סידן הדמיה שני פוטונים בעכברים ניווט סביבת מציאות מדומה
20 בפברואר 2014
כאן אנו מתארים את הפרוצדורות כרוכות בהדמיה שני פוטונים של קליפת המוח עכבר בהתנהגות בסביבת מציאות מדומה.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבצע את ההיבטים העיקריים של הדמיה כרונית של שני פוטונים בעכברים, ולחקור סביבת מציאות מדומה. זה מושג על ידי שינוי מיקרוסקופ של שני פוטונים להדמיה מהירה ויציבה בעכברים מתנהגים. לאחר מכן, מוגדר הליכון נתמך אוויר המסוגל לעקוב אחר תנועה.
לאחר מכן מכינים סביבת מציאות מדומה המשתמשת במקרן LED המסונכרן למיקרוסקופ על מנת למזער את דליפת האור. כתוצאה מכך מתקבלות הקלטות תמונה טובות ויציבות עקב הפחתת חפצי התנועה, הפחתת דליפת האור ומזעור קצה נזק הצילום. למרות שניתן להשתמש בשיטה זו למדידת נוירואקטיביות במהלך ניווט בסביבת מציאות מדומה, ניתן להתאים אותה בקלות גם למגוון רחב של פרדיגמות התנהגותיות שונות הדורשות גירוי חזותי.
כל ההליכים בבעלי חיים אושרו ובוצעו בהתאם להנחיות המחלקה הווטרינרית של קנטון בזיליקום. שני מיקרוסקופ הפוטונים המשמשים בניסויים אלה מורכב מראש סריקה המורכב מסורק תהודה של שמונה או 12 קילו-הרץ וגלוונומטר סטנדרטי. זה מאפשר קצבי פריימים של 40 או 60 הרץ ב-750 כפול 400 פיקסלים ומפחית עיוות תמונה הנגרם מתנועת המוח, פוטו-הלבנה ופוטוטוקסיות.
צעד Z פיזואלקטרי במהירות גבוהה משמש לרכישה רציפה של תמונות שזורות בזמן בעומקים מרובים. מנקה מכני משמש להפחתת חשיפת הלייזר לרקמה בנקודות הסיבוב של נתיב הסריקה, יש לכוונן את המנקה כדי להגדיר את רוחבו. בהתאם למשרעת של סורק התהודה, חבר צינור אספקת אוויר בקוטר פנימי של 10 מילימטר לפחות למחזיק הכדור של ההליכון והנח כמות BLE של צינור בין אספקת האוויר הראשית למחזיק הכדור כדי להפחית את הרעש.
הניחו כדור קצף פוליסטירן בקוטר 20 סנטימטרים במחזיק כדור מעוצב בהתאמה אישית ומודפס בתלת מימד. אם הפרדיגמה ההתנהגותית דורשת רק תנועה קדימה ואחורה, הכנס סיכה כגון מחט היפודרמית בגודל 19 בצד הכדור. כדי להגביל את תנועת הכדור בציר האופקי, השתמש בעכבר מחשב אופטי אחד או שניים כדי לעקוב אחר תנועת הכדור סביב שניים או כל שלושת הצירים בהתאמה.
כדי להכין את סביבת המציאות המדומה, השתמש במקרני LED או במסכי מחשב עם תאורת LED אחורית לתצוגה. שלב מעגל שער להבהוב מהיר של נוריות הלד במהלך ההדמיה. תדירות ההבהוב של 24 קילו-הרץ היא בסדר גודל מעל סף היתוך ההבהוב, שמעליו ההבהוב כבר לא נתפס על ידי בעל החיים.
התאם את תדירות ההבהוב המדויקת ואת מחזור העבודה כדי לסנכרן את תפוקת האור של המקרן לנקודות הסיבוב של סורק התהודה למעקב אחר אישונים, השתמש במצלמת וידאו מבוססת CMOs. ודא שהמצלמה אינה מכילה מסנן חוסם אינפרא אדום. כשבועיים-שלושה לאחר הזרקת מחוון הסידן הגנטי והשתלת חלון גולגולת, השתמש בתאורת אפי פלואורסצנטית כדי לבדוק את הבהירות והביטוי של שתל חלון הגולגולת.
גלוי בבירור ומוגדר בחדות. גבולות כלי דם שטחיים הם אינדיקציה טובה לכך ששתל החלון מתאים להדמיה יום עד יומיים לאחר מכן. כדי לבצע את ניסוי שני הפוטונים, מדוד והתאם את עוצמת הלייזר לערך מתחת ל-50 מילי-וואט בדגימה.
ואז הפעל את זרימת האוויר להליכון הכדורי. הראש הבא, תקן את החיה על ההליכון הכדורי. בפעמים הראשונות העכבר מקובע בראש.
ניתן להקל על תהליך זה על ידי הרדמה קצרה של החיה באיזו פלואור. לאחר שהחיה התרגלה להליך, בדרך כלל ניתן לבצע הרכבה ללא טשטוש. שימו לב שחשוב למזער את הלחץ על בעל החיים במהלך הליך זה.
לאחר מכן מקם את מערכת התצוגה החזותית קרוב ככל האפשר לבעל החיים כדי עדיין לאפשר גישה לחיה. ודא ששתל חלון הגולגולת נקי מלכלוך ונקה אותו במים במידת הצורך, מרח ג'ל אולטרסאונד שקוף כמדיום טבילה בין חלון הגולגולת למטרת טבילה במים למיגון אור. עטפו פיסת סרט שחור סביב המטרה ומוט הראש.
העבר את זירת הסביבה הווירטואלית למיקומה הסופי והתאם את מצלמת הווידאו למעקב אחר תלמידים. לבסוף, הגדר את מנקה הלייזר כך שיתאים למשרעת הסריקה ששימשה במהלך הניסוי והתחל להקליט נתונים בסיום הניסויים. המתת חסד של בעל החיים בהתאם להנחיות המוסד שלך.
איכות התמונה בהדמיית סידן של שני פוטונים של אוכלוסיות תאים המסומנות במדד סידן גנטי תלויה במידה רבה באיכות שתל חלון הגולגולת כפי שמודגם כאן בעת בדיקת חלון הגולגולת לבהירות לאחר הזרקת הנגיף, לא אמורה להיות רקמת גרנולציה או צמיחה מחדש של עצם. יתר על כן, דפוס כלי הדם השטחיים צריך להישאר ללא שינוי ולהגדיר בחדות את גבולות כלי הדם. יחד עם זאת, BOI של תאים מסומנים צריך להיות גלוי בבירור תחת מיקרוסקופ אפי פלואורסצנטי.
באופן אידיאלי, ההכנה יציבה מספיק כך שעיוותים של שתי תמונות הפוטונים המושרים על ידי תנועת העכבר אינם נראים בתמונה לאחר רישום המסגרת. ניתן לבטל לחלוטין את דליפת האור ממערכת הגירוי החזותי על ידי תזמון נכון של תפוקת האור של המקרן לנקודות הסיבוב של סורק התהודה. כאשר לא נרכשים נתונים, תדירות ההבהוב של מקור האור צריכה להיות כפולה מתדירות הסריקה.
בדוגמה זו, ה-blanker הוסר כדי להמחיש את ההשפעה של דליפת אור המוצגת בקופסאות הכתומות במהלך גירוי חזותי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע כפול בהדמיה, התנהגות עכברים, ניווט בסביבת מציאות מדומה. בנוסף להקמת מערכות ההדמיה והמציאות המדומה כמתואר כאן, המפתח להצלחה בניסויים אלה הוא שליטה בטכניקת השתלת חלון הגולגולת.
שתל נקי הוא תנאי הכרחי לתמונות באיכות גבוהה ולהקלטות יציבות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר את הפרוטוקולים הניסיוניים לדימות דו-פוטוני כרוני של קליפת המוח בעכבר בזמן שהנבדקים מנווטים בסביבת מציאות מדומה. המתודולוגיה מתמקדת במיזעור ארטיפקטים ובשיפור איכות התמונה במהלך מחקרים התנהגותיים.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- טכניקות דימוי
- מחקרים התנהגותיים
רקע
- דימיון דו-פוטוני כרוני מאפשר תצפית על פעילות עצבית בנבדקים חיים.
- סביבות מציאות מדומה יכולות לספק גירויים מבוקרים לניסויים התנהגותיים.
- צמצום זליגת אור וארטיפקטים של תנועה הוא קריטי להשגת איכות דימיון גבוהה.
- ניתן להחיל שיטות גמישות על פרדיגמות התנהגותיות שונות.
מטרת המחקר
- לבחון פעילות עצבית בעכברים במהלך ניווט בסביבת מציאות מדומה.
- לפתח מערך דימות יציב המאפשר תנועה.
- להעמיק את ההבנה של תפקודי המוח בתגובה לגירויים חזותיים.
שיטות שהשתמשו בהן
- שינוי של מיקרוסקופ דו-פוטוני לצורך דימוי מהיר.
- הקמה של מסוע נתמך אוויר למעקב אחר התניידות.
- הכנה של סביבת מציאות מדומה מסונכרנת באמצעות מקרן LED.
- יישום של טכניקות להפחתת ארטיפקטים של תנועה ודליפת אור.
תוצאות עיקריות
- הושגו הקלטות תמונה יציבות ובאיכות גבוהה.
- הפחתה של ארטיפקטים של תנועה שיפרה את מהימנות מדידות הפעילות העצבית.
- השיטה היא ורסטילית וניתנת להתאמה למגוון מחקרי התנהגות.
- הדגמה מוצלחת של מדידת פעילות עצבית במהלך משימות ניווט.
מסקנות
- מערך הדימות המשופר יעיל לחקר פעילות מוחית בעכברים בעת התנהגות.
- סביבות מציאות מדומה מספקות תובנות בעלות ערך לגבי תגובות עצביות לגירויים.
- ניתן להשתמש בגישה זו במגוון רחב של פרדיגמות ניסוייות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת ניטור כרוני ובנאמנות גבוהה של פעילות עצבית בעכברים בעת התנהגות, ובכך תומכת בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בתהליכי גילוי תרופות במדעי המוח. באמצעות ייצוב של דימוי דו-פוטוני במהלך התניידות, היא משפרת את הביטחון החזוי במחקרי מודולציה של מסלולים. הגישה מגשרת בין ממצאים in vitro למדדים פונקציונליים in vivo, ובכך מחזקת את הרצף התרגומי עבור טיפולים המכוונים למערכת העצבים המרכזית (CNS).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות דינמיקת סידן ספציפית לסוג תא במהלך ניווט מכוון מטרה.
- ערך תפעולי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי קישור פעילות של אוכלוסיות נוירונליות לתוצרי התנהגות מוגדרים בפרדיגמה מבוקרת של VR.
- ערך ניבוי: תומך במיון פורטפוליו על ידי אספקת מדדים נוירופיזיולוגיים כמותיים וניתנים לשחזור של מעורבות המטרה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף עבור סריקת תרכובות בשלבים הבאים, באמצעות קביעת חלונות הדמיה יציבים עם מינימום ארטיפקטים.
- פלט כמותי: מאפשר מדידות של משתנים תלויים מבוססות פלואורסצנציה (ΔF/F) התומכות בניתוח קינטי ובניתוח תגובה למינון.
- יכולת הרחבה: תומך בשימוש חוזר בפלטפורמה על פני פרדיגמות התנהגותיות שונות, הודות לתשתית של מעקב תנועה והקרנת LED מסונכרנת.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מקל על חקר תפקוד לקוי של מעגלים עצביים במודלים הרלוונטיים לאינדיקציות נוירופסיכיאטריות ונוירודגנרטיביות.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין מנגנוני גילוי מוקדמים לוולידציה פרה-קלינית באמצעות קריאות אורך (longitudinal readouts) עקביות של פעילות נוירונלית.
- קידום מותאם סיכונים: מסייע בקבלת החלטות go/no-go על ידי חשיפה השאלה האם מודולציה של המטרה מייצרת את ההשפעות הצפויות ברמת המעגל במהלך התנהגות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף התגליות, החל מבדיקת השערות ועד לאופטימיזציה של תרכובות מובילות (lead optimization), ומספקת נתונים מכניסטיים התורמים לבחירת המטרה ולתיעדוף תרכובות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בהבהרת מסלולים ובתיקוף מטרות על ידי מתן אפשרות למיפוי פעילות ספציפית לתאים במהלך משימות ניווט.
- סריקה: מספק מוכנות של בדיקות ותוצאות כמותיות הניתנות לשחזור, החיוניות להערכה אמינה של תרכובות בתוכניות CNS.
- אנליטיקה: מספק מדידות ΔF/F ומתאמים התנהגותיים מסונכרנים בזמן המאפשרים השוואה סטטיסטית של תנאי ניסוי.
- מחקר טרנסלציונלי: מבטיח רציפות משלב הגילוי לעבודה פרה-קלינית באמצעות דימוי כרוני ויציב של אוכלוסיות נוירונליות המוגדרות גנטית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת דימוי לשימוש חוזר, הניתנת להתאמה לפרדיגמות שונות של גירוי חזותי במספר פרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי במודולציה של המטרה על ידי הפחתת רעשים הנובעים מארטיפקטים של תנועה ודליפת אור.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה באמצעות חסימת לייזר (blanking) מסונכרנת ומעקב אחר האישון.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי הפחתת שיעורי הכישלון בתוכניות CNS בשלבים מאוחרים, באמצעות הפחתת סיכונים מכניסטיים בשלב מוקדם.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרכובות מותאם-סיכון בהתבסס על השפעות תפקודיות של מעגלים עצביים, ולא רק על סמיכות קישור (binding affinity).
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוח להשתלת חלון גולגולתי, ביטוי של אינדיקטורים גנטיים של סידן ובכיול מערכת דו-פוטונית.
- תלוי בסריקה רזוננטית מהירה, בצעדים אנכיים (Z-stepping) פ piezoelectric ובמערכות הקרנת LED עם מעגלי שער (gating circuitry).
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית להכנה כירורגית, אימון התנהגותי ותהליכי עיבוד תמונה.
- חייב להביא בחשבון התאמות ספציפיות למודל בקיבוע הראש, במכניקת מסוף הריצה ובכיסוי שדה הראייה.
- מגבלות מעשיות כוללות את חלון ההיתכנות הכירורגית, יציבות ביטוי האינדיקטור ורגישות לארטפקטים של תנועה שיורית למרות התיקון.
