; לשאוב פולי-L-ornithine למחרת ולשטוף היטב כל אחד 2x עם 3 מיליליטר של PBS במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את לשטוף הסופי, ולאחר מכן להוסיף פיברונקטין (בדילול 1:250, 4 מיקרוגרם / מיליליטר PBS) לצלחת ומניח את הכלים באינקובטור במשך לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב פיברונקטין ביום לנתיחה ולשטוף את הכלים 2X עם PBS. החזר את הצלחות עדיין מכילות PBS הסופי לשטוף לחממה עד הרקמה ניתק מוכנה לculturing. באותו זמן, להסיר את PBS לפני ציפוי הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות חנות מצופות פולי-L-ornithinein החממה לתקופה של עד 3 שבועות. צלחות מצופים פיברונקטין יכולות להיות מאוחסנות במשך שבוע עד 1. ציפוי פיברונקטין יכול להיעשות קטן כמו 2 שעות אם דחוף. פיברונקטין הוא רגיש denaturation; לא להתסיס את הפתרון, או שמנות להתייבש. </li></ol> 2. נתיחה / ציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול זה חל על השימוש של 3 חולדות מבוגרים (3-6 חודשים של גיל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צ&#39;ילl מוח חתך בלוק על קרח לפני והרדמת חסד החולדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח צינור פלקון 15 מיליליטר המכיל 5 מיליליטר של מדיום N2 עם bFGF הוסיף על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את החולדות על פי מדיניות וטרינרי המוסד שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוח מהגולגולת על ידי ביצוע חתך את קו האמצע של הראש. שימוש במלקחיים כדי לקלף את העצם ומאפשר למוח להיות מופק בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המוח לתוך צלחת פטרי המכילה 10 סנטימטר קר כקרח PBS. זו תסיר את כל שיער ודם שיורית. (איור 1 א) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המוח לבלוק חתך הצונן. (איור 1) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס סכין גילוח הנקי חדש אחד לבלוק כמו בתמונה באיור 1 ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס הזנב מ&quot;מ שני גילוח נקי להב 3 לראשון כפי שמודגם באיור 1D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רם בזהירות את הלהבים מהבלוק, לוקח איתם את החלק של ריבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהלוכה שניותtion את הלהב על ידי טבילתו בPBS. (איור 1E) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת קציר מהאזור של עניין (בדוגמא זו השתמשנו בהשליך קדמי, (ACA הקדמי), איור 1F) באמצעות # 5 מלקחיים ולאסוף לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר מכיל בינוני N2 1 מיליליטר המכיל bFGF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הצינור לתוך מכסה המנוע הזרימה למינרית תרבות תא, בהמשך לשאר הפרוטוקול בתנאים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכאני לנתק את הרקמות באמצעות פיפטה קצה מיליליטר 1 המצורף לpipettor P1000. כמה פעמים פיפטה מעלה ומטה (כ 20x בשיעור של מחזור pipetting 1 לשנייה) תוך כדי לחיצה על הפתיחה של קצה פיפטה נגד החלק התחתון של צינור חרוטי (איורים 1G 1-3). תפסיק טחינה דקה כאשר הפתרון הופך להיות הומוגנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר הפתרון לשבת במשך 2 דקות, כדי לאפשר את כל רקמת nondissociated גדולה יותר כדי ליישב לתחתית. (איור 1G 4) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף homogensupernatant eous ומקום לתוך צינור חרוטי המכיל 8.5 מיליליטר של תקשורת N2 תוספת 20 bFGF ng / ml, 500 Dll4 מיליליטר / ng, 500 ng / ml Ang2, ו200 nMJAK מונעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת אותם ל 3 בארות של צלחת 6 היטב באמצעות 3 מיליליטר של תמיסה מדוללת תא / כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת לתוך תא חממת humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, 5% O 2. </li></ol> 3. טיפול יומי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיום על מנות התרבות עם N2 בינוני מכילות bFGF, Ang2, Dll4, וJAK מעכב 24 שעות לאחר ציפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף בולוס של bFGF, Dll4, Ang2, ומעכב JAK ביום שלמחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך בתהליך מתחלף זה של שינויים בתקשורת ותוספות גורם עבור סכום כולל של 10-14 ימים. </li></ol> 4. אינדוקציה של בידול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסגת bFGF, Dll4, Ang2, ומעכב JAK מכיל בינוני ולהחליף אותו עם מדיום N2 שאינו מכיל גורמים נוספים בכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את המדיום כל יום שני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים לאחר 10 ימים ולבצע immunocytochemistry. </li></ol> 5. איתור Immunocytochemical <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום ולתקן צלחות תרבית תאים עם 2 מיליליטר של paraformaldehyde 4% עבור 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 2x עם 3 מיליליטר של PBS במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PBS, אז permeabilize ולחסום את התאים על ידי הוספת 2 מיליליטר של PBS המכיל 5% בסרום נורמלי חמור (NDS) ו0.1% טריטון X-100 עבור 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכין את תערובת הנוגדן העיקרית PBS המכילה 5% של NDS. נוגדן אנטי nestin יכול לשמש לזיהוי SCS, תוך Tuj1 (כיתה השלישית β-טובולין), ניתן להשתמש בם נוגדני GFAP, וCNPase יחד לצביעה משולשת של סמני בידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון החסימה ולהוסיף 1.5 מיליליטר של תערובת הנוגדן הראשונית היטב כל אחד. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 90 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הנוגדנים הראשוניים ולשטוף 2x עם 3 מיליליטר של PBS, ו1X עם 3 מיליליטר של PBS המכיל 5% NDS במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Preparדואר הנוגדנים משני בPBS המכילים 5% של NDS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את לשטוף הסופי ולהוסיף 1.5 מיליליטר של פתרון נוגדנים משני היטב כל אחד. דגירה בחושך במשך 40 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון נוגדנים משני ולהוסיף 2 מיליליטר של כתם DAPI מוכן טרי (500 / מיליליטר ng PBS). דגירה במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון DAPI לאחר מכן לשטוף 3x עם 3 מיליליטר של PBS במשך 5 דקות כל אחד. כעת ניתן דמיינו התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol>

<ol><li>Cajal, R. Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCajal%2C+RY+%22Comparative+Study+of+Sensory+Areas+of+the+Human+Cortex%22">Comparative Study of Sensory Areas of the Human Cortex</a>. , Harvard University. (1899).</li>
<li>Altman, J., Das, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoradiographic+and+histological+evidence+of+postnatal+hippocampal+neurogenesis+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats.</a> J. Comp. Neurol. 124, 319-335 (1965).</li>
<li>Kaplan, M. S., Hinds, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+adult+rat%3A+electron+microscopic+analysis+of+light+radioautographs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the adult rat: electron microscopic analysis of light radioautographs.</a> Science. 197, 1092-1094 (1977).</li>
<li>Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+replacement+in+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Neuronal replacement in adulthood.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 457, 143-161 (1985).</li>
<li>Gould, E., Reeves, A. J., Graziano, M. S., Gross, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+neocortex+of+adult+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the neocortex of adult primates.</a> Science. 286, 548-552 (1999).</li>
<li>Kornack, D. R., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuation+of+neurogenesis+in+the+hippocampus+of+the+adult+macaque+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Continuation of neurogenesis in the hippocampus of the adult macaque monkey.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5768-5773 (1999).</li>
<li>Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heterogeneity+of+adult+neural+stem+cells+and+the+emerging+complexity+of+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Symp.+Quant.+Biol%22%5BJournal%5D)">The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 73, 357-365 (2008).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Luskin, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+proliferation+and+migration+of+postnatally+generated+neurons+derived+from+the+forebrain+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Restricted proliferation and migration of postnatally generated neurons derived from the forebrain subventricular zone.</a> Neuron. 11, 173-189 (1993).</li>
<li>Lendahl, U., Zimmerman, L. B., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+stem+cells+express+a+new+class+of+intermediate+filament+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein.</a> Cell. 60, 585-595 (1990).</li>
<li>Androutsellis-Theotokis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+neural+precursors+in+the+adult+brain+rescues+injured+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeting neural precursors in the adult brain rescues injured dopamine neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13570-13575 (2009).</li>
<li>Jin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+dentate+subgranular+zone+and+rostral+subventricular+zone+after+focal+cerebral+ischemia+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in dentate subgranular zone and rostral subventricular zone after focal cerebral ischemia in the rat.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4710-4715 (2001).</li>
<li>Zhang, R. L., Zhang, Z. G., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+stroke+and+neurogenesis+in+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Ischemic stroke and neurogenesis in the subventricular zone.</a> Neuropharmacology. 55, 345-352 (2008).</li>
<li>Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+are+MSCs+therapeutic%3F+New+data%3A+new+insight%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Why are MSCs therapeutic? New data: new insight.</a> J. Pathol. 217, 318-324 (2009).</li>
<li>Goldman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor+cell-based+therapy+of+the+human+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor cell-based therapy of the human central nervous system.</a> Nat. Biotechnol. 23, 862-871 (2005).</li>
<li>Sun, N., Longaker, M. T., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS+cell-based+therapy%3A+considerations+before+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Human iPS cell-based therapy: considerations before clinical applications.</a> Cell Cycle. 9, 880-885 (2010).</li>
<li>Amariglio, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-derived+brain+tumor+following+neural+stem+cell+transplantation+in+an+ataxia+telangiectasia+patient%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient.</a> PLoS Med. 6, e1000029(2009).</li>
<li>Lindvall, O., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+therapeutics+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Cell therapeutics in Parkinson's disease.</a> Neurotherapeutics. 8, 539-548 (2011).</li>
<li>Kittappa, R., Bornstein, S. R., Androutsellis-Theotokis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+eNSCs+in+Neurodegenerative+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mo.l+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The Role of eNSCs in Neurodegenerative Disease.</a> Mo.l Neurobiol. , (2012).</li>
<li>Cattaneo, E., McKay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+and+manipulating+neuronal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identifying and manipulating neuronal stem cells.</a> Trends Neurosci. 14, 338-340 (1991).</li>
<li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strengths+and+limitations+of+the+neurosphere+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Strengths and limitations of the neurosphere culture system.</a> Mol. Neurobiol. 34, 153-161 (2006).</li>
<li>Duarte, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dosage-sensitive+requirement+for+mouse+Dll4+in+artery+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Dosage-sensitive requirement for mouse Dll4 in artery development.</a> Genes Dev. 18, 2474-2478 (2004).</li>
<li>Maisonpierre, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiopoietin-2%2C+a+natural+antagonist+for+Tie2+that+disrupts+in+vivo+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Angiopoietin-2, a natural antagonist for Tie2 that disrupts in vivo angiogenesis.</a> Science. 277, 55-60 (1997).</li>
<li>Androutsellis-Theotokis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signalling+regulates+stem+cell+numbers+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo.</a> Nature. 442, 823-826 (2006).</li>
<li>Alderson, R. F., Alterman, A. L., Barde, Y. A., Lindsay, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor+increases+survival+and+differentiated+functions+of+rat+septal+cholinergic+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor increases survival and differentiated functions of rat septal cholinergic neurons in culture.</a> Neuron. 5, 297-306 (1990).</li>
<li>Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+factors+direct+the+differentiation+of+stem+cells+from+the+fetal+and+adult+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system.</a> Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).</li>
<li>Ourednik, J., Ourednik, V., Lynch, W. P., Schachner, M., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+display+an+inherent+mechanism+for+rescuing+dysfunctional+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells display an inherent mechanism for rescuing dysfunctional neurons.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1103-1110 (2002).</li>
<li>Ryu, J. K., Cho, T., Wang, Y. T., McLarnon, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+cells+attenuate+inflammatory+reactivity+and+neuronal+loss+in+an+animal+model+of+inflamed+AD+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor cells attenuate inflammatory reactivity and neuronal loss in an animal model of inflamed AD brain.</a> J. Neuroinflammation. 6, 39(2009).</li>
<li>Androutsellis-Theotokis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+factors+stimulate+growth+of+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Angiogenic factors stimulate growth of adult neural stem cells.</a> PLoS One. 5, e9414(2010).</li>
<li>Park, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hes3+regulates+cell+number+in+cultures+from+glioblastoma+multiforme+with+stem+cell+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Hes3 regulates cell number in cultures from glioblastoma multiforme with stem cell characteristics.</a> Sci. Rep. 3, 1095-1010 (2013).</li>
<li>Poser, S. W., et al. Ch. 5. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPoser%2C+SW+%22Cancer+Stem+Cells+-+The+Cutting%22">Cancer Stem Cells - The Cutting</a>. Shostak, S. , InTech. Europe, Rijeka, Croatia. 89-110 (2011).</li>
<li>Androutsellis-Theotokis, A., Rueger, M. A., Mkhikian, H., Korb, E., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+controlling+neural+stem+cells+slow+progressive+brain+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Symp.+Quant.+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways controlling neural stem cells slow progressive brain disease.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 73, 403-410 (2008).</li>
</ol>

יש לנו מה למסור.

רבים מהשלבים קריטיים לבידוד מוצלח, הרחבה, והתמיינות של תאי גזע עצביים מהמוח הבוגר משותפים במשותף עם טכניקות תרבות תקן רקמות. המטרה לזכור היא שNSCs מבודד מהמוח המבוגר צריך לשמור על כמה שיותר מin vivo המאפיינים שלהם ככל האפשר (איור 2J). לעתים קרובות איזון בין זהירות ראויה ומהירות מתאימה צריך להיות פגע. אכפת לי עם הבידוד של המוח מהגולגולת יעשה זיהוי של האזור של עניין קל יותר באופן משמעותי. הסרת הרקמה במהירות אפשרית הבאים euthanization בעלי החיים, ושמירה על ק...

הדוגמה המרכזית לנוירוביולוגיה, שנקבעה על ידי התצפיות הבסיסיות של cytoarchitecture המוח שנעשה על ידי רמון קחל י &#39;לפני למעלה ממאה שנים, קבעה כי נוירוגנזה הייתה סבירה לאחר גיל ההתבגרות בהתחשב במורכבות של הרשתות עצביות שנמצאו במערכת העצבים המרכזית 1. למרות עבודתו של אלטמן ב1960s, ומאוחר יותר קפלן, הוכחת כי 3 H-תימידין אפשר היה לציין בתאים בוגרים מצביעים על כך שלמעשה היו נוירונים שנוצרו באזורים שונים של המוח הבוגר, הדוגמה המשיכה להחזיק 2, 3. ראיות המשיכו לעלות עם המחקר של Nottebohm המתאר את השינויים העונתיים במספר הנוירונים במוח של ציפור השיר נוכחי 4. זה לא היה עד 1999, כאשר גולד ואח&#39; עבודה. פורסם על הדור של נוירונים בהיפוקמפוס העליות עם הביצועים של משימות למידה אסוציאטיביות בחולדה, כמו גם התצפיות של הפגנות Kornack וRakicטינג המשיך נוירוגנזה במקוק המבוגר שהקונספט של מוח פחות נוקשה, פלסטיק יותר, הוכר 5, 6. החיפוש אחר המקור הסלולרי לדה נובו הנוירונים שנוצרו אלה להוביל לגילוי של אוכלוסייה נפרדת של תאי גזע (SCS) שמתגוררות באזורים במוח המכונה נישות 7. אזור subventricular והאזור גרעיני תת של ההיפוקמפוס נחשבים לשני האזורים העיקריים נוירוגנית 8,9. תאים מבודדים ממקומות אלה להציג את המאפיין הקלאסי של SCS נגזר עוברי או עוברי, התחדשות עצמית ואת פוטנציאל התמיינות. במקרה של תאי גזע עצביים (NSCs), הם יכולים להיות מובחנים לנוירונים, האסטרוציטים, וoligodendrocytes. בנוסף, SCS אלה להכתים חיוביים לסמני NSC עובריים כגון nestin חלבון נימה ביניים 10. עבודה מאוחרת יותר מדגישה כי SCs לא יכול להיות מוגבלת לאלה לאוו האזורים, והם למעשה מקומיים בכל רחבי המוח כאוכלוסייה במידה רבה שקטה של תאים בחוזקה הקשורים לכלי הדם 11. התצפיות שSCs מגויסים בתגובה לפציעה מציעה את האפשרות של להיות מסוגלים לנצל את התאים האלה למטרות משובי כדי לסייע בהחלמה מההפרעה ושבץ 12, 13 ניווניות. זה לא בניגוד לתפקיד שתאי גזע mesenchymal (MSCs) לשחק בריפוי של רקמות חיבור, אשר נמצא כתאי perivascular שיש לו את הפוטנציאל להפוך לosteoblasts, כונדרוציטים, ותאי שומן 14. עם זאת, לא יכול להיות שנקטפו NSCs באותו אופן כמו MSCs ממח עצם על ידי שאיפה שגרתית וטכניקות צנטריפוגה שיפוע צפיפות ומנוצל לאחר מכן בטיפולים בתאים מבוססים עצמיים. כתוצאה מכך, מקורות אחרים של תאים, כגון השימוש בNSCs העוברי או מבשרים עצביים הנגזר מEMBתאי גזע ryonic נחקרו בהרחבה במחלות בעלי חיים ומודלי פציעה בדרגות שונות של הצלחה 15 של. טכנולוגיות תא גזע pluripotent מושרה ניצול מקורות תא סומטי להציע עוד שדרת פוטנציאל לייצור טיפולים מבוססי תאים שימושיים טיפולית למגוון רחב של יישומים, להתגבר על הזמינות המוגבלת ודאגות אתיות בנוגע לשימוש בתאים עובריים וברקמות עובריות 16. עם זאת, תרגום קליני של ממצאים אלה הוכיח להיות משימה קשה, כפי שמודגם במאבקים של טיפול במצבים נוירולוגיים שונים עם טיפול מבוסס-SC גישות 17,18, כמו גם במסלול מפותל לאישור רגולטורים. כגישה חלופית, הקדמה של טיפולים תרופתיים ספציפיים יכולה לווסת את מספרי המל&quot;ל ולהקל על התאוששות במודלים של המחלה ושבץ 19 פרקינסון. לא משנה מה האסטרטגיה יכולה להיות, הבנה כיצד לתפעל ביעילות את התאים האלהדורש מערכת נגישה במבחנה. תרבויות של NSCs יכולות להתבצע גם כתרבויות כוללת, הידוע גם neurospheres, או כmonolayer 8,20. שני הטכניקות היו בשימוש נרחב, המאפשרות את הקמתה של תנאים מוגדרים תרבות, כלומר שימוש בעוריות Growth Factor (EGF) או בסיסי פיברובלסטים Growth Factor (bFGF) כמקור mitogen, המספקים להרחבה של מבשרי multipotent. בעוד תרבויות neurosphere עשויות להיות מתאימות יותר ללימוד יכולת התפשטות משובט של סוג תא מבודד, המערכת הוכח לייצר אוכלוסייה מעורבת של תאים במהלך התרחבות 21. בנוסף, המבנה הסגור של neurospheres עושה מניפולציה תרופתית של התאים לא מעשית, ואת הפרשנות של ההשפעה עשויים להיות גורמים אלה יכול להיות מבולבל בשל microenvironment הוקם בתוך neurosphere עצמו. תרבויות חד שכבתי, לעומת זאת, יכולות להיותמועסק במסכי תפוקה גבוהה של ספריות מולקולה קטנות, המספק כלי רב עוצמה כדי לחקור את מנגנוני העברת אותות המווסתים את הגדילה והתמיינות SC ופותח את ההזדמנות לגלות תרכובות רומן שמתמקדים אוכלוסיית תא זה. כתוצאה מכך, את היכולת ליצור reproducibly תרבויות של NSCs המבוגר מאזורים השונים של עניין במוח יכולה לשמש במגוון רחב של יישומי מחקר, החל ממחקרים התפתחותיים של מערכת העצבים המרכזית (CNS) לחקר גישות רפואת רגנרטיבית רומן . הפרוטוקול המובא כאן ממחיש כיצד לנתח ולהעריך את פוטנציאל ההתמיינות של SCS CNS מבודד מהמוח המכרסם המבוגר.

<table><tbody><tr><td>צלחות תרבית רקמה 6 בארות</td><td>BD Biosciences</td><td>353934</td><td></td></tr><tr><td>פולי-L-אורניתין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P-3655</td><td> 5 מ"ג/מ"ל תמיסת מלאי שהוכנה במים מזוקקים כפולים (יציבה במשך מספר חודשים ב-20 מעלות; C). ריכוז עבודה 0.5 מ"ג/מ"ל במים (יציב למשך חודש ב-4 מעלות; C). </td></tr><tr><td>פיברונקטין</td><td>R& D Systems</td><td>1030-Fn</td><td>אל תעורר תמיסת מלאי</td></tr><tr><td>מכשיר סינון</td><td>קורנינג מדעי החיים</td><td>430769</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Mediatech</td><td>10-090-CV</td><td>ראה הערה למטה להכנת מדיה N2 מלאה</td></tr><tr><td>Apo-transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-2036</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-0516</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5780</td><td>פתרון מלאי 1 M ב-ddH2O (יציב ב-20 מעלות; C למשך 6 חודשים)</td></tr> <tr><td>נתרן סלניט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S-5261</td><td>500 ומיקרו; תמיסת מלאי M ב-ddH2O (יציב ב-20 &deg; C למשך 6 חודשים)</td></tr><tr><td>פרוגסטרון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P-8783</td><td>100 ומיקרו; תמיסת מלאי M באתנול (יציב ב-20&deg; C למשך 6 חודשים)</td></tr> <tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מי מלח</td><td>Mediatech</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF)</td> <td>R& D Systems</td><td>233-FB</td><td>ריכוז עבודה 20 ng/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>דלתא4 (Dll4)</td><td>מו"פ D Systems</td><td>1389-D4</td><td>ריכוז עבודה&nbsp; 500 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>אנגיופואטין 2 (Ang2)</td><td>R& D Systems</td><td>623-AN</td><td>ריכוז עבודה&nbsp; 500 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>מעכב JAK</td><td>Calbiochem</td><td>420099</td><td>ריכוז עבודה 200 ננומטר&nbsp;</td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A-2058</td><td></td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים של 15 ו-50 מ"ל</td><td>קורנינג מדעי החיים</td><td>430053, 430829</td><td></td></tr><tr><td>פריטים נחוצים אחרים כוללים: מכשירי דיסקציה כלליים, כולל סכין גילוח ומלקחיים, חולדה בוגרת (בת 3-6 חודשים; Sprague-Dawley או Long Evans), תא שיכרון CO2, מכסה זרימה למינרי לתרבית תאים ואינקובטור אינקובטור (לחות, 37 & deg; C, 5% CO<תת>2, 5% O2). הערה: להכנת מדיה N2 מלאה, לבקבוק אחד של DMEM/F-12 (500 מ"ל) יש להוסיף 0.05 גרם אפוטרנספרין, 0.0125 גרם אינסולין (מומס טרי ב-1 מ"ל של 10 מ"מ NaOH), 50 &mu; l של putrescine, 30 &mu; L של נתרן סלניט, 100 &mu; l של מלאי פרוגסטרון, ו-5 מ"ל של תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין.&nbsp; התאם את ה-pH ל-7.2, במידת הצורך. יש לסנן ולעקר ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C עד 3 שבועות ולהגן מפני אור.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> טבלת ריאגנטים אימונופלואורסצנטיים</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>15719</td><td></td></tr><tr><td>סרום חמור רגיל (NDS)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D-9663</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>4,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D-8417</td><td>מלאי 5 מ"ג/מ"ל תמיסה במתנול</td></tr><tr><td colspan="4">טבלת נוגדנים ראשונית</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Chemicon</td><td>MAB353</td><td> גורם דילול: 1:400 מין: עכבר IgG1 </td></tr><tr><td>Hes3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-25393</td><td> גורם דילול: 1:100 מין: ארנב IgG </td></tr><tr><td>Sox2</td><td>R& D Systems</td><td>MAB2018</td><td> גורם דילול: 1:100 מין: עכבר IgG2a </td></tr><tr><td>CNPase</td><td>Chemicon</td><td>MAB326</td><td> גורם דילול: 1:200 מין: עכבר IgG1 </td></tr><tr><td>&beta;-tubulin III (TUJ1)</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1195</td><td> גורם דילול: 1:500 מין: עכבר IgG2a </td></tr><tr><td>חלבון חומצי סיבי גליה (GFAP)</td><td>Dako North America</td><td>Z0334</td><td> גורם דילול 1:500 מינים: ארנב </td></tr><tr><td colspan="4">טבלת נוגדנים משנית</td></tr><tr><td>Alexa&nbsp; &nbsp; 568</td><td>Invitrogen</td><td>A-21124</td><td> גורם דילול: 1:200 מין: עז נגד עכבר IgG1 </td></tr><tr><td>Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21131</td><td> גורם דילול: 1:200 מין: עז נגד עכבר IgG2a </td></tr><tr><td>Cy5</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>59883</td><td> גורם דילול: 1:200 מין: עז נגד ארנב </td></tr></tbody></table>

גידול בתאי גזע עצבי מאזורים קונבנציונליים ולא קונבנציונליים של המוח מכרסם מבוגרים

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

מחקר שנערך לאחרונה מוכיח כי מערכת עצבים מרכזית התחדשות (CNS) וtumorigenesis כרוך אוכלוסיות של תאי גזע (SCS) תושב בתוך המוח הבוגר. עם זאת, מנגנוני תאים בדרך כלל שקטים אלה מעסיקים על מנת להבטיח תפקוד תקין של רשתות עצביות, כמו גם את תפקידם בהחלמה מפציעה וההפחתה של תהליכי ניוון עצבי הם הבינו מעט. תאים אלה מתגוררים באזורים המכונים &quot;נישות&quot; המספקות סביבה תומכת מעורבת אותות ויסות משני כלי הדם ומערכת חיסונית. הבידוד, התחזוקה, והבידול של SCS במערכת העצבים המרכזית בתנאי תרבות מוגדרים שלא לכלול גורמים לא ידועים, הופכים אותם נגיש לטיפול באמצעים תרופתיים או גנטיים, ובכך לספק תובנות על התנהגות in vivo שלהם. כאן אנו מציעים מידע מפורט על השיטות להפקת תרבויות של SCS מערכת העצבים המרכזית מאזורים שונים של המוח המבוגר וגישות להערכת דפוטנציאל ifferentiation לנוירונים, האסטרוציטים, וoligodendrocytes במבחנה. טכניקה זו מניבה אוכלוסיית תאים הומוגנית כתרבות monolayer שיכול להיות דמיינו ללמוד SCs פרט וצאצאיהם. יתר על כן, ניתן להחיל אותו על פני מערכות מודל של בעלי החיים שונות ודגימות קליניות, שהשתמש בעבר כדי לחזות את תגובות משובי במערכת העצבים למבוגרים הפגועה.

זיהוי האזור של עניין שממנו לקצור תאי גזע עצביים הוא הצעד הראשון הקריטי ויגדיר את משך זמן שנדרש כדי לקבל צלחת ומחוברות של תאים. לדוגמא, SVZ הוא אזור נוירוגנית קלאסי ולכן יש חלקם יחסי גבוה יותר של תאי גזע עצביים. עם זאת, הטכניקה שהוצגה כאן ניתן להשתמש באזורים אחרים לא לעתים קרובות מוכרים כבעל פוטנציאל עצבי חזק במהלך הבגרות. למטרות פרוטוקול זה, אנו משמשים השלכנו הקדמי (חלק קדמי). בעוד שחלק מהתאים והפסולת יישבו על ציפוי, הבינוני יהיה בדרך כלל להישאר עכור כתוצאה מכמות החומר תאי שהיא טח...

תאי גזע עצביים שנקטפו מהמוח הבוגר מתרבים מנוצלים ביישומים החל המחקר הבסיסי של התפתחות מערכת עצבים לחקור יישומים קליניים פוטנציאליים ברפואת רגנרטיבית. זה הופך את השליטה קפדנית בתנאי הבידוד וculturing משמשים לגידול תאים אלה קריטיים להישמע תוצאות ניסוי.

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא ליצור תרביות תאי גזע עצביים מאזורים שונים במוח המכרסם הבוגר. זה מושג על ידי קצירת רקמה מאזור מעניין כדי לבחון את הנוכחות והפוטנציאל של תאי גזע עצביים. כשלב שני, עבד את הרקמה לתרחיף תאים לציפוי כתרבית חד-שכבתית.לאחר מכן, השתמש בתנאי תרבית מוגדרים כדי להפיץ באופן סלקטיבי את תאי הגזע העצביים, ולאמת את פוטנציאל ההתחדשות העצמית שלהם. מתקבלות תוצאות במבחנה המראות כי תאי הגזע העצביים הם רב-עוצמתיים בהתבסס על פוטנציאל ההתמיינות שלהם, וכיצד גורמים שונים יכולים להשפיע על התחדשותם העצמית וגורלם. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי מדעי המוח והרפואה הרגנרטיבית, כגון היכן שוכנים תאי גזע עצביים אנדוגניים וכיצד לתפעל אותם.חשבנו לראשונה על הטכניקה הזו כשגילינו מסלולי הפחתת אותות. זה איפשר לנו גם לזהות תאי גזע עצביים אנדוגניים משוערים וגם לווסת את מספרם. לכן יישמנו את הידע הזה כדי לבסס תרביות חזקות של תאים אלה מאזורים שונים במוח.חקרו את תכונותיהם ושאלו את השאלה, האם הם אכן תאי גזע? הכנת צלחת תרבית נכונה היא קריטית יומיים לפני הנתיחה המתוכננת, מצפים את הכלים בפולי L אורניתין ב-75 מיקרוגרם למיליליטר. לאחר מכן דגרו את הצלחות למשך הלילה למחרת, שאפו את הפולי L ornithine ושטפו כל באר פעמיים עם שלושה מיליליטר PBS למשך חמש דקות לכל כביסה.לאחר מכן ניתן לאחסן את הצלחות בחממה עד שלושה שבועות לאחר הסרת הכביסה הסופית, הוסף סיבים נין מדולל אחד עד 250 ב-PBS על ידי פיפטינג עדין. היזהר לא לעורר יתר על המידה את הפתרון. לאחר מכן דגרו את הצלחות למשך הלילה ביום הדיסקציה.שאפו את הפיברונקטין ושטפו את הכלים פעמיים עם PBS. החזירו את הצלחות עם שטיפת ה-PBS הסופית לחממה והמתינו לרקמה המנותקת. ניתן לאחסן צלחות שאינן בשימוש בחממה עד שבוע, אך אל תתנו להן להתייבש ואל תעוררו אותן.ההדגמה של פרוטוקול זה מורחבת לשלוש חולדות בוגרות. ראשית, הקפד לצנן את בלוק חתך המוח על קרח לפני המתת חסד של החולדה הראשונה. לאחר מכן הכינו צינור חרוטי של 15 מיליליטר על קרח עם חמישה מיליליטר של N, שני FGF בינוני ובסיסי.לאחר הוצאת המוח מחולדה שהורדמה, הניחו את המוח בצלחת פטרי בגודל 10 סנטימטרים המכילה PBS קר כקרח. לאחר מכן העבירו את המוח למנה שנייה של PBS ללא שאריות שיער או דם. כעת הכניסו את המוח לתוך בלוק החיתוך המקורר והכניסו סכין גילוח נקי חדש אחד לתוך הבלוק קרוב לאזור העניין שממנו ייווצרו תאים.לאחר מכן, הכנס סכין גילוח נקי שני. שלושה מילימטרים מתרפקים על סכין הגילוח הראשון. הרם בזהירות את הלהבים מהבלוק וקח איתם את החלק המעניין.צף את החלק מהלהב על ידי טבילתו ב-PBS. כעת קצרו את אזור העניין באמצעות מלקחיים מספר חמש. בדוגמה זו, הסעיף מכיל את הקומיסור הקדמי. בטוח.אסוף את החלק לתוך הצינור החרוטי של 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של N שני מדיום עם FGF בסיסי. לאחר מכן צמצם את נפח התמיסה למיליליטר עד שניים. לאחר מכן, במכסה המנוע של תרבית תאים טבלו קצה פיפטה של מיליליטר אחד לתחתית החרוט והשתמשו בכ-20 זרימות של תמיסה כדי לנתק את הרקמה באופן מכני.עצרו את ההצמדה כאשר התמיסה הופכת הומוגנית והניחו לה לשבת מספר דקות כך שרקמות גדולות יותר שאינן קשורות ישקעו לתחתית. כעת העבירו את הסופרנטנט ההומוגני ללא גושי רקמה לתוך צינור חרוטי המכיל 8.5 מיליליטר של תוסף ושני מדיה. מערבבים את תכולת הצינור ומכינים שישה מוכנים.ובכן צלחת. הוציאו את ה-PBS מהבארות ולאחר מכן הוסיפו שלושה מיליליטר של תערובת תאים לבאר לשלוש בארות במהלך 10 עד 14 ימי התרבות הבאים. החלף את המדיום בתוסף N שניים טרי כל יומיים, החל מ-24 שעות לאחר הציפוי כל יומיים, הוסף נפח טרי של תוספים ב-N שתיים.בינוני למדיום שכבר נמצא על התאים. הקפדה על תנאי המדיה חיונית כדי לשמור על התאים לא ממוינים ולאפשר את התרחבותם. לאחר השינוי הבינוני הראשון, נותרה כמות גדולה של פסולת תאית יחד עם כלי הדם.עם זאת, במהלך הימים הבאים, מושבות של תאי גזע מתרבים נבדלים נראו לעין. היו גם אוכלוסיות תאים מוארכות יותר דמויות ציר. אלה אינם תאי גזע עצביים ובסופו של דבר נעקפו עם התפשטות תאי הגזע העצביים.במהלך השבועיים הבאים, תאי הגזע העצביים גדלו בצפיפות רבה יותר עד שהגיעו למפגש. תרביות אלה הוכתמו כחיוביות למספר סמני תאי גזע, כולל SOX 2, hesi ו-nest. בכך מספק ביטחון שאוכלוסיות התאים שנבחרו והורחבו הן אכן תאי גזע עצביים.אישור נוסף הגיע לאחר הוצאת FGF מהמדיום, מה שאיפשר לתאים להתמיין במשך 10 ימים לנוירונים, אסטרוציטים וכל ציטי הצנדרה. כדי לגרום להתמיינות החלף את ה-N השני בתוספת N שתיים, מדיום ותרבית את התאים כך למשך 10 ימים, החלף את ה-N שניים כל 48 שעות לאחר 10 ימים שאפו את המדיום וקבעו את התאים בשני מיליליטר של 4%para פורמלדהיד לבאר למשך 20 דקות.שטפו את הקיבוע עם שלושה מיליליטר PBS פעמיים למשך חמש דקות בכל כביסה. לאחר שאיבת הכביסה השנייה, הוסיפו שני מיליליטר PBS המכילים 5% סרום חמור רגיל ו-0.1% טריטון X 100 כדי לחלחל ולחסום את התאים בזמן שהתאים דוגרים בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. הכן את תערובת הנוגדנים העיקרית ב-PBS המכילה 5% NDS.בדוגמה זו, נוגדן אחד נגד T UJ מיושם לזיהוי נוירונים בעוד שהנוגדנים של GFAP ו-CPA משמשים להדמיית אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים בהתאמה. לאחר 20 דקות יש לשאוב את תמיסת החסימה ולהוסיף לכל אחת 1.5 מיליליטר מתערובת הנוגדנים הראשונית. ובכן לדגור על התאים.הוסיפו את טמפרטורת החדר למשך 90 דקות לאחר 90 דקות, שטפו את התאים בשתי אמבטיות PBS, ולאחר מכן מריחה אחת של PBS המכילה 5% NDS השתמשו בשלושה מיליליטר של תמיסה ואמבטיות של חמש דקות. לאחר הסרת הכביסה הסופית, יש למרוח 1.5 מיליליטר של נוגדנים משניים ב-PBS המכילים 5% NDS על כל אחד. ובכן ואז הכניסו את הצלחת לחושך, הוסיפו טמפרטורת החדר והמתינו 40 דקות.לאחר 40 דקות, החלף את המשני בשני מיליליטר של כתם DPI טרי שהוכן והמתן שלוש דקות. לאחר שאיבת תמיסת ה- DPI, שטפו את התאים שלוש פעמים עם שלושה מיליליטר PBS למשך חמש דקות לכל שטיפה. לאחר מכן התאים מוכנים למיקרוסקופיה בעקבות הליך זה.ניתן לבצע שיטות אחרות כמו כתמים מערביים כדי לבחון שינויים בביטוי החלבון ובזרחון הנובעים מטיפולים תרופתיים או במהלך התמיינות תאים. לאחר פיתוח הטכניקה הזו, היא למעשה סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח לבחון שיטות חדשות שהם יישמו במחקר בכמה מינים שונים, כולל עכברים, חולדות ואפילו פרימטים.

growing-neural-stem-cells-from-conventional-nonconventional-regions

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

זה פרוטוקול וידאו מדגים את שיטת assay neurosphere ליצור ולהרחיב בתאי גזע עצביים מן האזור עכבר מבוגר periventricular, ומספק תובנות טכניות על מנת להבטיח ניתן להשיג תרבויות neurosphere לשחזור.

בידוד הרחבה של תאים בוגרים עכבר גזע עצביים שימוש Assay Neurosphere

סרטון זה מציג שיטה לבידוד תאי גזע/אב עצביים מרקמה פרי-חדרית של חוט השדרה בחולדות בוגרות. הטכניקה כוללת דגירה של מקטעי הרקמה בתמיסה המכילה אנזימים מפרקי חלבון כדי לשבש את המטריצה החוץ תאית ולשחרר את התאים. לאחר מכן, התאים המשוחררים מצופים בתווך המכיל גורמי גדילה ספציפיים המגבירים את התרבות הגזע העצבי / האב ומקדמים צבירה לנוירוספרות תלת ממדיות.

בידוד תאי אב עצביים מאזור חוט השדרה הפריוונטריקולרי של חולדה בוגרת

פרוטוקול זה מתאר שיטת חיתוך מכאנית רומן המאפשרת ההתרחבות של אגרגטים גזע ותאים אב עצביים כדוריים ללא ניתוק להשעית תא בודד. שמירה על קשר תא / תא מאפשרת צמיחה מהירה ויציבה במשך 40 מעברים.

שיטת הרחבת cGMP-ישימה עבור מצרפים של עצבי אנושי ותאים שמקורם בתאי גזע pluripotent או רקמת מוח עוברית

כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לדור בו זמני של תרביות תאים עצביות מבשר, כמו גם monolayers או neurospheres חסיד, מאזור subventricular וgyrus משוננת של עכברים בוגרים בודדים.

עכבר אחד, שתי תרבויות: בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים משני האזורים העצביים של עכברים בודדים

חוט השדרה של יונקים בוגרים מכיל תאי גזע/אב עצביים (NSPCs) שניתן לבודד ולהרחיב בתרבית. פרוטוקול זה מתאר את הקציר, הבידוד, התרבית והמעבר של NSPCs שנוצרו מהאזור הפרי-חדרי של חוט השדרה הבוגר מהחולדה ומתורמי השתלת איברים אנושיים.

בידוד של תאי גזע / עצביים מהאזור סביב חדרי המוח של העכברוש למבוגרים וחוט השדרה אנושי

אנו מדווחים על שיטה מבוססת מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) לבידוד תאי גזע עצביים (NSCs) וצאצאיהם מהאזור התת-חדרי (SVZ) של מוח העכבר הבוגר. מיושם על עכברים טרנסגניים של אינדיקטור מחזור תא פלואורסצנטי (FUCCI), הוא מאפשר לחקור את התקדמות מחזור התא על ידי הדמיה חיה.

מיון תא של תאי גזע ועצביים ממבוגרי עכבר Subventricular האזור וחי-הדמיה של Dynamics תא המחזור שלהם

הקמת מערכות תרבית להרחבת תאי גזע עצביים בוגרים (aNSCs) מאפשרת בדיקה ויישום של תאי גזע עצביים בוגרים לטיפול. האזור התת-קלוסלי (SCZ) הוכר לאחרונה כאזור חדש ליצירת נוירובלסטים בעכברים בוגרים. כאן מתוארות שיטות לבידוד, הרחבה ובידול של SCZ-aNSCs.

בידוד והתרבות של תאי גזע בוגרים עצביים מאזור העכבר Subcallosal

המוח הכלבי הוא מודל ערך שבו ללמוד neurogenesis למבוגרים. מתפרסמים כאן פרוטוקולים לבידוד והרחבת תאים עצביים מבשרים כלבי מבוגרים בהיפוקמפוס מרקמות המוח עיקריות.

בידוד הרחבת מבשרי עצבית בהיפוקמפוס כלב מבוגר

כאן, אנחנו מציגים בטכניקה המיקרוכירורגית הרומן על בידודו של תאי גזע עצביים מ E13 העכבר עובר ganglionic קדושתו.

בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים עובריים בעכבר

שיטה לבידוד תאי גזע עצביים ותאי אב אוליגודנדרוציטים ממוחות של חולדות חיות מוצגת כאן בפירוט ניסיוני. הוא מאפשר אוספים מרובים של תאים אלה מאותם בעלי חיים מבלי לסכן את רווחתם.

שיטת "חליבת המוח" לבידוד תאי גזע עצביים ותאי אב אוליגודנדרוציטים מחולדות חיות

במאמר זה אנו מתארים מערכת נוקלאופקציה שנועדה לשפר את יעילות העברת הגנים בתאי גזע עצביים מורחבים (NSCs) שבודדו מהאזור התת-חדרי של המורין הבוגר. הממצאים מראים כי שיטה זו משפרת באופן משמעותי את ההפרעה הגנטית בתאי גזע גזעיים, עולה על היעילות של פרוטוקולי טרנספקציה מסורתיים ומשפרת את שיעור הישרדות התאים.

בידוד, התרחבות ונוקלאופקציה של תאי גזע עצביים מאזור תת-חדרי מורין בוגרים

למדו לגדול תאי גזע עצביים ממבוגרים מכרסמים באמצעות שיטת תרבית מונולייר. שיטה זו מאפשרת לחקור את פוטנציאל ההתחדשות העצמית וההתמיינות של התאים לשימוש ברפואה רגנרטיבית.

גידול בתאי גזע עצבי מאזורים קונבנציונליים ולא קונבנציונליים של המוח מכרסם מבוגרים

גלה סרטונים נוספים