מותמרים החדרת טכנולוגיה מוקדמת לניטור התנהגות החרקים טיסה

שלום, אני אלכס דרבר מהמעבדה של ד"ר אלברט בוס. אני מהמחלקה להנדסת חשמל באוניברסיטת North Carolina State. היום נדגים הליך כירורגי חדש להשתלת אלקטרודות ב-manica sex במהלך שלבי הגלגול המוקדמים.

בפרוצדורה זו, הנקראת טכנולוגיית השתלה במטאמורפוזה מוקדמת (Early Metamorphic insertion technology), האלקטרודות המושתלות משולבות ברקמת החרק במהלך שלב המטאמורפוזה של הגולם. יתרון מרכזי של פרוצדורה זו הוא שהיא מביאה לצימוד יציב מבחינה מכנית ואמין מבחינה חשמלית עם הרקמה הנוירו-שרירית, ומאפשרת לחקור את הנוירופיזיולוגיה של התעופה של החרק. בשלב הבוגר, IC Mensa עובר מחזור חיים של מטאמורפוזה הנמשך כ-40 ימים.

מחזור החיים של ה-Mensa מתחיל בשלב הביצה. לאחר שבעה עד 10 ימים, הלרבה תבקיע ותגיע לשלב הלרבה הכוכבית השלישי. קיימים חמישה שלבי לרבה כוכבית בסך הכל, ובכל אחד מהשלבים הללו, הלרבה עוברת תהליכי איסוף אנרגיה וגדילה.

חמישה עד שישה ימים לאחר שלב הזחל החמישי, החרק ייכנס לשלב הגולם המוקדם. במהלך שלב הגולם, מתרחשת דגנרציה נרחבת של הרקמות ולאחריה רגנרציה של רקמות החרק. החרק שוהה בשלב זה 17 עד 19 ימים, כהכנה לבקיעה כפרפר בוגר.

בשלב הגולם המוקדם, לפני הכניסה לשלב הגולם המאוחר, ובמהלך שלב הגולם המאוחר, אנו מחדירים בניתוח אלקטרודה מוליכה חשמלית לחלק הגבי של חזה הגולם. הרקמה מתפתחת סביב האלקטרודות המושתלות ומבטיחה את היצמדותן לגופו של החרק. במהלך מספר ימים, האלקטרודות שהוחדרו לחזה הגולם בולטות כחלק מגופו של החרק בשלב הבוגר הסופי כעש, ובכך מנצלות את הבנייה מחדש של כל מערכת הרקמות של החרק.

במהלך ההתפתחות המטמורפית, האלקטרודות מושתלות לתוך שרירי התעופה העקיפים בחזה. קבוצות שרירים אלו, האחראיות באופן עקיף לתנועת הכנפיים, הן השרירים הדורסליים-בנטרליים והשרירים הדורסליים-לונגיטודינליים. כאן נדגים השתלת אלקטרודה לתוך השרירים הדורסליים-בנטרליים, האחראים באופן עקיף למכת הכנפיים כלפי מעלה.

באמצעות השתלה זו, נבצע הקלטה אלחוטית של אלקטרומיוגרם משרירי הגב והבטן במהלך תנועה. מכיוון שהחרק תלוי על ידי פלטפורמה המוריתה אלקטרומגנטית בתוך זירת LED, המעוררת תנועה. הפרוצדורה לטכנולוגיית השתלה בשלב המטמורפוזה המוקדם מתחילה בבניית לוח מעגל מודפס שישמש כממשק בין האלקטרודות המשתולות לבין מכשור ההקלטה.

אלקטרודות התיל מולחמות על לוח מעגל מודפס, המחובר באמצעות מחבר כבל גמיש ושטוח. כדי להתחיל, מדדו וגזרו פיסת למינציה מצופה נחושת בגודל 0.5 על חמישה סנטימטרים רבועים בעזרת טוש קבוע בעל חוד דק ומספריים. באמצעות אותו טוש קבוע בעל חוד דק, שרטטו שלוש רפידות בגודל 0.1 על חמישה סנטימטרים רבועים כדפוסי מסכת תעשיה.

השתמשו בכלי בעל קו ישר, כגון סרגל, כדי ליצור את הסימונים לאורך כל הגזיר של למינציה הנחושת. ודאו שהסימונים ברורים ואינם חופפים זה לזה. אם קווי הסימון יחפפו, האלקטרודות יסבלו מקצר.

בעת ביצוע החיבור למחבר הכבל השטוח והגמיש, שעלול להפוך את הלוחות לבלתי שמישים, העבירו את גזירת למינציה הנחושת לאזור מאוורר, רצוי למכסה מ hút (fume hood), לצורך ת{:etching} של הסימונים על למינציית הנחושת. היזהרו בעת טיפול בתהליך הת{:etching} של לוח המעגל המודפס, שכן זהו תהליך רעיל. החומר עלול לגרום לגירוי בעור במגע, ובמידה ונבלע או נספג בגוף יגרום לנזק. הדביקו סרט טפלון על קצה אחד של גזירת למינציית הנחושת, כך שיכסה כ-1 סנטימטר לאורך.

בשלב הבא, הצמידו את גזירת למינציה הנחושת לחלק הפנימי של כלי שיעור באמצעות סרט דביק, כך שמחצית מרצועת למינציה הנחושת טבולה בתמיסת התכת. הניחו את כלי השיעור על פלטפורמה מסתובבת למשך 20 דקות. הוציאו את למינציה הנחושת שנחרטה מכלי השיעור והניחו אותה בכלי שיעור מלא במים למשך 10 דקות.

לשטיפת השאריות, מרחו isopropyl alcohol על פיסת נייר ניגוב עדין ונגבו את הסימונים כדי לחשוף את פדי הנחושת שלא נחרטו. הסירו את כל עקבות המרקר הקבוע. חתכו את לוח המעגלים המודפס לריבועים קטנים יותר באורך של כ-1 סנטימטר.

כעת, לאחר שהמעגלים המודפסים עברו תהליך תעשיה (etching), יש להכין את האלקטרודות להצמדה. מומלץ לבצע שלבים אלו בעזרת מיקרוסקופ. חתוך בעזרת להב חד שתי פיסות של חוט פלדת אל חלון מצופה ומבודד, בעל קוטר של 0.11 inch כולל הציפוי ו-0.008 inches ללא ציפוי, באורך של שלושה סנטימטרים כל אחת.

חוטי הפלדה הנירוקה הללו הם האלקטרודות הפעילות שיוחדרו לחזה של חרקים. בעזרת להב תער, הסירו ארבעה עד חמישה מילימטרים מהציפוי הפלסטיסטי מקצותיהם של כל החוטים. לאחר מכן, חתכו.

חתיכה אחת של חוט פלדת אל חלון מבודד באורך 0.7 סנטימטר כדי ליצור הרחבת קצה עבור אלקטרודת ההארקה. הסר בעדינות את הציפוי באמצעות להב תער כפי שבוצע בשלב הקודם, או המס אותו באמצעות חום של מלחים. לאחר מכן, חתוך חתיכה אחת של חוט lititz לאורך של 4.5 סנטימטרים.

ניתן להשתמש גם בחוט סליל עבור הלחמה זו. את פיסת קצה הפלדה הנירוסטה באורך 0.7 סנטימטר שהוכנה קודם לכן, יש לחבר לחוט חיבור ההארקה של ה-lititz. קצה פלדה נירוסטה חשוף צריך להימצא בקצה חיבור ההארקה.

הדביקו את לוח המעגלים החרוט למשטח העבודה להלחמה באמצעות סרט טפלון. הניחו את הסרט על לוח המעגלים כך ששני עד מילימטר אחד של הפדים יישארו חשופים כדי לאפשר הלחמה של האלקטרודות ללוח. הקצוות של הפדים, שהם חופשיים מהסרט, יוכנסו למחבר ה-FCC.

יישרו את שלושת חוטי האלקטרודות באמצעות סרט טפלון, כך שניתן יהיה להלחים קצה אחד מכל חוט לפדים התואמים בלוח האלקטרודות. יש להלחים את שתי האלקטרודות הפעילות לפדים הסמוכים לקצוות הלוח. יש להלחים את אלקטרודות ההארקה למספר הפדים במרכז.

מרחו פלאקס (חומרי הלחמה) מנירוסס סטייל על פדי האלקטרודות כדי להקל על ההלחמה. היזהרו לא לגרום לקצרים בחיבורי הפדים על ידי מריחת כמות גדולה מדי של בדיל. טבלו את האלקטרודות באצטון ובאלכוהול איזופרופיל למשך 10 דקות בכל אחד.

לניקוי שאריות ההלחמה. ניתן למזוג את התמיסות לכלי קיבול או לכוס כימיות נפרדות. כדי לשפר את ביצועי הניקוי, ניתן להניח את האלקטרודות בתוך מקו רחצה אולטרסוני בזמן הטבילה בתמיסות הניקוי. החרקים יהיו פעילים ביותר במהלך המעברים בין היום ללילה.

לפיכך, יש להקים מחזור יום-לילה מלאכותי בתוך תא חרקים באמצעות טיימרים אוטומטיים לשקעי חשמל. אלו צריכים להיות מכוונים כך שידמו מחזור של שבע שעות חשיכה ו-17 שעות אור. יש לבחון מדי יום את manduka sex eye pu eye כדי לקבוע את זמן ההחדרה המתאים.

עיני הבועות מוכנות להחדרה כיום אחד לאחר הכנפיים. השבכת נקודות כהות היא המוצלחת ביותר כאשר היא מבוצעת שבעה עד ארבעה ימים לפני סגירת הגולם. הבועות הכהות יותר בחלק התחתון מוכנות להחדרה כירורגית של האלקטרודות כדי להרדימ את הבועות.

הניחו אותם במקרר בטמפרטורה של 4°C למשך כשיש שש שעות. לאחר מכן, הכינו את סביבת העבודה להחדרה. סביבת העבודה צריכה לכלול isopropyl alcohol, פינצטה חדה ולהבי מחט תת-עורית בכיול 30 gauge.

כאפשרות, ניתן להשתמש בדבק ציאנואקרילט כדי לחזק את קיבוע האלקטרודות; יש לעקר את פינצטת המחטים ואת האלקטרודות על ידי טבילה ב-iso propyl alcohol או ניגוב באמצעותם. הוצא את האישון מהמקרר לאחר שש שעות והעבר אותו למשטח העבודה. קבע את המיקום על החזה הגבי (dorsal thorax) התואם את קבוצת השרירים הרלוונטית.

כאן אנו מתמקדים בשרירים הגביים-בטניים האחראים לתנועת הנפת הכנף כלפי מעלה. בעזרת להב חד או מחט היפודרמית, גרדו בעדינות מלבן ריבועי של 1 על 1 סנטימטר דרך שכבת האקסו-קוטיקולה. בעזרת פינצטה, קלפו לאט חלקים אלו.

השתמשו בפינצטה כדי להסיר שערות כנף מהאזור החשוף של החזה (thorax). ניתן להשתמש בשואב באופן רשות כדי לסייע בתהליך הניקוי. חשוב להסיר כמה שיותר שערות כדי למנוע הפרעה לאלקטרודות המוחדרות.

החדירו לאט את המחט לעומק של כחמישה מילימטרים לתוך המזו-טורקס (mesothorax), במקום שבו הכנפיים מתחברות לטורקס, כדי ליצור שתי נקודות חדירה המכוונות לקבוצת השרירים. זכרו היכן נוצרו החורים, שכן הם עלולים להיות קשים לאיתור אם יאבדו. ייסבו את הגולם על השולחן והשתמשו בפינצטה כדי להנחות את שתי אלקטרודות ההקלטה אל שתי נקודות החדירה, כאפשרות לשיפור העמידות המכנית.

נקו את כל השערות מסביב לאלקטרודות ומריאו בכמות נדיבה דבק ciano accolate מסביב לכל נקודת החדרה בבית החזה (thorax) באמצעות applicator של חוטים. הכינו את הכלוב ל-ELO בעזרת חומר מחוספס ובעל טקסטורה המכסה את הקירות והתקרה, שעליו יוכל החרק לטפס. עם הבקיעה, ניתן להשתמש בקופסאות קרטון מחוררות או בנייר אריזה.

הכינו קיבוע קשיח. השתמשו במקל באורך של כ-six centimeters ובקוטר של two millimeters. החליקו בזהירות את המקל דרך החור שנמצא מתחת לבליטות (pros).

ערבוב באמצעות פלסטיק. ניתן להשתמש במקלון צמר גפן או בחוטי מתכת לשלב זה. קבעו את שני צדי המקל על פני השטח של הכלוב כך שהגולם לא יוכל להתגלגל.

מקמו את הגולם בתוך הכלוב כך שהחזה האמצעי (mesothorax) פונה כלפי מעלה. תנועה מרובה עלולה לגרום לנזק לאלקטרודות, לאובדן הליום או להפוך את ההחדרה לחסרת תועלת. יש להחדיר את אלקטרודת ההארקה לבטן או לחלקים המרוחקים של החזה.

כדי למנוע צימוד אותות, ניתן לבצע את השחלת הדיסין (disin) בשלבים המאוחרים של התפתחות הבריזה או לאחר בקיעת החרק. יש להכין את אתר השחלת אלקטרודת ההארקה בשלב הבריזה, בין אם עבור השחלה בשלב זה ובין אם עבור השחלה בשלב הבוגר. כאן מודגמת השחלת אלקטרודת הארקה בשלב בוגר.

הניחו את העשים במקרר בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך שש שעות. לצורך קיבוע באמצעות טיפול בקור, הכינו את תחנת העבודה להחדרה הכוללת isopropyl alcohol, פינצטה חדה, מחט היפודרמית בקוטר 30 gauge, דבק creol, חתיכת תיל למריחת הדבק, צריבה תרמית (אופציונלי) ומקל שעווה דנטלית (אופציונלי). כפי שנעשה קודם לכן, טבלו את המחט ההיפודרמית ב-iso propyl alcohol לפני המגע עם העש בנקודת החדרה הנמצאת במרחק של כ-1 עד 2 סנטימטרים מאלקטרודות ההקלטה לאורך הבטן האחורית; הכניסו את המחט באיטיות כדי לנקב את הבטן וליצור נקודת חדרה.

המחט לא צריכה לחדור למשך יותר מ-four millimeters. אם נוזל המולימפה (hemo lymph) מופיע בצד ההחדרה, המשמעות היא שהמחט הוכנסה עמוק מדי וסבירות הצלחתו של ההליך פוחתת. בעזרת פינצטה, הכנסו בזהירות את האלקטרודה המקורקת לאתר ההחדרה והפעילו לחץ עד לעומק של three to Four millimeters.

החזיקו את האלקטרודה במקומה והשתמשו בחוט כדי למרוח דבק מסביב לאתר ההחדרה כשלב אופציונלי. כדי לחזק עוד יותר את העמידות המכנית של ההחדרה, השתמשו במכשיר צריבה תרמי ואספו טיפה קטנה של שעווה בגודל שני עד שלושה מילימטרים בקצה. מקמו את הקצה קרוב לאתר ההחדרה והפעילו חום כך שהשעווה תקיף את האלקטרודה ותחזיק אותה בחוזקה במקומה.

לאחר הקירור, יש לאפשר לחרק להתאושש יום אחד מההחדרה לפני ביצוע הניסויים. נדרש לוח מתאם עם מחברי כבל גמיש שטוח כדי לחבר את לוח האלקטרודות שעל החרק ליחידת ראש הבינלאומית של Triangle Biosystems. לוח המתאם משתמש בלוח למינציה של נחושת חרוטה שיש להכין בהתאם לשלבים שהוצגו קודם לכן להכנת לוח האלקטרודות; בתחנת ההלחמה, הלחים מחבר כבל גמיש שטוח לקצה אחד של הלוח שהוכן.

ניתן להלחים מחבר כבל גמיש שטוח (FFC) בעל 10 פינים ללוח, כך ששני זוגות הפינים בקצות המחבר וזוג הפינים המרכזי יהיו במגע עם שלוש פדי הנחושת. לאחר מכן, הלחים שלושה חוטי חיבור בנחית 30 AWG לשלושה פדים. בקצה השני של הלוח, הלחים שלושה מחברי מיני לשלושת הפדים שעל לוח המתאם לצורך קריאות של אוסצילוסקופ, כפי שמתואר.

בשלב הבא, יש למקם שניים מהמחברים בניצב לקצוות הלוח. המחבר המרכזי צריך להיות מוטה מעט כלפי מעלה, הרחק ממישור הלוח, כאשר את הקצה השני של שלושת החוטים הללו מחברים למחבר של שלב הראש (head stage connector), המסופק על ידי Triangle Biosystems International.

יש לקבע את מעגל ההדפסה של שלב הראש בחלקו העליון של מסגרת הריחוף, כדי לסייע באמינות האלקטרודות ולבחון את יחס אות לרעש. ניתן להשיג הקלטות אוסילוסקופ עם חיבור קווי. לפני פריסת מערכת ההקלטה האלחוטית, חבר את האוסילוסקופ למגבר הקלטה נוירונית רב-ערוצי מסוג AC.

הגדירו את פרמטרי המגבר לתדר חיתוך מעביר גבוה של 1 Hz, תדר חיתוך מעביר נמוך של 20 kHz והגברה של 100. חברו כל אחד ממחברי החוטים הנקביים הזעירים בלוח המתאם לערוצי הכניסה של המגבר. הוציאו מהכלוב את החרק עם לוח האלקטרודה המושתל.

כאשר הוא במצב פעיל, ניתן להניח פיסת רקמה מתחת לעש כדי שינוח עליה לפני ביצוע המדידות; באמצעות פינצטה, החלק את לוח האלקטרודות אל תוך קבלת חיבור הכבל הגמיש השטוח בלוח המתאם. הסר את הרקמה מתחת לחרק והבח ביצירת স্পייקים של אלקטרומיוגרמה. בזמן שהחרק מנפנף בכנפיו, לכוד ושמור את הנתונים באוסצילוסקופ.

איור זה מציג את אות פוטנציאל השריר שנרכש באמצעות האוסצילוסקופ מאחד השרירים לפני ובמהלך רקיעת כנפיים. האות עבר עיבוד הכולל הגברה פי מאה, מסנן מעביר גבוה של 1 Hz ומסנן מעביר נמוך של 20 kHz ותקופה שקטה. לא נצפו פוטנציאלים בשריר.

הפוטנציאלים השריריים במהלך נפנופי הכנפיים מתרחשים בתדירות של כ-15 עד 20 hertz. לאחר איסוף ואימות המדידות באוסצילוסקופ, יש לאסוף את אותות ה-EMG האלחוטיים. ניתן לבנות פלטפורמת לביטציה אלקטרומגנטית לצורך הקלטה אלחוטית של אותות EMG במהלך טיסה של Manus sex קשור.

פלטפורמת הריחוף מורכבת ממסגרת שתוכננה לאזן מנגנון קשירה. הריחוף החופשי מאפשר למסגרת ולכן לחרק ya. במהלך בדיקה ללא מגבלת חוטי קשירה, ניתן לבצע אב-טיפוס מהיר של המסגרת באמצעות מכונת מידול בשקיעה מותכת (fused deposition modeling).

מסגרת זו, שבה טעונים מגנטים, מרחפת באמצעות סדרה של אלקטרומגנטים בפלטפורמת הבסיס. פלטפורמה מרחפת זו ממוקמת בתוך זירת ה-LED, שנבנתה באמצעות 60 פאנלים המורכבים ממערך של חמישה על שבעה נוריות LED בודדות. הזירה נשלטת על ידי בקר מיקרו APIC 18 F 45 20, המאפשר סימולציה של סיבוב עם כיוון השעון ונגד כיוון השעון, וכן שליטה במהירות הסיבוב.

הגדירו את מערכת ההקלטה האלחוטית של TBSI. חברו את ראש הבמה (head stage) של TBSI למחבר של לוח המתאם שעל פלטפורמת הריחוף. הוציאו את החרק מהכלוב כאשר הוא פעיל, רצוי בזמן השחר שלו.

באמצעות פינצטה, הכניסו בזהירות את לוח האלקטרודות לקולטן הכבל הגמיש והשטוח שבמסגרת הריחוף, כך שהחרק יהיה תלוי בבמידה יציבה בתוך המערך. הניחו את מוט המגנט ליד מתג המגנט ביחידת הראש כדי להפעיל את שידור הנתונים האלחוטי.

נורה כחולה תידלק ותציין ששלב הראש (head stage) פעיל ומוכן להקלטה. כבה את האורות בחדר כדי להשיג חשיכה מוחלטת ופתח את תוכנת TBSI neuro aware במחשב. ניתן להשתמש במנורה אדומה כדי להוסיף תאורה נוספת לחדר.

בחר את קובץ התצורה המתאים. קובץ התצורה המשמש בהליך זה הוא הגדרת ברירת המחדל W five. לאחר מכן, לחץ על כפתור start deck בפינה השמאלית העליונה של הממשק הראשוני.

כדי להתחיל בצפייה באותות, בחר בלשונית חלון כל הערוצים (all channels) לצורך תצפית על אותות EMG במערכת ההקלטה של ה-TBSI. כדי להבטיח חיבור אלחוטי אמין ותפעול תקין של האלקטרודות, הדלק את כל רכיבי ה-LED של הזירה, את ספק הכוח המיוצב (DC power supply) ואת המיקרו-בקר. איזן באיטיות את פלטפורמת הריחוף בתוך הזירה.

בחרו בלשונית record to binary בפאנל השמאלי של ממשק nor aware. הגדירו את זמן ההקלטה ואת יעד שמירת הקובץ. בחרו בהגדרות הפלט המתאימות כדי לשמור את הנתונים שלכם.

לחצו על כפתור ההפעלה (start) כדי להתחיל סשן הקלטה בתוכנת ההקלטה של TBSI. פעולה זו תשמור את הקובץ שלכם כקובץ .next, שניתן לייבא לתוכנות עיבוד נתונים נפוצות.

עקבו אחר החרק כשהוא עף בכיוון התואם לתנועת ה-LEDs. הפכו את כיוון ה-LEDs ואשרו כי החרק משנה את כיוונו. בצעו זאת מספר הפעמים הרצוי. החץ המוצג מציין את כיוון הסיבוב של תבנית ה-LED.

החץ הופך לצהוב. כאשר החרק משלים סיבוב נגד כיוון השעון, החץ הופך לכחול כאשר החרק משלים סיבוב עם כיוון השעון. הדיבוב המוצג בהפעלת הסרט מהיר ב-50% מהקצב הרגיל.

איור זה מציג את אות פוטנציאל השריר שנרכש באמצעות המכשור האלחוטי משריר אחד לפני ובמהלך נפנוף הכנפיים בתקופת המנוחה. לא נצפו פוטנציאלי שריר. פוטנציאלי השריר במהלך נפנוף הכנפיים מופיעים בתדירות של כ-15 עד 20 hertz.

כאן הצגנו הקלטה בערוץ אחד בלבד. עם זאת, ניתן להשתמש בהקלטה רב-ערוצית שבוצעה במערך זה כדי לצפות בתיאום בין מספר קבוצות שרירים במהלך תמרוני טיסה. הראינו כיצד לבצע השחלה של אלקטרודה בשלב מורפוגנזה מוקדם במין זכר לפני השלב של הפופה.

חשוב לתזמן את ההחדרה בשלב האישון המאוחר, כך שההחדרה לא תהיה מוקדמת או מאוחרת מדי בשלב זה. אחרת, עלולים להיווצר קשיים בהשגת הגדרה אמינה של האלקטרודות. כמו כן, הדגמנו כיצד להרכיב את הרכיבים החשמליים הדרושים לביצוע הקלטה אלחוטית של נתוני EMG משרירי תעופה עקיפים בזמן שהחרק מרחף בזירת ה-LED.

תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.