Functionalization בסיוע מיקרוגל של פולי (אתילן גליקול) ופפטידים על השרף לשימוש בPolymerizations שרשרת וגיבוש Hydrogel

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתפעל פוליאתילן גליקול ופפטידים עם קבוצות אקרילט מת' לפילמור שרשרת וסינתזת הידרוג'ל לאחר מכן. זה מושג על ידי שילוב ראשון של מת' אקריליק אנהידריד וקודמן פונקציונלי של האו"ם בבקבוקון נצנוץ. השלב השני הוא שימוש באנרגיית מיקרוגל כדי לתפעל את היתד או הפפטיד.

לאחר מכן, ה-PEG DM מומס בכלורו מתאן, או שהפפטיד נחתך מהשרף. וכל קבוצות ההגנה על שרשרת הצד מוסרות בקוקטייל על בסיס חומצה. השלב האחרון הוא לזרז את הפפטיד הפונקציונלי PEG DM או מת' אקרילאמיד באתר.

בסופו של דבר, תמ"ג פרוטון או ספקטרומטריית מסה של זמן טיסה מאלדי משמשת להצגת פונקציונליזציה מוצלחת של המאקרו יתד או פפטיד. היי, שמי איימי ואן הוב. אני דוקטורנטית במחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת רוצ'סטר.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו תגובת PEG עם פלואוריד אקרילי מת' הוא שהתגובה מהירה משמעותית וידידותית יותר לסביבה. היי, שמי ברנדון וילסון. אני סטודנט לתואר ראשון בהנדסה כימית באוניברסיטת רוצ'סטר.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביו-חומרים, כגון כיצד ניתן להשתמש בהידרוג'לים המיוצרים באמצעות peg dimethyl כדי לשלוט בהעברת תאים טיפוליים במולקולות. היי, אני דניאל בנואה, פרופסור במחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת רוצ'סטר. ההשלכות של טכניקה זו הן לפיתוח טיפולים למגוון מחלות שכן ניתן להשתמש בתרכובות המסונתזות ליישומי העברת תאים ותרופות.

לפני תחילת הליך זה, טרף ייבש את כלי הזכוכית הנדרשים בתנור למשך שעה כדי למנוע זיהום במים בסירת מי גבינה גדולה. החוצה חמישה גרם יתד במשקל מולקולרי בין 1000 ל-100,000 דלטונים. אם קיים, הסר את חתיכת הפלסטיק מהמכסה של בקבוקון נצנוץ במכסה המנוע הכימי.

יש להוציא 10 עודפים מולאריים של מת' אקריליק אנהידריד לתוך בקבוקון נצנוץ קרוע. לאחר מכן הוסף PEG לבקבוקון. לאחר מכן, סובבו את הפקק על הבקבוקון והכניסו את הבקבוקון למיקרוגל.

הגדר את המיקרוגל לחמש דקות בעוצמה מקסימלית עם כפפות עמידות בחום. הוציאו את הבקבוקון מהמיקרוגל כל 30 שניות. לאחר מכן הדק את המכסה במלואו ומערבל את הדגימה למשך 30 שניות.

שחרר את המכסה לפני החזרת הבקבוקון למיקרוגל. חזור על שלבים אלה עד שהתמיסה תחמם במיקרוגל למשך חמש הדקות המלאות. לאחר הוצאת הבקבוקון מהמיקרוגל, שחרר את המכסה ואפשר ל-PEG DM להתקרר לטמפרטורת החדר.

לאחר מכן ממיסים את ה-PEG DM ב-10 עד 15 מיליליטר של די כלורו מתאן. זרז את ה-PEG DM בעודף של פי 10 מאתר קדם-דתיל למשך 20 דקות. באמצעות משפך באקנר של שבעה סנטימטרים ובקבוק של 500 מיליליטר.

אסוף את ה-PEG DM על ידי סינון ואקום. לאחר מכן, העבירו את ה-PEG DM המסונן לצינור חרוטי של 50 מיליליטר עם מחט גדולה הנוקבת דרך המכסה לאוורור. הנח את הצינור בתא ואקום וייבש את ה-PEG DM למשך הלילה.

לאחר הוצאת הצינור מתא הוואקום, אדום ממיס את ה-PEG DM במשקעי כלורו מתאן DI עם אתר דתיל קר כקרח. כדי להסיר מת' אקרילי אנהידריד לא תגובתי לאחר סינון ואיסוף, יבש את ה-PEG DM בתא ואקום באותו אופן כמו קודם. לניתוח תמ"ג פרוטונים, יש להניח כ-10 מיליגרם של PEG DM בבקבוקון נצנוץ ולהוסיף כמיליליטר אחד של כלורופורם דוטראט.

לאחר המסת הדגימה, העבירו אותה לצינור NMR נקי. לאחר מכן, אסוף את ספקטרום התמ"ג של הפרוטונים והפעל את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 64 סריקות לפחות כדי להשיג רזולוציית נתונים מספקת. לאחר סינתזה של הפפטיד המעניין על ידי סינתזת פאזה מוצקה, אחסן אותו על השרף ב-DMF בארבע מעלות צלזיוס עד שהוא מוכן לשימוש.

לאחר מכן אוספים את שרף הפפטיד באמצעות סינון באמצעות משפך באקנר של שבעה סנטימטרים עם נייר סינון ובקבוק של 250 מיליליטר. הסר את חתיכת הפלסטיק מהמכסה של בקבוקון נצנוץ והעביר את השרף לבקבוקון. בעזרת פיפטה חד פעמית הוסף מספיק מת' אקריליק אנהידריד כדי לכסות את השרף לאחר סיבוב רופף של הפקק על הבקבוקון, הכניסו אותו למיקרוגל והגדירו את הטיימר לשלוש דקות.

בעוצמה מקסימלית לבישת כפפות עמידות בחום, הוציאו את הבקבוקון מהמיקרוגל כל 15 עד 20 שניות. לאחר הידוק מלא של המכסה, מערבל את הדגימה למשך 15 שניות. שחרר את המכסה לפני החזרת הבקבוקון למיקרוגל.

חזור על הפעולות הללו עד שהתמיסה תהיה במיקרוגל למשך שלוש הדקות המלאות. כשמכסה הבקבוקון משוחרר, אפשר לתמיסת הפפטיד להתקרר לטמפרטורת החדר באמצעות כמות קטנה של DMF ומשפך באקנר של שבעה סנטימטרים. עם נייר פילטר ובקבוק 250 מיליליטר.

אוספים את שרף הפפטיד מהבקבוקון לצורך מחשוף והגנה עמוקה. העבירו את שרף הפפטיד לבקבוקון נצנוץ טרי עבור 0.25 מילימול של ארגינין המכיל פפטיד. הוסף 0.25 מיליליטר כל אחד של טרי ISO פרופילן שלושה, שישה דו חמצני, אחד שמונה אוקטן דיול תיול מים נטולי יונים ו-18.0 מיליליטר TFA.

לאחר מכן סובב את תערובת התגובה על מסובב רעידת אדמה במעבדה למשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר. בסיום, זרז את הפפטיד בעודף של פי 10 של אתר אתיל טרום צינון. חלקו את התמיסה באופן שווה בין ארבעה צינורות חרוטיים של 50 מיליליטר, צנטריפוגה את ארבע הדגימות ב-3, 200 גרם למשך 10 דקות כדי לאסוף את הפפטיד לאחר צנטריפוגה, לשפוך מהאתר להשעות מחדש את הפפטיד ב-100 מיליליטר של אתר אתילי טרי המחולק בין שני צינורות חרוטיים של 50 מיליליטר.

חזור על תהליך הצנטריפוגה. Resus משהה את הפפטיד ב-50 מיליליטר של אתר טרי פעמיים בסך הכל ארבע שטיפות אתר לאחר שלב הצנטריפוגה האחרון, מנקה את אתר הפסולת ומייבשת את הפפטיד למשך הלילה בוואקום. כדי להכין את הדגימה לניתוח זמן הטיסה של מלדי, הניחו מיליגרם אחד עד שניים של הפפטיד בצינור איינור של 1.5 מיליליטר והמיסו את הדגימה במיליליטר אחד של ממס מלדי.

לאחר מכן, הכינו תמיסת מטריצה של 10 מיליגרם למיליליטר של אלפא סנו ארבע חומצות קרמיות הידרוקסיות בממס המולטי. שלב את תמיסות הפפטיד והמטריצה ביחס של אחד לאחד, אתר מיקרוליטר אחד של התמיסה המשולבת על שלושה מיקומים נפרדים על לוחית הדגימה של MALDI. יבש את הכתמים בעזרת אקדח חום.

לאחר מכן אתר מחדש וייבש כל דגימה. לבסוף, אסוף את נתוני זמן הטיסה של MALDI ואשר עלייה של 68 גרם לשומה במשקל המולקולרי עקב הוספת קבוצת אקרילאמיד מת' לקצה הקצה של הפפטיד. מוצג כאן ספקטרום ה-NMR של PEG DM ליניארי של שני קילודלטון שמתפקד בשיטה בסיוע מיקרוגל לתגובה זו.

ניתן להשתמש בניתוח תמ"ג של פרוטונים כדי לחשב את אחוז הפונקציונליזציה מהיחס הנצפה לתיאורטי של פרוטוני המתאקרילט הסופיים לפרוטוני ה-PEG המרכזיים. אחוז התפקוד הכולל הוא 91% ו-PEG DM זה מתפקד כראוי לשימוש בסינתזה של הידרוג'ל. עיין בפרוטוקול הטקסט לפרטים על חישוב אחוז הפונקציונליזציה עקב ריבוי פסגות הפרוטונים המתעוררות בניתוח תמ"ג פרוטון של פפטידים פפ

פונקציונליזציה של פפטידים נחקרת ביתר קלות באמצעות ספקטרומטריית מסה של זמן טיסה של מאלדי. זה מודגם כאן כאשר הפפטיד G-K-R-G-D-S-G סונתז ונתון לפונקציונאליזציה של מת' אקרילאמיד, חלק קטן מהפפטיד נחתך להערכת משקל מולקולרי לפני פונקציונליזציה, שהראה את שיא המשקל המולקולרי שנצפה המתרחש ב-676 גרם למול, המשקל המולקולרי הצפוי של הפפטיד, שאר הפפטיד עבר פונקציונליזציה של מת' אקרילאמיד לפני המחשוף לאחר פונקציונליזציה של מת' אקרילאמיד. שיא המשקל המולקולרי הנצפה מתרחש ב-744 גרם למול, המשקל הצפוי של הפפטיד הפונקציונלי של מת' אקרילאמיד.

כדי להדגים את הפונקציונליות של PEG DM ושל פפטידים פונקציונליים של אקרילאמיד מת', יוצרו הידרוג'לים של PEG עם ובלי מת' של 0.5 מילי-מולארי. אקרילאמיד פונקציונלי GK R-G-D-S-G המוצגים כאן הם ניגודיות פאזה מייצגת ותמונות פלואורסצנטיות חיות של MSCs על ג'ל peg בלבד ועל ג'ל peg המכילים את הפפטיד הפונקציונלי של מת'. ה-MSCs לא הצליחו לדבוק בהידרוג'ל peg הפונקציונלי של האו"ם, אך עם הכללת פפטיד הידבקות התא RGD, הם הצליחו להיצמד ולהתפשט על פני ההידרוג'ל.

תמונות המתים החיים אינן מייצגות את הכדאיות של אוכלוסיית ה-MSC הזרועה. במקום זאת, התמונות הפלואורסצנטיות נועדו לתחום בין תאי היצמדות לווריאציות קטנות בטופולוגיית ההידרוג'ל, מה שיכול להיות קשה תחת ניגודיות פאזה בלבד. מעניין שהתאים הלא מפוזרים שנזרעו על ה-PEG רק ג'לים מכתימים חיוביים הן לסידן AM והן ל-AUM Homodimer מה שמצביע על כך שהתאים מתו בזמן ההדמיה.

אחד היתרונות הרבים של הידרוג'ל PEG הוא אופיים המתכוונן מאוד ומשנה את ההרכב הספציפי של היתד. הידרוג'ל מעניק לחוקרים רמה גבוהה של שליטה על תכונות כגון מודול האלסטיות כפי שמודגם כאן. ידוע כי גם המשקל המולקולרי וגם אחוז המשקל של PEG שולטים בגודל רשת ההידרוג'ל, כתוצאה מכך הידרוג'ל, נוקשות וקצב השחרור של תרופות עטופות.

זה הוכח על ידי ייצור הידרוג'לים עם משקל מולקולרי משתנה PEG dm וחקירת מודול ההידרוג'ל וגודל הרשת המתקבלים כפי שמשערים להגדיל את המשקל המולקולרי של ה-peg. Macer גרם לעלייה בגודל רשת ההידרוג'ל ולירידה בנוקשות ההידרוג'ל, גודל רשת ההידרוג'ל וניתן לשלוט בנוקשות הג'ל שנוצרה גם על ידי שינוי המשקל. אחוז ההידרוג'לים של PEG יוצרו במשקל משתנה.

אחוז קשיחות PEG DM והידרוג'ל ליניארי של 10 קילו-דלטון וגודל הרשת נקבעו כפי שמוצג כאן, הגדלת אחוז המשקל של PEG גורמת לירידה משמעותית בגודל הרשת ולעלייה בנוקשות ההידרוג'ל. הידרוג'לים המכילים אלבומין סרום בקר עטוף נוצרו באמצעות peg במשקל מולקולרי משתנה כפי שמוצג כאן. שחרור אלבומין בסרום בקר מתרחש מהר יותר מהידרוג'לים שנוצרו באמצעות PEG DM במשקל מולקולרי גבוה יותר כתוצאה מגודל הרשת הגדול יותר בתוך ההידרוג'ל.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לסנתז שבח PEG DME בשיטה בסיוע מיקרוגל וכיצד להעריך פונקציונליזציה באמצעות תמ"ג פרוטון. לאחר שליטה בהליך זה, ניתן גם להשתמש בפתיחת טבעת של קבוצות מתכלות הידרוליטיות על מנת לענות על שאלות נוספות לגבי האופן שבו פירוק הידרוג'ל משפיע על תפקוד התא. אתה צריך גם להבין היטב כיצד ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לשלב באופן סלקטיבי פונקציות של אקרילאמיד מת' ברצפי הפפטידים של טרמיני הקצה וכיצד להעריך את הפונקציונליזציה הזו באמצעות ספקטרומטריית מסה מרובת זמן טיסה.

תודה שצפית.