Name: סידן הדמיה שני פוטונים בעכברים ניווט סביבת מציאות מדומה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-20T22:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: למד הדמיית סידן שני פוטונים כרונית בעכברים הנווטים בסביבת מציאות מדומה. השיטה מאפשרת מדידת פעילות עצבית במהלך התנהגות ומספקת תובנות לתפקוד המוח בתגובה לגירויים חזותיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי פרידריך מיישר המכון למחקר ביו, אגודת מקס פלאנק, והתכנית למדע הגבולות האנושי.

נהלי כל החיה אושרו ובוצעו בהתאם להנחיות של מחלקת הווטרינרית של קנטון באזל. 1. התקנת חומרה ותוכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנת הסריקה מיקרוסקופ שני פוטונים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בליזר אינפרא אדום פעם כמקור תאורה (רוחב פולס &lt;120 fsec). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בראש סריקה המורכב מסורק תהודה 8 או 12 קילוהרץ וגלונומטר הערה סטנדרטית:. זה מאפשר מסגרת חליפין של 40 או 60 הרץ ב750 x 400 פיקסלים. קצב פריימים גבוה הוא קריטי לצמצום תנועה במוח עיוות תמונה מושרה. יתר על כן, תוצאות מהירות תהודה סריקה בתשואת אות גבוהה יותר ומפחית photobleaching 16 וphototoxicity. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש Z-צעד במהירות גבוהה Piezo חשמלי לתמונות ברצף משולבי זמן לרכוש בעומקים מרובים הערה:. זה הוא אופציונלי ומשמש כדי להגדיל את תשואת נתונים על חשבון קצב פריימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בבוקרblanker echanical להקטין את חשיפת לייזר לרקמה. להתאים את רוחב blanker בהתאם למשרעת של סורק התהודה הערה:. בשל אופי סינוסי של נתיב הסריקה בסורק תהודה, קרן הלייזר נעה comparably איטי בנקודות תפנית הסריקה. כדי למנוע נזק לרקמות בנקודות תפנית אלה בם חשיפת לייזר היא הגדולה ביותר, blanker מכאני מוחדר למישור המוקד בין הסריקה ועדשות צינור שעוצרת את קרן הלייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור רכישת נתונים להשתמש digitizer מהירות גבוהה (800 MHz) בשילוב עם מערך שדה-programmable gate (FPGA) הערה:. מסננים גבוהים לעבור FPGA ומכלי אות PMT לפיקסלים. השילוב של גבוה לעבור סינון על FPGA ונמוך לעבור סינון היעיל על תוצאת מגבר PMT במסנן להקה עוברת במרכז בערך סביב שיעור החזרה של הלייזר (80 MHz). קוד ה-FPGA מדגם מסופק כתוספת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנת הליכון נתמכת באוויר המבוססת על העיצוב של Dombeck ועמיתים 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את מחזיק הכדור לקו אספקת אוויר באמצעות צינור אספקת אוויר של לפחות 10 מ&quot;מ קוטר פנימי. מקסם את החתך של מפרצון אספקת אוויר בעל כדור ומניח את הסכום מספיק של צינורות בין האספקה ​​הראשית האוויר ומחזיק כדור הערה:. חתך מוגבר ואורך מוגבר של צינורות אספקת האוויר מפחית את דור רעש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח קצף פוליסטירן כדור (20 ס&quot;מ קוטר) במחזיק כדור ומודפס-3D-אישית מעוצבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הפרדיגמה התנהגותיות דורשת רק קדימה (ואחורה) תנועה, להגביל את תנועתו של הכדור על הציר האופקי (המגרש) על ידי החדרת סיכה (למשל מחט מזרק G 19) בצד של כדור הערה:. בדרך כלל בעלי חיים להסתגל ההתקנה הרבה יותר מהר בפרדיגמה סיבוב מופחת זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנועת מסלול של הכדור באמצעות עכברי מחשב אופטיים אחד או שנייםכדי לזהות תנועה סביב שתיים או כל שלושת צירים, בהתאמה הערה:. עכברי המחשב אידיאלי צריכים לפעול עם דיודה אינפרא אדום להפרעה לפחות עם ההדמיה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנת סביבת מציאות מדומה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את סביבת המציאות מדומה הערה:. סביבת מדגם מבוססת על Panda3D, מנוע משחק זמין באופן חופשי, ניתן כתוספת. האובייקטים של הסביבה הווירטואלית נוצרים באמצעות Wings3D, בונה מודלים 3D קוד פתוח. התכנית לדוגמא קוראת מידע עמדה על כרטיס רכישת נתונים ומתרגמת את זה לתנועה בסביבה הווירטואלית. הקוד גם מבצע את השינוי קוי הכרחי לסביבה שמוקרנת על מסך טבעתי. הבנייה מפורטת של המסך הטבעתי שתוארה במקומות אחרים 14,17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מקרני LED או מסכי מחשב עם תאורה אחורית LED להצגת הסביבה הווירטואלית. לשלב cir gatingCUIT להבהוב מהיר של הנוריות במהלך הדמיה הערה:. בעיה טמונה בהדמיה שני פוטונים במהלך הגירוי חזותי היא דליפת אור שיוצאת ממערכת הגירוי ויזואלי, אשר יכול להיות מופחתת על ידי מיגון האובייקטיבי. עם זאת, דליפת אור ממערכת הגירוי החזותית יכולה לבטל באופן מלא על ידי סנכרון תפוקת האור של המקרן לנקודות התפנית של סורק התהודה (כאשר הנתונים אינם נרכשים), כפי שנעשה עם זירות LED המשמשות לגירוי ויזואלי במהלך הדמיה ב דרוזופילה 18. כתוצאה מכך לסירוגין יעיל במהירות גבוהה של גירוי חזותי ורכישת נתונים (ראה איור 2). תדר ההבהוב (24 קילוהרץ) הוא סדר גודל מעל סף היתוך הבהוב, שמעליו מרצד נתפס כבר לא על ידי בעלי החיים. תרשים המעגל האלקטרוני של שינוי זה למקרן LED מסחרי מוצג באיור 3. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלבוןמעקב il <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש במצלמה מבוססת CMOS וידאו (30 fps) למעקב אחר מצב תלמיד. ודא שהמצלמה אינה מכילה מסנן חוסם אינפרא אדום הערה:. התלמיד נראה בחדות גבוהה במהלך הקלטות בשל אור תועה מליזר עירור שני הפוטונים יציאה דרך העין. עמדת תלמיד וקוטר מופק בזמן אמת באמצעות תוכנה מתוכנתת מותאמת אישית המבוסס על העיצוב של Sakatani ועיסא 19. </li></ol></li></ol> 2. הזרקה של סידן גנטי מחוון והחלון שתל ההזרקה של אינדיקטור סידן 20 וההשתלה של החלון גולגולתי 21 מבוצעת כפי שתואר לעיל עם התוספות הבאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את הווירוס לתוך האזור של עניין באמצעות פיפטה הזרקת זכוכית backfilled עם פתרון וירוס ומחוברת למערכת הזרקה בלחץ. התאם את הלחץ בהתאם לפיפטה הפנימיתקוטר, בדרך כלל כ. 70-140 mbar, להזריק כ 100 NL של פתרון וירוס במהלך 1-2 דקות. יש להשתמש בפולסים הזרקה בנפח נמוך מועברים בתדירות נמוכה (0.05 פולסים שניות ב 2 הרץ) על מנת למנוע הצפה של הנגיף לאורך פיפטה במהלך הזרקת הערה:. על מנת לפקח בנפח ההזרקה, פיפטה יכולה להיות מסומנת בקטנה , אורכים מחולק באופן שווה (למשל 0.5 מ&quot;מ) תחת מיקרוסקופ סטריאו. תזוזה של המניסקוס בין הסימונים לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להעריך את הנפח המוזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הודעה שבועות הזרקה כמה זה צריכה לגרום לבולוס של תאים שכותרתו צפופה בקוטר של כ 500 מיקרומטר. יעילות של ביטוי Geci באזור של עניין תלויה בבחירה של Geci ושילוב אמרגן, כמו גם את כייל וסרוטיפ של AAV רקומביננטי המשמש זיהומיות הערה:. כדוגמא מייצגת, הזרקה של AAV2/1-EF1α-GCaMP5 עם ציצי ויראליאה של 8 x 10 12 GC / מיליליטר לקליפת ראייה העיקרית של תוצאות עכבר בביטוי משביע רצון בכשני שבועות לאחר הזרקה (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בר הראש לא צריך לחסום את שדה הראייה של העכבר, אבל צריך להיות נוקשה מספיק כדי לאפשר הדמיה יציבה במהלך התנהגות. זה בדרך כלל דורש שתי נקודות של התקשרות בכל צד של הבר בראש (ראה איור 1). כדי לצרף את הבר ועד ראש הגולגולת בחוזקה, ודא למקסם ולייבש את השטח של גולגולת חשופה שבו בר הראש יצורף. בנוסף, באמצעות אזמל או מזרק, לשרוט את הגולגולת כדי ליצור חריצים שטחיים ובכך להגדיל את שטח הפנים להדבקה. מכסה את העצם עם דבק רקמות cyanoacrylate לפני הצמדת הסרגל בראש במלט שיניים. </li></ol> 3. הליך ניסיוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבועות עד שלושה שבועות לאחר הזרקת וירוס, בדקו את חלון שתל הגולגולת לבהירות וביטוי תחת עליתתאורת פלואורסצנטי. גבולות ברורים לעין וברורה והחדים של כלי דם שטחיים הם אינדיקציה טובה שחלון השתל מתאים להדמיה (ראה איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד ולהתאים את כוח הלייזר לשווי נמוך 50 mW במדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את זרימת האוויר להליכון הכדורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקיבוע ראש מתחת למיקרוסקופ, להרדים בקצרה את החיה עם isoflurane כדי להפחית את הלחץ. מניחים את החיה לתוך מיכל הרדמה isoflurane ולחכות עד עוצר בעלי החיים מרגשים (כ 10 שניות). הסר את החיה ומייד את הראש לתקן את זה מתחת למיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את המערכת בתצוגה ויזואלית הקרובה ככל האפשר לבעלי החיים עדיין, כדי לאפשר גישה לבעלי החיים. הקשר פחות חזותי בבעלי החיים יש עם הנסיין, פחות לחוץ בבעלי החיים יהיו בשלב הראשוני של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שחלון שתל הגולגולת הוא ללא אבק והלכלוך. נקי עם מיםבמידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל ג&#39;ל אולטרסאונד ברור כמדיום טבילה בין החלון גולגולתי ואובייקטיבי מים טבילה. זה פותר בעיות של השפלה תמונה איטית בשל התאדות מים או דליפה ומקל על הצורך לעלות קונוס על הבר ועד הראש מחזיק מים הערה:. צנטריפוגה ג&#39;ל לפני שימוש כדי להסיר את כל בועות האוויר, ולדאוג שלא ליצור כל אוויר בועות במהלך היישום של ג&#39;ל. בועות אוויר קשה יכולות לפגוע באיכות תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעטוף חתיכת הסרט שחור סביב הבר האובייקטיבי וראש למיגון אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את זירת הסביבה הווירטואלית לעמדתה הסופית ולהתאים את מצלמת וידאו למעקב תלמיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את blanker הלייזר כדי להתאים את המשרעת הסריקה משמשת במהלך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל להקליט נתונים. </li></ol>

<ol><li>Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Miniature+Head-Mounted+Two-Photon+MicroscopeHigh-Resolution+Brain+Imaging+in+Freely+Moving+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Miniature Head-Mounted Two-Photon MicroscopeHigh-Resolution Brain Imaging in Freely Moving Animals.</a> Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).</li>
<li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake%2C+mobile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56, 43-57 (2007).</li>
<li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nat. Neurosci. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li>
<li>Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice-specific+sequences+in+parietal+cortex+during+a+virtual-navigation+decision+task%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task.</a> Nature. 484 (7395), 62-68 (2012).</li>
<li>Huber, D., Gutnisky, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+dynamic+representations+in+the+motor+cortex+during+sensorimotor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning.</a> Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).</li>
<li>Keller, G. B., Bonhoeffer, T., Hübener, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorimotor+mismatch+signals+in+primary+visual+cortex+of+the+behaving+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensorimotor mismatch signals in primary visual cortex of the behaving mouse.</a> Neuron. 74 (5), 809-815 (2012).</li>
<li>Akerboom, J., Chen, T. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+Calcium+Indicator+for+Neural+Activity+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging.</a> J. Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Zhao, Y., Araki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expanded+palette+of+genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators.</a> Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).</li>
<li>Mittmann, W., Wallace, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nat. Neurosci. 14 (8), 1089-1893 (2011).</li>
<li>Katona, G., Szalay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+two-photon+in+vivo+imaging+with+three-dimensional+random-access+scanning+in+large+tissue+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes.</a> Nat. Methods. 9 (2), 201-208 (2012).</li>
<li>Mank, M., Santos, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+calcium+indicator+for+chronic+in+vivo+two-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging.</a> Nat. Methods. 5 (9), 805-811 (2008).</li>
<li>Margolis, D. J., Lütcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+of+cortical+population+activity+imaged+throughout+long-term+sensory+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reorganization of cortical population activity imaged throughout long-term sensory deprivation.</a> Nat. Neurosci. 15 (11), 1539-1546 (2012).</li>
<li>Zariwala, H. A., Borghuis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> J. Neurosci. 32 (9), 3131-3141 (2012).</li>
<li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).</li>
<li>Hölscher, C., Schnee, A., Dahmen, H., Setia, L., Mallot, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rats+are+able+to+navigate+in+virtual+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rats are able to navigate in virtual environments.</a> J. Exp. Biol. 208, 561-5519 (2005).</li>
<li>Borlinghaus, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRT+letter%3A+high+speed+scanning+has+the+potential+to+increase+fluorescence+yield+and+to+reduce+photobleaching%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching).</a> Microsc. Res. Tech. 69 (9), 689-692 (2006).</li>
<li>Reiff, D. F., Plett, J., Mank, M., Griesbeck, O., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+Reality+for+Mice%2C+mousevr.blogspot.com%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Virtual Reality for Mice, mousevr.blogspot.com.</a> Nat. Neurosci. 13, 973-978 (2010).</li>
<li>Sakatani, T., Isa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+spontaneous+saccade-like+rapid+eye+movements+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice.</a> Neurosci. Res. 58, 324-331 (2007).</li>
<li>Golshani, P., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+2-photon+calcium+imaging+in+layer+2%2F3+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo 2-photon calcium imaging in layer 2/3 of mice.</a> J. Vis. Exp. (13), (2008).</li>
<li>Holtmaat, A., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Schmidt-Hieber, C., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+spatial+navigation+in+the+medial+entorhinal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of spatial navigation in the medial entorhinal cortex.</a> Nat. Neurosci. 16 (3), 325-331 (2013).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

המפתח להצלחה של הדמיה שני פוטונים התנהגותיות הוא היציבות של התכשיר בשתי דרכים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך ימים שלאחר השתלת חלון, תגובות דלקתיות של הרקמה יכולות להוביל לשיפור של היווצרות של רקמת פרור וסחוס שיפריע או אפילו למנוע הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך ניסוי המוח צריך להיות יציב מספיק כדי למנוע ממצא תנועה ממשחית את אות הקרינה פעילות הקשורה עצבית. </li></ol><p class="jove_co...

שני פוטונים הדמיה של מדדי סידן (מקודד גנטי כמו 7 GCaMP5 או R-Geco 8, או צבעים סינטטיים כמו OGB או Fluo4) התפתחה כשיטת רבת עוצמה של מדידת פעילות עצבית בהתנהגות עכברי 1-6. זה מאפשר מדידה בו זמנית של פעילותם של מאות תאים ברזולוציה פוטנציאל פעולה כמעט יחידה, עד כ 800 מיקרומטר מתחת לפני השטח המוח 9,10. יתר על כן, שימוש באינדיקטורים סידן מקודד גנטי (GECIs) פעילות עצבית ניתן למדוד באופן כרוני 5,11,12, ובסוגים מוגדרים מבחינה גנטית תא 13. יחד, שיטות אלה מספקים מידה מסוימת של רזולוציה של זמן ומרחב שנפתח שפע של אפשרויות חדשות בחקר החישוב העצבי in vivo. התערבות כירורגית היא הכרחית כדי לחשוף ולתייג את מוח העכבר להדמיה. תאים בדרך כלל הם transfected באמצעות vir adeno הקשורים רקומביננטי<html> לנו מערכת (AAV) למסירת Geci וחלון גולגולתי הוא מושתל על הזריקה כדי לקבל גישה אופטית למוח. בר ראש מחובר אז לגולגולת לקיבוע ראש מתחת למיקרוסקופ שני הפוטונים. התכנון והיישום של צעדים אלה הוא קריטיים כמו רוב הבעיות עם הדמיה ערה נובעים מחוסר היציבות בהכנה. באופן אידיאלי ההליך המתואר כאן צריך לאפשר הדמיה כרונית של עד מספר חודשים לאחר הניתוח. כדי לאפשר התנהגות מודרכת חזותי במהלך ההדמיה שני פוטונים, העכבר הקבוע בראש יושב על הליכון כדורי אוויר נתמך, שבו ניתן להשתמש כדי לנווט בסביבת מציאות מדומה. תנועה של העכבר על ההליכון היא מצמידים את התנועה בסביבה הווירטואלית המוצגת על מסך טבעתי המקיף את 14,15 העכבר. ניתן להקליט משתנים התנהגותיים כגון תנועה, גירוי ויזואלי, ועמדת תלמיד 6. t &quot;&gt; אנו מתארים את ההליכים כרוכים בהדמיה שני פוטונים כרוניות בעכברים לחקור את סביבת מציאות מדומה נקודות מפתח התייחסו הן:. הפחתה של חפצי תנועה, הפחתה של דליפת אור, מקסום מספר התאים נרשמו בו זמנית, ומזעור נזק תמונה. כמו כן אנו מספקים פרטים על הגדרת הליכון נתמך האוויר, מעקב אחר תלמיד, ואת סביבת המציאות מדומה. הנהלים שתוארו כאן יכולים לשמש להדמית אוכלוסיות תאים שכותרתו fluorescently בעכברים קבועים בראש במגוון רחב פוטנציאל של פרדיגמות התנהגותי .

<table><tbody><tr><td>פתקי כיסוי (קוטר = 3-5 מ"מ)</td><td>שתל חלון</td> <td>מנזל</td><td></td></tr><tr><td>InSight DeepSee</td><td>מיקרוסקופ</td><td>לייזר ספקטרה-פיזיקה</td><td></td></tr><tr><td>12 קילו-הרץ סורק תהודה</td><td>קיימברידג' טכנולוגיה</td><td>G1-003-30026</td><td>מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>Galvometer</td><td>קיימברידג' טכנולוגיה</td><td>G6215H</td><td>מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>דיגיטייזר</td><td>National Instruments</td><td>NI 5772</td><td>מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>FPGA</td><td>National Instruments</td><td>PXIe 7965R</td> כרטיס רכישת <td>מיקרוסקופ</td></tr><tr><td></td><td>National Instruments</td><td>PCIe 6363</td><td>מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>מסנן פליטה 525/50</td><td>Semrock</td><td>FF03-525/50-25</td><td>מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>Piezo-electric z-drive</td><td>Physikinstrumente</td><td>P-726.1CD</td> בקר <td>מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>לפיזו-אלקטרי כונן</td><td>Physikinstrumente</td><td>E665 LVPZT</td><td>מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>אובייקטיבי 16X, 0.8NA</td><td>מיקרוסקופ</td><td>ניקון</td><td>CFI75</td></tr><tr><td>מגבר זרם מיקרוסקופ</td><td>Femto</td><td>DHPCA-100</td><td>מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>פוטו</td><td>מיקרוסקופ</td><td>Hamamatsu</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת USB ללא מסנן IR</td><td>הדמיה מקור</td><td>DMK22BUC03</td><td>מעקב אחר</td></tr> <tr><td>אישוניםמטרה 50 mm</td><td>הדמיה מקור</td><td>M5018-MP</td><td>מעקב אישונים</td></tr><tr><td>טבעות מתאם מאקרו</td><td>הדמיה מקור</td><td>LAexSet</td><td>מעקב אחר אישונים</td></tr><tr><td>עכבר מחשב אופטי</td><td>Logitech</td><td>G500</td><td>מעקב תנועה</td></tr><tr><td>כדור קלקר 20 ס"מ</td><td>למשל idee-shop.de</td><td>08797.00.15</td><td>סביבה וירטואלית</td></tr><tr><td>מקרן LED</td><td>סמסונג</td><td>SP-F10M</td><td>וירטואלי סביבה</td></tr><tr><td>כרטיס רכישה</td><td>National Instruments</td><td>NI 6009</td><td>סביבה וירטואלית</td></tr><tr><td>Panda3D game engine</td><td></td><td><a href="http://www.panda3d.org/">www.panda3d.org</a></td><td>סביבה וירטואלית</td></tr><tr><td>ספריית Numpy עבור Python</td><td></td><td><a href="http://www.scipy.org/">www.scipy.org</a></td><td>סביבה וירטואלית</td></tr><tr><td>Scipy ספרייה עבור Python</td><td></td><td><a href="http://www.scipy.org/">www.scipy.org</a></td><td>סביבה וירטואלית</td></tr><tr><td>NI-DAQmx דרייבר</td><td>מכשירים לאומיים</td><td><a href="http://www.ni.com/">www.ni.com</a></td><td>סביבה וירטואלית</td></tr><tr><td>ג'ל אולטרסאונד</td><td>הדמיה</td> <td>Dahlhausen</td><td>5701.0342.10</td></tr></tbody></table>

סידן הדמיה שני פוטונים בעכברים ניווט סביבת מציאות מדומה

Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

בשנים האחרונות, שני פוטונים הדמיה הפכה לכלי רב ערך במדעי המוח, שכן היא מאפשרת למדידה כרונית של הפעילות של תאים מזוהים גנטי במהלך ההתנהגות 1-6. כאן אנו מתארים שיטות לבצע הדמיה שני פוטונים בקליפת מוח עכבר בעוד החיה מנווטת סביבת מציאות מדומה. אנו מתמקדים בהיבטים של הליכי הניסוי, כי הם מפתח להדמיה של בעלי חיים מתנהגים בסביבה וירטואלית מוארת. הבעיות המרכזיות המתעוררות בהתקנה ניסיונית זה שאנחנו כאן כתובת הם: מזעור ממצא תנועה קשורות במוח, צמצום דליפת אור ממערכת ההקרנה של מציאות מדומה, ומזעור נזק לרקמות לייזר מושרה. כמו כן אנו מספקים תוכנת מדגם כדי לשלוט בסביבת המציאות מדומה ולעשות מעקב תלמיד. עם הנהלים והמשאבים האלה זה צריך להיות אפשרי כדי להמיר מיקרוסקופ שני פוטונים קונבנציונליים לשימוש בהתנהגות עכברים.

איכות התמונה בהדמיה סידן שני פוטונים של אוכלוסיות תאים שכותרתו עם Geci תלוי במידה רבה באיכות של חלון השתל גולגולתי. שבועיים לאחר הזרקת וירוס החלון גולגולתי יש לבדוק לבהירות. לא צריך להיות שום רקמות פרור או (איור 1 א) הגלוי לצמיחה מחודשת עצם. יתר על כן, הדפוס של כלי דם שטחיים צריך להישאר ללא שינוי והגבולות של כלי הדם צריכים להיות מוגדרים בצורה חדה. במקביל, יכול להיות גם בדק ביטוי Geci. Boli של תאים שכותרת צריך להיות לעין תחת מיקרוסקופ epifluorescence (איור ...

כאן אנו מתארים את הפרוצדורות כרוכות בהדמיה שני פוטונים של קליפת המוח עכבר בהתנהגות בסביבת מציאות מדומה.

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבצע את ההיבטים העיקריים של הדמיה כרונית של שני פוטונים בעכברים, ולחקור סביבת מציאות מדומה. זה מושג על ידי שינוי מיקרוסקופ של שני פוטונים להדמיה מהירה ויציבה בעכברים מתנהגים. לאחר מכן, מוגדר הליכון נתמך אוויר המסוגל לעקוב אחר תנועה.לאחר מכן מכינים סביבת מציאות מדומה המשתמשת במקרן LED המסונכרן למיקרוסקופ על מנת למזער את דליפת האור. כתוצאה מכך מתקבלות הקלטות תמונה טובות ויציבות עקב הפחתת חפצי התנועה, הפחתת דליפת האור ומזעור קצה נזק הצילום. למרות שניתן להשתמש בשיטה זו למדידת נוירואקטיביות במהלך ניווט בסביבת מציאות מדומה, ניתן להתאים אותה בקלות גם למגוון רחב של פרדיגמות התנהגותיות שונות הדורשות גירוי חזותי.כל ההליכים בבעלי חיים אושרו ובוצעו בהתאם להנחיות המחלקה הווטרינרית של קנטון בזיליקום. שני מיקרוסקופ הפוטונים המשמשים בניסויים אלה מורכב מראש סריקה המורכב מסורק תהודה של שמונה או 12 קילו-הרץ וגלוונומטר סטנדרטי. זה מאפשר קצבי פריימים של 40 או 60 הרץ ב-750 כפול 400 פיקסלים ומפחית עיוות תמונה הנגרם מתנועת המוח, פוטו-הלבנה ופוטוטוקסיות.צעד Z פיזואלקטרי במהירות גבוהה משמש לרכישה רציפה של תמונות שזורות בזמן בעומקים מרובים. מנקה מכני משמש להפחתת חשיפת הלייזר לרקמה בנקודות הסיבוב של נתיב הסריקה, יש לכוונן את המנקה כדי להגדיר את רוחבו. בהתאם למשרעת של סורק התהודה, חבר צינור אספקת אוויר בקוטר פנימי של 10 מילימטר לפחות למחזיק הכדור של ההליכון והנח כמות BLE של צינור בין אספקת האוויר הראשית למחזיק הכדור כדי להפחית את הרעש.הניחו כדור קצף פוליסטירן בקוטר 20 סנטימטרים במחזיק כדור מעוצב בהתאמה אישית ומודפס בתלת מימד. אם הפרדיגמה ההתנהגותית דורשת רק תנועה קדימה ואחורה, הכנס סיכה כגון מחט היפודרמית בגודל 19 בצד הכדור. כדי להגביל את תנועת הכדור בציר האופקי, השתמש בעכבר מחשב אופטי אחד או שניים כדי לעקוב אחר תנועת הכדור סביב שניים או כל שלושת הצירים בהתאמה.כדי להכין את סביבת המציאות המדומה, השתמש במקרני LED או במסכי מחשב עם תאורת LED אחורית לתצוגה. שלב מעגל שער להבהוב מהיר של נוריות הלד במהלך ההדמיה. תדירות ההבהוב של 24 קילו-הרץ היא בסדר גודל מעל סף היתוך ההבהוב, שמעליו ההבהוב כבר לא נתפס על ידי בעל החיים.התאם את תדירות ההבהוב המדויקת ואת מחזור העבודה כדי לסנכרן את תפוקת האור של המקרן לנקודות הסיבוב של סורק התהודה למעקב אחר אישונים, השתמש במצלמת וידאו מבוססת CMOs. ודא שהמצלמה אינה מכילה מסנן חוסם אינפרא אדום. כשבועיים-שלושה לאחר הזרקת מחוון הסידן הגנטי והשתלת חלון גולגולת, השתמש בתאורת אפי פלואורסצנטית כדי לבדוק את הבהירות והביטוי של שתל חלון הגולגולת.גלוי בבירור ומוגדר בחדות. גבולות כלי דם שטחיים הם אינדיקציה טובה לכך ששתל החלון מתאים להדמיה יום עד יומיים לאחר מכן. כדי לבצע את ניסוי שני הפוטונים, מדוד והתאם את עוצמת הלייזר לערך מתחת ל-50 מילי-וואט בדגימה.ואז הפעל את זרימת האוויר להליכון הכדורי. הראש הבא, תקן את החיה על ההליכון הכדורי. בפעמים הראשונות העכבר מקובע בראש.ניתן להקל על תהליך זה על ידי הרדמה קצרה של החיה באיזו פלואור. לאחר שהחיה התרגלה להליך, בדרך כלל ניתן לבצע הרכבה ללא טשטוש. שימו לב שחשוב למזער את הלחץ על בעל החיים במהלך הליך זה.לאחר מכן מקם את מערכת התצוגה החזותית קרוב ככל האפשר לבעל החיים כדי עדיין לאפשר גישה לחיה. ודא ששתל חלון הגולגולת נקי מלכלוך ונקה אותו במים במידת הצורך, מרח ג'ל אולטרסאונד שקוף כמדיום טבילה בין חלון הגולגולת למטרת טבילה במים למיגון אור. עטפו פיסת סרט שחור סביב המטרה ומוט הראש.העבר את זירת הסביבה הווירטואלית למיקומה הסופי והתאם את מצלמת הווידאו למעקב אחר תלמידים. לבסוף, הגדר את מנקה הלייזר כך שיתאים למשרעת הסריקה ששימשה במהלך הניסוי והתחל להקליט נתונים בסיום הניסויים. המתת חסד של בעל החיים בהתאם להנחיות המוסד שלך.איכות התמונה בהדמיית סידן של שני פוטונים של אוכלוסיות תאים המסומנות במדד סידן גנטי תלויה במידה רבה באיכות שתל חלון הגולגולת כפי שמודגם כאן בעת בדיקת חלון הגולגולת לבהירות לאחר הזרקת הנגיף, לא אמורה להיות רקמת גרנולציה או צמיחה מחדש של עצם. יתר על כן, דפוס כלי הדם השטחיים צריך להישאר ללא שינוי ולהגדיר בחדות את גבולות כלי הדם. יחד עם זאת, BOI של תאים מסומנים צריך להיות גלוי בבירור תחת מיקרוסקופ אפי פלואורסצנטי.באופן אידיאלי, ההכנה יציבה מספיק כך שעיוותים של שתי תמונות הפוטונים המושרים על ידי תנועת העכבר אינם נראים בתמונה לאחר רישום המסגרת. ניתן לבטל לחלוטין את דליפת האור ממערכת הגירוי החזותי על ידי תזמון נכון של תפוקת האור של המקרן לנקודות הסיבוב של סורק התהודה. כאשר לא נרכשים נתונים, תדירות ההבהוב של מקור האור צריכה להיות כפולה מתדירות הסריקה.בדוגמה זו, ה-blanker הוסר כדי להמחיש את ההשפעה של דליפת אור המוצגת בקופסאות הכתומות במהלך גירוי חזותי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע כפול בהדמיה, התנהגות עכברים, ניווט בסביבת מציאות מדומה. בנוסף להקמת מערכות ההדמיה והמציאות המדומה כמתואר כאן, המפתח להצלחה בניסויים אלה הוא שליטה בטכניקת השתלת חלון הגולגולת.שתל נקי הוא תנאי הכרחי לתמונות באיכות גבוהה ולהקלטות יציבות.

two-photon-calcium-imaging-mice-navigating-virtual-reality

Research

JoVE Journal

Behavior

התנהגות

כדי להבין את הדינמיקה של הרשת microcircuits ב הניאוקורטקס, חיוני להקליט בו זמנית את הפעילות של מספר גדול של נוירונים. In-vivo שני הפוטונים הדמיה סידן היא השיטה היחידה המאפשרת להקליט את הפעילות העצבית של אוכלוסייה צפופה עם רזולוציה של תא בודד.

In vivo 2-Photon סידן הדמיה ב Layer 2 / 3 של עכברים

מקור: Maruoka, H., et. al. {{}}הדמיה סימולטנית של דינמיקת מיקרוגליה ופעילות עצבית בעכברים ערים. J. Vis. exp. (2022) סרטון זה מציג הליך מיקרוסקופיה דו-פוטוני להדמיית פעילות עצבית ודינמיקה של מיקרוגליה בעכבר ער במהלך גירוי חזותי, תוך הדגשת מעברי סידן ואינטראקציות תאיות.

הדמיה סימולטנית של דינמיקת מיקרוגליה ופעילות עצבית בעכבר ער

מקור: Lee, H. et. al., הדמיית סידן מוצלחת in vivo עם מיקרוסקופ ממוזער המותקן על הראש באמיגדלה של עכבר שמתנהג בחופשיות. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים הדמיית סידן in vivo בעכבר באמצעות מקדם שבירה שיפוע, או עדשת GRIN, ומיקרוסקופ ממוזער. המערך משלב קיבוע ראש בתוך מערכת כלובים ניידת ללא חיכוך, מגרה נוירונים ומעורר זרם יוני סידן. עדשת GRIN לוכדת איתות סידן במוח, ומאפשרת הדמיה בזמן אמת של פעילות עצבית.

הדמיית סידן מיקרואנדוסקופית בזמן אמת בעכבר הנע בחופשיות

מקור: Thapa, R., et. al., הזרקה ויראלית סטריאוטקסית והשתלת עדשות אינדקס שיפוע למוח עמוק  In Vivo הדמיית סידן.  J. Vis. Exp. (2021)הסרטון מדגים הדמיית סידן בזמן אמת באמצעות מיניסקופ בעכבר שעבר התמרה, ומתאם בין פעילות עצבית להתנהגות.

הדמיית סידן בזמן אמת של קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית של עכבר באמצעות מיניסקופ

סרטון זה מציג את הליך הגולגולת המאפשר הדמיה כרונית של נוירונים בקליפת המוח הרטרו-טחולית של העכבר באמצעות מיקרוסקופ פוטונים שני פוטונים in vivo בקו טרנסגני Thy1-GFP. גישה זו משולבת עם הזרקת נגיף הקשור לאדנו המבטא mCherry לתוך ההיפוקמפוס הגבי. טכניקות אלו מאפשרות ניטור ארוך טווח של פלסטיות מבנית תלוית ניסיון ב-RSC.

שני פוטונים סימולטני<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של תשומות Synaptic ויעדי Postsynaptic בקליפת עכבר Retrosplenial

אנו מציגים פרוטוקול לחשוף את גזע המוח של עכבר בוגר מהצד הגחוני. באמצעות עדשת מדד שבירה הדרגתית עם מיקרוסקופ מיניאטורי, ניתן להשתמש בהדמיית סידן כדי לבחון את הפעילות של סומטה עצבית זית נחותה ב- vivo.

אין ויוו הדמיית סידן בעכבר זית נחות

הדמיית סידן in vivo של Miniscope in vivo היא טכניקה רבת עוצמה לחקר דינמיקה עצבית ומיקרו-מעגלים בעכברים המתנהגים בחופשיות. פרוטוקול זה מתאר ביצוע ניתוחי מוח להשגת הדמיית סידן in vivo טובה באמצעות מיניסקופ.

הזרקה נגיפית סטריאוטקסית והשתלת עדשה בעלת אינדקס שיפוע להדמיית סידן עמוקה במוח In Vivo

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול המשלב הזרקת וירוסים הקשורים באדנו עם השתלת חלון גולגולתי לצורך הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים.

הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר יצירת חלון גולגולתי גדול (6 x 3 מ"מ2) באמצעות עטיפת מזון, סיליקון שקוף וזכוכית כיסוי. חלון גולגולתי זה מאפשר ניסויים בהדמיית סידן בשדה רחב ובשני פוטונים באותו עכבר.

אין ויוו הדמיית סידן בשדה רחב ושני פוטונים מעכבר באמצעות חלון גולגולתי גדול

כאן, אנו מציגים הגדרת חומרה ותוכנה פשוטה בקוד פתוח לחקר למידה מרחבית של עכברים באמצעות מציאות מדומה (VR). מערכת זו מציגה מסלול ליניארי וירטואלי לעכבר מרוסן ראש הפועל על גלגל באמצעות רשת של מיקרו-בקרים ומחשב לוח יחיד המריץ חבילת תוכנה גרפית קלה לשימוש של Python.

מערכת מציאות מדומה בקוד פתוח למדידת למידה מרחבית בעכברים מרוסני ראש

פרוטוקול זה מפרט את ההליך לדימות תגובות סידן בקוליקולוס העליון (SC) של עכברים ערים, כולל הדמיה של פעילות נוירון יחיד במיקרוסקופ של שני פוטונים תוך השארת קליפת המוח שלמה בעכברי בר, והדמיית ה-SC כולו במיקרוסקופ רחב שדה בעכברים מוטנטיים בעלי קליפת מוח חלקית.

הדמיית סידן בעכבר קוליקולוס מעולה

למד הדמיית סידן שני פוטונים כרונית בעכברים הנווטים בסביבת מציאות מדומה. השיטה מאפשרת מדידת פעילות עצבית במהלך התנהגות ומספקת תובנות לתפקוד המוח בתגובה לגירויים חזותיים.

סידן הדמיה שני פוטונים בעכברים ניווט סביבת מציאות מדומה

גלה סרטונים נוספים