גידול בתאי גזע עצבי מאזורים קונבנציונליים ולא קונבנציונליים של המוח מכרסם מבוגרים
18 בנובמבר 2013
תאי גזע עצביים שנקטפו מהמוח הבוגר מתרבים מנוצלים ביישומים החל המחקר הבסיסי של התפתחות מערכת עצבים לחקור יישומים קליניים פוטנציאליים ברפואת רגנרטיבית. זה הופך את השליטה קפדנית בתנאי הבידוד וculturing משמשים לגידול תאים אלה קריטיים להישמע תוצאות ניסוי.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא ליצור תרביות תאי גזע עצביים מאזורים שונים במוח המכרסם הבוגר. זה מושג על ידי קצירת רקמה מאזור מעניין כדי לבחון את הנוכחות והפוטנציאל של תאי גזע עצביים. כשלב שני, עבד את הרקמה לתרחיף תאים לציפוי כתרבית חד-שכבתית.
לאחר מכן, השתמש בתנאי תרבית מוגדרים כדי להפיץ באופן סלקטיבי את תאי הגזע העצביים, ולאמת את פוטנציאל ההתחדשות העצמית שלהם. מתקבלות תוצאות במבחנה המראות כי תאי הגזע העצביים הם רב-עוצמתיים בהתבסס על פוטנציאל ההתמיינות שלהם, וכיצד גורמים שונים יכולים להשפיע על התחדשותם העצמית וגורלם. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי מדעי המוח והרפואה הרגנרטיבית, כגון היכן שוכנים תאי גזע עצביים אנדוגניים וכיצד לתפעל אותם.
חשבנו לראשונה על הטכניקה הזו כשגילינו מסלולי הפחתת אותות. זה איפשר לנו גם לזהות תאי גזע עצביים אנדוגניים משוערים וגם לווסת את מספרם. לכן יישמנו את הידע הזה כדי לבסס תרביות חזקות של תאים אלה מאזורים שונים במוח.
חקרו את תכונותיהם ושאלו את השאלה, האם הם אכן תאי גזע? הכנת צלחת תרבית נכונה היא קריטית יומיים לפני הנתיחה המתוכננת, מצפים את הכלים בפולי L אורניתין ב-75 מיקרוגרם למיליליטר. לאחר מכן דגרו את הצלחות למשך הלילה למחרת, שאפו את הפולי L ornithine ושטפו כל באר פעמיים עם שלושה מיליליטר PBS למשך חמש דקות לכל כביסה.
לאחר מכן ניתן לאחסן את הצלחות בחממה עד שלושה שבועות לאחר הסרת הכביסה הסופית, הוסף סיבים נין מדולל אחד עד 250 ב-PBS על ידי פיפטינג עדין. היזהר לא לעורר יתר על המידה את הפתרון. לאחר מכן דגרו את הצלחות למשך הלילה ביום הדיסקציה.
שאפו את הפיברונקטין ושטפו את הכלים פעמיים עם PBS. החזירו את הצלחות עם שטיפת ה-PBS הסופית לחממה והמתינו לרקמה המנותקת. ניתן לאחסן צלחות שאינן בשימוש בחממה עד שבוע, אך אל תתנו להן להתייבש ואל תעוררו אותן.
ההדגמה של פרוטוקול זה מורחבת לשלוש חולדות בוגרות. ראשית, הקפד לצנן את בלוק חתך המוח על קרח לפני המתת חסד של החולדה הראשונה. לאחר מכן הכינו צינור חרוטי של 15 מיליליטר על קרח עם חמישה מיליליטר של N, שני FGF בינוני ובסיסי.
לאחר הוצאת המוח מחולדה שהורדמה, הניחו את המוח בצלחת פטרי בגודל 10 סנטימטרים המכילה PBS קר כקרח. לאחר מכן העבירו את המוח למנה שנייה של PBS ללא שאריות שיער או דם. כעת הכניסו את המוח לתוך בלוק החיתוך המקורר והכניסו סכין גילוח נקי חדש אחד לתוך הבלוק קרוב לאזור העניין שממנו ייווצרו תאים.
לאחר מכן, הכנס סכין גילוח נקי שני. שלושה מילימטרים מתרפקים על סכין הגילוח הראשון. הרם בזהירות את הלהבים מהבלוק וקח איתם את החלק המעניין.
צף את החלק מהלהב על ידי טבילתו ב-PBS. כעת קצרו את אזור העניין באמצעות מלקחיים מספר חמש. בדוגמה זו, הסעיף מכיל את הקומיסור הקדמי. בטוח.
אסוף את החלק לתוך הצינור החרוטי של 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של N שני מדיום עם FGF בסיסי. לאחר מכן צמצם את נפח התמיסה למיליליטר עד שניים. לאחר מכן, במכסה המנוע של תרבית תאים טבלו קצה פיפטה של מיליליטר אחד לתחתית החרוט והשתמשו בכ-20 זרימות של תמיסה כדי לנתק את הרקמה באופן מכני.
עצרו את ההצמדה כאשר התמיסה הופכת הומוגנית והניחו לה לשבת מספר דקות כך שרקמות גדולות יותר שאינן קשורות ישקעו לתחתית. כעת העבירו את הסופרנטנט ההומוגני ללא גושי רקמה לתוך צינור חרוטי המכיל 8.5 מיליליטר של תוסף ושני מדיה. מערבבים את תכולת הצינור ומכינים שישה מוכנים.
ובכן צלחת. הוציאו את ה-PBS מהבארות ולאחר מכן הוסיפו שלושה מיליליטר של תערובת תאים לבאר לשלוש בארות במהלך 10 עד 14 ימי התרבות הבאים. החלף את המדיום בתוסף N שניים טרי כל יומיים, החל מ-24 שעות לאחר הציפוי כל יומיים, הוסף נפח טרי של תוספים ב-N שתיים.
בינוני למדיום שכבר נמצא על התאים. הקפדה על תנאי המדיה חיונית כדי לשמור על התאים לא ממוינים ולאפשר את התרחבותם. לאחר השינוי הבינוני הראשון, נותרה כמות גדולה של פסולת תאית יחד עם כלי הדם.
עם זאת, במהלך הימים הבאים, מושבות של תאי גזע מתרבים נבדלים נראו לעין. היו גם אוכלוסיות תאים מוארכות יותר דמויות ציר. אלה אינם תאי גזע עצביים ובסופו של דבר נעקפו עם התפשטות תאי הגזע העצביים.
במהלך השבועיים הבאים, תאי הגזע העצביים גדלו בצפיפות רבה יותר עד שהגיעו למפגש. תרביות אלה הוכתמו כחיוביות למספר סמני תאי גזע, כולל SOX 2, hesi ו-nest. בכך מספק ביטחון שאוכלוסיות התאים שנבחרו והורחבו הן אכן תאי גזע עצביים.
אישור נוסף הגיע לאחר הוצאת FGF מהמדיום, מה שאיפשר לתאים להתמיין במשך 10 ימים לנוירונים, אסטרוציטים וכל ציטי הצנדרה. כדי לגרום להתמיינות החלף את ה-N השני בתוספת N שתיים, מדיום ותרבית את התאים כך למשך 10 ימים, החלף את ה-N שניים כל 48 שעות לאחר 10 ימים שאפו את המדיום וקבעו את התאים בשני מיליליטר של 4%para פורמלדהיד לבאר למשך 20 דקות.
שטפו את הקיבוע עם שלושה מיליליטר PBS פעמיים למשך חמש דקות בכל כביסה. לאחר שאיבת הכביסה השנייה, הוסיפו שני מיליליטר PBS המכילים 5% סרום חמור רגיל ו-0.1% טריטון X 100 כדי לחלחל ולחסום את התאים בזמן שהתאים דוגרים בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. הכן את תערובת הנוגדנים העיקרית ב-PBS המכילה 5% NDS.
בדוגמה זו, נוגדן אחד נגד T UJ מיושם לזיהוי נוירונים בעוד שהנוגדנים של GFAP ו-CPA משמשים להדמיית אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים בהתאמה. לאחר 20 דקות יש לשאוב את תמיסת החסימה ולהוסיף לכל אחת 1.5 מיליליטר מתערובת הנוגדנים הראשונית. ובכן לדגור על התאים.
הוסיפו את טמפרטורת החדר למשך 90 דקות לאחר 90 דקות, שטפו את התאים בשתי אמבטיות PBS, ולאחר מכן מריחה אחת של PBS המכילה 5% NDS השתמשו בשלושה מיליליטר של תמיסה ואמבטיות של חמש דקות. לאחר הסרת הכביסה הסופית, יש למרוח 1.5 מיליליטר של נוגדנים משניים ב-PBS המכילים 5% NDS על כל אחד. ובכן ואז הכניסו את הצלחת לחושך, הוסיפו טמפרטורת החדר והמתינו 40 דקות.
לאחר 40 דקות, החלף את המשני בשני מיליליטר של כתם DPI טרי שהוכן והמתן שלוש דקות. לאחר שאיבת תמיסת ה- DPI, שטפו את התאים שלוש פעמים עם שלושה מיליליטר PBS למשך חמש דקות לכל שטיפה. לאחר מכן התאים מוכנים למיקרוסקופיה בעקבות הליך זה.
ניתן לבצע שיטות אחרות כמו כתמים מערביים כדי לבחון שינויים בביטוי החלבון ובזרחון הנובעים מטיפולים תרופתיים או במהלך התמיינות תאים. לאחר פיתוח הטכניקה הזו, היא למעשה סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח לבחון שיטות חדשות שהם יישמו במחקר בכמה מינים שונים, כולל עכברים, חולדות ואפילו פרימטים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד ביצירת תרביות של תאי גזע עצביים מאזורים שונים של מוח מכרסם בוגר. התהליך כולל קציר רקמה, יצירת תרחיף תאים ושימוש בתנאי תרבית ספציפיים להגברת תאי גזע עצביים, תוך תיקוף פוטנציאל ההתחדשות העצמית שלהם.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- רפואה רגנרטיבית
רקע
- תאי גזע עצביים הם חיוניים להבנת התפתחות מערכת העצבים.
- יש להם יישומים פוטנציאליים ברפואה רגנרטיבית.
- שליטה על תנאי הבידוד והתרבית חיונית לתוצאות הניסוי.
מטרת המחקר
- ליצירת תרביות של תאי גזע עצביים מאזורי מוח של מכרסם בוגר.
- לבחינת הנוכחות והפוטנציאל של תאי גזע עצביים.
- לחקר גורמים המשפיעים על התחדשות עצמית ודיפרנציאציה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- קצירה של רקמה מאזורים ספציפיים במוח.
- עיבוד הרקמה לתליה של תאים.
- זריעת תאים כשכבה אחת (monolayer).
- שימוש בתנאי תרבית מוגדרים להפקה סלקטיבית.
תוצאות עיקריות
- תוצאות in vitro מאשרות את הרב-פוטנציאליות (multipotency) של תאי גזע עצביים.
- הוכח פוטנציאל דיפרנציאציה של התאים שגודלו בתרבית.
- זוהו גורמים המשפיעים על התחדשות עצמית ועל גורלם של תאי גזע עצביים.
מסקנות
- שיטה זו מסייעת בהבנת המיקום של תאי גזע עצביים אנדוגניים.
- היא מספקת תובנות לגבי האופן שבו ניתן להפעיל תאי גזע עצביים למטרות מחקר.
- הממצאים תורמים לתחומי מדעי העצבים והרפואה הרגנרטיבית.
שאלות נשאלות תדיר
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הקמה של תרביות מוגדרות של תאי גזע עצביים מאזורים שונים במוח מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטיים בתהליך התיקוף של מטרות לטיפולים נוירודגנרטיביים וregenerative. גישה זו תומכת בביטחון חיזוי באמצעות בידוד של אוכלוסיות מולטיפוטנטיות והערכת פוטנציאל הדיפרנציאציה שלהן תחת תנאים מבוקרים. השיטה מקלה על רציפות תרגומית משלב הגילוי להערכה פרה-קלינית, על ידי אספקת מערכת ניתנת לשחזור לבדיקה פרמקולוגית וגנטית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות באמצעות בידוד של תאי גזע עצביים מאזורים מוחיים קונבנציונליים ולא קונבנציונליים, כדי להעריך את ההטרוגניות האזורית בתכונות של תאי הגזע.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות תיקוף של התחדשות עצמית ומולטיפוטנציאליות (multipotency) תוך שימוש בתנאי תרבית מוגדרים ובניתוח סמנים (SOX2, Hes1, nestin).
- ערך ניבוי: דיפרנציאציה לנוירונים, אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים מספקת מדדים פונקציונליים למחקרים של מודולציית מסלולים וקביעת גורל תאי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר תרביות שכבה אחת (monolayer) הומוגניות המתאימות לדימיג בעל תוכן גבוה (high-content imaging) ולהערכה כמותית של שגשוג ודיפרנציאציה של תאי גזע.
- ערך תפעולי: מצע גידול מוגדר (N2 בתוספת bFGF) וציפוי תשתית (poly-L-ornithine, fibronectin) מבטיחים סטנדרטיזציה וחזרתיות בין ניסויים.
- יכולת הרחבה: הפרוטוקול תומך בהתרחבות לאורך 10–14 ימים עם החלפת מצע מדי יום שני, מה שמאפשר ייצור עקבי של אוכלוסיות תאי מקור לא מובחנים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: בדיקות דיפרנציאציה בעקבות נסיגה של גורמי גדילה מדמות תגובות רגנרטיביות ותומכות בהערכה של תרכובות פרו-רגנרטיביות או נוירופרוטקטיביות.
- ערך תפעולי: תיקוף אימונוסייטוכמי (TUJ1, GFAP, CCAP) מספק נקודות סיום סטנדרטיות להערכת מחויבות לשושלת תאים.
- המשכיות תרגומית: ישיים במודלים של מכרסמים וניתן להתאמה לדגימות קליניות אנושיות, ובכך תומך בתיקוף חוצה-מינים של התנהגות תאי גזע.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי אספקת פלטפורמה מאושרת של תאי גזע עצביים לבדיקת מעורבות מטרה ומחקרי מנגנון פעולה לפני אופטימיזציה של מובילים.
- ביולוגיה של הגילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות בנוגע לנישות של תאי גזע אזוריות ותגובתן לרמזים מהמיקרו-סביבה ממערכות כלי הדם והמערכת החיסונית.
- סריקה: תרביות בשכבה אחת תומכות בפיזור והתרחבות הניתנים לשחזור, מה שמקל על הגעת הבדיקה לשלב המוכנות לסריקה של ספריות תרכובות.
- אנליטיקה: תוצרים כמותיים כוללים ביטוי סמנים (אימונוציטוכימיה), יעילותה של דיפרנציאציה וקינטיקה של פרוליפרציה תחת תנאים מוגדרים.
- מחקר תרגומי: פוטנציאל דיפרנציאציה לשלושה שושלות עצביות תומך בהתאמה של סמנים ביולוגיים ובמידול פרה-קליני של יכולת רגנרטיבית.
- שימוש חוזר ארגוני: נהלי דיסוציאציה, פיזור ותחזוקה סטנדרטיים מאפשרים שימוש חוזר בפרויקטים ובמערכות מודל שונות עם מינימום אופטימיזציה מחדש.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי הגדרת תנאי תרבית המבודדים תכונות של תאי גזע עצביים אנדוגניים ומולטיפוטנציאליות.
- ערך תפעולי: דיסוציאציית רקמות סטנדרטית, מצעים מוגדרים והכנת סובסטרט משפרים את השחזוריות ומפחיתים את השונות בין מעבדות.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות go/no-go על ידי אספקת ראיות מוקדמות למעורבות מטרה ו modulate של מסלולים במערכת רלוונטית פיזיולוגית.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של מועמדים רגנרטיביים בהתבסס על השפעות מוכחות על התחדשות עצמית של תאי גזע ובידול לשושלות תאים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בדיסקציה אספטית של רקמות, תרביות של תאי גזע עצביים וטכניקות של אימונופלואורסצנציה.
- תלות במנדף סטרילי לתרביות תאים, אינקובטורים, מיקרוסקופים הפוכים וריאגנטים סטנדרטיים של ביולוגיה מולקולרית (נוגדנים, DAPI, PBS).
- סטנדרטיזציה בין צוותים מחייבת ציפוי עקבי של תשתית (poly-L-ornithine/fibronectin), תוספות למדיום ולוחות זמנים עקביים לדיפרנציאציה.
- הסתגלות למודלים שאינם של מכרסמים עשויה לדרוש אופטימיזציה של אנזימי הדיסוציאציה ושל משך התרבית, בהתבסס על קינטיקת תאי הגזע הספציפית למין.
- המגבלות כוללות זיהום פוטנציאלי מאוכלוסיות שאינן תאי גזע (למשל, תאי כלי דם, תאי גליה) במהלך שלבי התרבית המוקדמים, דבר המופחת על ידי פרוליפרציה סלקטיבית לאורך זמן.
