Name: In vivo electroporation ואחרי הלידה וזמן לשגות הדמיה של neuroblast הגירה בעכבר חריפה פרוסות המוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-25T21:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: למדו לדמיין נוירובלסטים נודדים במוח עכברים לאחר הלידה באמצעות אלקטרופורציה של GFP וצילום time-lapse. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר תנועת תאים וניתוח כמותי של דינמיקת הגירה לאורך הזרם הנודד הקדמי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

טרשת נפוצה וYZ נתמכים על ידי studentships PhD KCL וKCL-סין. MO מומן על ידי מלגת לימודי דוקטורט ביוטכנולוגיה ומחקר מדעי הביולוגיה מועצה. אנו מודים מאסארו Okabe ויוני ichi מיאזאקי לפלסמיד PCX-EGFP ואלן Chedotal ויתנה Ypsilanti לייעוץ רב ערך על electroporation.

הליך זה הנו בהתאם לתקנות בבריטניה המשרד הביתית (חוק נהלי בעלי החיים מדעיים, 1986). מדענים צריכים לעקוב אחר ההנחיות שנקבעו ואושרו על ידי ארגוני בעלי החיים שלהם מוסדיים ולאומיים רגולציה. 1. אחרי הלידה Electroporation 1.1. הכנת זכוכית נימים, ה-DNA הפתרון וelectroporator <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הנימים משכו זכוכית (OD: 1.5 מ&quot;מ, מק&quot;ט: 0.86 מ&quot;מ) להזרקת ה-DNA. (הגדרות אינדיקטיביים לחולץ נימי סאטר P-97 הן: חום 283; משכו 50; Velocity 90; זמן 50). להטביע את חותמו על הנימים המקביל להיקף של כ 2 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המתח של electroporator ל5 פולסים מרובעים, 50 msec / דופק ב100 V, עם 850 מרווחים אלפיות שניים (100V, דופק על 50 אלפיות שני, דופק OFF 850 ​​אלפיות שני, דופק 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל טוהר גבוה (OD 260/280&gt; 1.80) פלסמיד דנ&quot;א ללא רעלן פנימי לריכוז סופי של 1-2 מיקרוגרם / μlעם רעלן פנימי לשחרר חיץ טריס-EDTA או PBS. מומלץ להוסיף 0.1% ירוקים מהירה לפתרון ה-DNA (הצבע צריך להתפשט בחדר כאשר הוא מוזרק בהצלחה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את האלקטרודות מ&quot;מ 5-7, ג&#39;ל האלקטרודה ולחמם את כרית החימום. </li></ol> 1.2. Electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את גור עכבר לאחר לידה יום 2 מכלוב ולהרדים אותו על ידי שאיפת isoflurane (בזרימה ~ 0.6 L / min). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כ 1 דקות, לקבוע את המצב של הרדמה באמצעות תגובת דחק רגל. אם אין תנועה מתרחשת, להמשיך בהזרקה תוך חדרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען מחט נימים עם 1-2 μl של ה-DNA באמצעות צינור aspirator מחובר לנימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מקור אור קר, להחזיק את הראש של הגור בין אגודל ואצבע מורה של היד פחות הדומיננטית שלך. מעט למשוך את העור בחזרה על הראש כדי לעזור לזיהוי של נקודת ההזרקה הנכונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו למשל קו וירטואלי בין העין ולאהוא craniometric מבדה ציון הדרך (איור 1 א). הכנס את מחט נימים כבשליש מאורכו של קו זה ממבדה (כ 1 מ&quot;מ מנקודת אמצע הקו) 15. הכנס את הנימים על 2 מ&quot;מ עמוק, והקפד להימנע מחדירה עמוקה במוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק פלסמיד על ידי נשיפה לאט דרך פה (יכול לשמש גם מזרק מחובר לנימים). במהלך הליך זה, וודא שאצבעותיך אינן הפעלת לחץ רב מדי על המוח, כמו זה יכול למנוע הזרקת פלסמיד מוצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפסיק הזרקה כאשר כמות מינימאלית של פתרון ה-DNA נשארה בנימים. מומלץ להזריק פחות מ 1 μl כדי למנוע עלייה מזיקה בלחץ תוך גולגולתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל שני אלקטרודות עם הג&#39;ל ומניחים אותם בצד החיובי בצד הלטרלי של האונה שבו את ה-DNA שהוזרקה (איור 1 א). לשילוב ה-DNA לתוך SVZ מקורי, אלקטרודות מקום מקורי מעטנקודת הזרקה. משתנה עמדת האלקטרודה יכול להשיג סגוליות אזורית של electroporation באזורים שונים של SVZ 22,25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום העברה שוטפת על ידי לחיצה על דוושת footswitch הדופק. כאשר electroporation יושלם, לבדוק את המתח בתצוגת electroporator (ערכי מתח לא צריכים להיות מתחת 90 ​​V, שכן ערכי מתח נמוך לתאם עם יעילות electroporation עני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחיות מחדש את הגור תחת חמצן בכרית חימום לכמה דקות ולהחזיר אותו לכלוב, להניח אותו מאמו. ודא האם מאחזרת את הגור ומתאחדת זה עם שאר האשפה. לאחר electroporation, להשאיר גורים עם אמם ל4-7 ימים לפני השלב הבא. </li></ol> 2. הכנת תרבויות חריפות המוח פרוס 2.1. הכנה של פתרונות וכלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרונות הבאים נדרשים (אפשר גם להשתמש DMEM גבוה של גלוקוז ללנתח והדמיה17): נתיחה בינונית (500 מיליליטר) התקשורת מאוזנת של הגיי - 500ml גלוקוז 45% - 5 מ&quot;ל סרט בינוני (10 מיליליטר) גלוקוז 45% - 0.110 מיליליטר 1 HEPES M - 0.100 מיליליטר פן / סטרפטוקוקוס - 0.100 מיליליטר FCS - 0.500 מיליליטר B27 - 0.100 מיליליטר גלוטמין - 0.200 מיליליטר נשר בינוני Dulbecco שונה (אדום ללא פנול) - 8.89 מיליליטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחמם בינוני סרט ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח Millicell מוסיף למנת תרבות תחתית כוס 35 מ&quot;מ המכילה 1 מיליליטר של מדיום קולנוע ומקום בחממה humidified על 37 ° C / 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן vibratome אביזרים (מברג, קאמרי, סכיני גילוח, דבק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הכלים לנתיחה: מספריים, מרית קטנה, מלקחיים ישרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הכלים לטיפול בפרוסות: מכחול קטן או inoculating לולאה רכה (גודל: 10 μl), טפטפות פסטר מפלסטיק, תיבת קרח וכמה צלחות פלסטיק 6 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Precool המדיום לנתיחהב2-4 ° C. </li></ol> 2.2. הכנת פרוסות המוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא צלחת 6 סנטימטר עם מדיום לנתיחה precooled ולמקם אותו על קרח (כדי לשמור על פרוסות טריות חתוך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות נקע בצוואר הרחם, להשתמש במספריים כדי לערוף את גור העכבר. הסר את הקרקפת עם אזמל, לחתוך את הגולגולת לאורך תפר אמצע sagittal מOB למוח הקטן ולהסיר בעדינות את דשי הגולגולת באמצעות מלקחיים. ודא שכל המוח חשוף ובזהירות לנתח אותו בעזרת מרית, מטפלת מיוחדת שלא לפגוע ברקמות. הנתיחה צריכה להיעשות בזהירות, אבל באותו הזמן מהר מאוד (פחות מדקה במידת האפשר). נקע בצוואר הרחם הוא השיטה המועדפת שלנו בגלל הרדמה מסוף עם הרדמה סמים / גז יכולה להשפיע על מאפייני הנדידה של neuroblasts והמצב בריא של התרבויות הפרוסה המוח, אשר צריכה להיות צילמו במהירות יחסית לאחר הקרבת בעלי החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hemisect המוח עם רזאו להב (איור 2). השלך חצי כדור uninjected או להשתמש בניסויים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים חתיכה קטנה של סרט על בעל vibratome ולהשתמש בכמות המינימלית הכרחית של דבק לצרף את האונה במוח על גבי זה (איור 2). זה מונע פגיעה של פני השטח בעל בשל יישומי דבק חוזרים ונשנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן לדבק להתייבש במשך כמה שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח בעל במגש vibratome מלא פתרון לנתיחה precooled. כוון את הנורה חוש הריח לכיוון הלהב (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין חיתוך האונה המוח באמצעות הגדרות מתאימות. הפרמטרים הבאים מומלצים: עובי פרוס 300 מיקרומטר; מהירות ~ 3-5; תדירות ~ 9. תדר גבוה ומהירות נמוכה מומלצים כדי למנוע נזק לפרוסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף פרוסות באמצעות מכחול קטן או inoculating לולאה רכה. לשמור רק פרוסות עם OB הגלוי (בדרך כלל 2-3 פרוסות / מוח). בדרך כלל, ca הפרוסה המכילה את רוב RMSn ניתן למצוא ב ~ 300 מיקרומטר מהמשטח התחתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו פרוסות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי עבור אות ה-GFP (לוודא כדי להעיף אותם כדי לבדוק את הקרינה משני הצדדים), ולבחור את אלה המראים הקרינה בהירה לאורך רוב RMS. </li></ol> 2.3. פרוסות מוח Culturing <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במכסת מנוע בתרבית תאים, לחתוך את הזנב השלישי ביותר של פרוסת המוח ולהסיר כל עקבות דבק באמצעות פינצטה ישר קנס או אזמל microdissection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לשאוב פרוסה בעזרת פיפטה פסטר מפלסטיק (לחתוך את הקצה של פיפטה כדי ליצור פתח גדול יותר, זה לא לגרום הניזק לפרוסה) ולמקם אותו במרכזו של Millicell prewarmed להוסיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהצד עם אות הניאון הבהירה ממוקם במגע עם Millicell להכניס (להדמיה עם מיקרוסקופ הפוך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון לנתיחה עודף על גבי להכניס את עם טפטפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר תרבויות פרוסה ללהתיישב בC / 5% CO 2 באינקובטור 37 מעלות במשך שעה לפחות 1 לפני ההדמיה. </li></ol> 3. זמן לשגות הדמיה של הגירת neuroblast <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפחות 2 שעות לפני ההדמיה, להפעיל את מערכת פרקין אלמר UltraViewVoX ספינינג confocal הדיסק, מיקרוסקופ ניקון Ti-E ההפוך, האמאמטסו C10600-10B (ORCA-R2) מקוררת מצלמת CCD דיגיטלית, ומערכת חימום (Solent המדעית) נקבעה על הקבוע טמפרטורה של 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את המודול רכישת תוכנת Volocity ולחץ על כפתור &quot;דהינו&quot; ובחר את הלייזר (ים) להדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך 2 שעות של הכנת פרוסה מוח, למקם את צלחת תחתית זכוכית המכילה פרוסת המוח בחדר ההדמיה על הבמה מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אובייקטיבי Nikon CFI Super תכנית פלואוריד ELWD 20X/0.45 תחת אור הניאון המתאים כדי לבחור ולהתמקד באזור של הפרוסה שיהיה צילם (למשל חלק יורד הראשון של RMS רק לאחר הזריקה, או אלבוw האזור של RMS, או רק אחרי המרפק לפני neuroblasts להיכנס OB). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הזמן לשגות הדמיה עם הפעולות הבאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במיקרוסקופ, לחץ על כפתור L100 כדי לאפשר סריקת לייזר של המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בVolocity, פתח UltraView לייזר מחלף על ידי בחירה בלייזר המתאים (למשל לייזר ננומטר 488 לGFP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את זמן החשיפה (בדרך כלל בין 100-500 האלפיות שני) ואת עוצמת הלייזר (בדרך כלל 20-30%) בהתאם לעוצמת אות הניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הרווח דיגיטלי תמונה כדי לשפר את ההדמיה נייד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את מרווח Z-מחסנית לתמונה בתוך פרוסת המוח (בדרך כלל מעל 100-120 מרווח מיקרומטר). בחר מרווח עם מספר מתאים של תאים מבודדים, כדי למנוע אפשרי חופף ככל האפשר (זה יקל על ניתוח מעקב לאחר מכן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את המרווח בין כל תמונת Z-מחסנית (בדרך כלל 2-4 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר int הזמןerval בין כל לכידת Z-מחסנית (למשל 3 דקות) ומשך ההדמיה הכולל (לדוגמא 3 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על האייקון של &quot;השמור&quot; כדי לשמור את השינויים בפרמטרי ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על לחצן ההקלטה כדי להתחיל הדמיה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה חלופית של דגימות בקרה וניסוי (למשל רכב / טיפול תרופתי או פלסמידים שונים electroporated) לאורך כל אותו היום. </li></ol> 4. ניתוח הגירת neuroblast <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במודול Volocity Quantitation, פתח את הספרייה הרצויה שנוצרה לאחר שסיים את ניסוי הזמן לשגות. בחר &quot;פוקוס מורחב&quot; מהתיבה השמאלית העליונה (איור 4 א, ​​שלב 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הלשונית &quot;מדידות&quot; כדי להציג את חלון המדידה (איור 4 א, ​​שלב 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשימת המשימות גלויה בפינה השמאלית התחתונה של המסך. גרור &quot;מסלול&quot; (הווה תחת &quot;שונים&quot; כותרת בתחתיתהרשימה) על השטח הנ&quot;ל. פעולה זו תנחה את הפתיחה של חלון חדש בשם &quot;מסלול&quot; בחלקו השמאלי העליון של המסך (איור 4 א, ​​שלב 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;נקודות&quot; מכרטיסיית &quot;הקלט&quot; בחלון המסלול (איור 4 א, ​​שלב 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כלי הנקודות (איור 4 א, ​​שלב 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל מעקב neuroblast נודד על ידי לחיצה עם העכבר על האזור של גוף התא המרכזי ולשמור על מעקב אחר תנועת התא עד לנקודת הזמן האחרונה של הזמן לשגות הוא הגיע (לדוגמה מספר נקודה 61 לסרט באורך שעות 3) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבל נתונים לבחור &quot;הפוך פריט מדידה&quot; מתפריט המדידות (איור 4 ב &#39;, על השלבים 6-7). חלון יופיע במרכז המסך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלון זה, בחר &quot;פריט חדש מדידה הנקרא:&quot; והקלד שם (איור 4C, שלב 8). זכור לבחור באפשרות &quot;כל הנקודות הזמן&quot; לפני יחסי הציבורEssing על אישור (איור 4C, שלב 9). קובץ פריט מדידה יופיע תחת קובץ הזמן לשגות ויכיל פרמטרים לניתוח כמוני (לדוגמא מרחק הגירה, מהירות, עקירה, ושיעור תזוזה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ לחיצה כפולה על קובץ פריט מדידה כדי לפתוח אותו כמו חלון (איור 4D, צעד 10). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש את שירים, אחד של תאים נותחו, לבחור &quot;נקודת מעקב&quot; מהאפשרויות &quot;התצוגה&quot; (איור 4D, צעד 11). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ לחיצה ימנית על קובץ פריט המדידה ולייצא אותו כקובץ טקסט, אשר לאחר מכן ניתן לייבא בתוכניות כמו Excel לניתוח פרמטרים הגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד תנועות בין מסגרות רצופות והפסקות שנעשו על ידי כל תא בתקופת הצילומים, בקובץ פריט המדידה בחרו מבין האפשרויות &quot;התצוגה&quot; &quot;נקודה&quot; או &quot;אוכלוסיות&quot; ולחצו על זיהוי (לכל מסלול זיהוי ייחודי). לייצא את הקובץ שנוצר על ידי להמשיךing כמוסבר בשלב 4.10. </li></ol>

<ol><li>Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+brain%3A+significant+answers+and+significant+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions.</a> Neuron. 70, 687-702 (2011).</li>
<li>Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+neurons+and+new+memories%3A+how+does+adult+hippocampal+neurogenesis+affect+learning+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and.</a> 11, 339-350 (2010).</li>
<li>Lazarini, F., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+adult+neurogenesis+essential+for+olfaction%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Is adult neurogenesis essential for olfaction?</a> Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).</li>
<li>Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+replacement+from+endogenous+precursors+in+the+adult+brain+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke.</a> Nat. Med. 8, 963-970 (2002).</li>
<li>Emsley, J. G., Hagg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha6beta1+integrin+directs+migration+of+neuronal+precursors+in+adult+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">alpha6beta1 integrin directs migration of neuronal precursors in adult mouse forebrain.</a> Exp. Neurol. 183, 273-285 (2003).</li>
<li>Sundholm-Peters, N. L., Yang, H. K., Goings, G. E., Walker, A. S., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subventricular+zone+neuroblasts+emigrate+toward+cortical+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Subventricular zone neuroblasts emigrate toward cortical lesions.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 1089-1100 (2005).</li>
<li>Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+of+tangential+pathways+for+neuronal+migration+in+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14895-14900 (1996).</li>
<li>Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system.</a> Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).</li>
<li>Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+symphony+of+signals+conducts+early+and+late+stages+of+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis.</a> Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).</li>
<li>Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+neuronal+migration+changes+the+fate+of+developing+neurons+in+the+postnatal+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Abnormal neuronal migration changes the fate of developing neurons in the postnatal olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).</li>
<li>Gotts, J. E., Chesselet, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+subventricular+zone+expansion+after+focal+cortical+ischemic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of subventricular zone expansion after focal cortical ischemic injury.</a> J. Comp. Neurol. 488, 201-214 (2005).</li>
<li>Goings, G. E., Sahni, V., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+patterns+of+subventricular+zone+cells+in+adult+mice+change+after+cerebral+cortex+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Migration patterns of subventricular zone cells in adult mice change after cerebral cortex injury.</a> Brain Res. 996, 213-226 (2004).</li>
<li>Romanko, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+the+mammalian+subventricular+zone+in+cell+replacement+after+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Roles of the mammalian subventricular zone in cell replacement after brain injury.</a> Prog. Neurobiol. 74, 77-99 (2004).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).</li>
<li>Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PloS One. 3, e1883(2008).</li>
<li>Barnabe-Heider, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+adult+mouse+neurogenic+niches+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of adult mouse neurogenic niches by in vivo electroporation.</a> Nat. Methods. 5, 189-196 (2008).</li>
<li>Platel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptors+activated+by+subventricular+zone+astrocytic+glutamate+are+critical+for+neuroblast+survival+prior+to+entering+a+synaptic+network%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network.</a> Neuron. 65, 859-872 (2010).</li>
<li>Pathania, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-132+enhances+dendritic+morphogenesis%2C+spine+density%2C+synaptic+integration%2C+and+survival+of+newborn+olfactory+bulb+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">miR-132 enhances dendritic morphogenesis, spine density, synaptic integration, and survival of newborn olfactory bulb neurons.</a> PloS One. 7, e38174(2012).</li>
<li>dal Maschio, M., M,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nat. Commun. 3, 960(2012).</li>
<li>Oudin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocannabinoids+regulate+the+migration+of+subventricular+zone-derived+neuroblasts+in+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Endocannabinoids regulate the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 31, 4000-4011 (2011).</li>
<li>Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+recording+subventricular+zone+progenitor+cells+in+live+tissue+of+postnatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice.</a> Front. Neurosci. 4, (2010).</li>
<li>Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+subventricular+zone+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neonatal subventricular zone electroporation.</a> J. Vis. Exp. (72), e50197(2013).</li>
<li>Nam, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+features+of+postnatal+subventricular+zone+cell+motility%3A+a+two-photon+time-lapse+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study.</a> J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).</li>
<li>James, R., Kim, Y., Hockberger, P. E., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subventricular+zone+cell+migration%3A+lessons+from+quantitative+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Subventricular zone cell migration: lessons from quantitative two-photon microscopy.</a> Front. Neurosci. 5, 30(2011).</li>
<li>Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+of+defined+lateral+ventricular+walls%3A+a+novel+and+rapid+method+to+study+fate+specification+during+postnatal+forebrain+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis.</a> Neural Dev. 6, 13(2011).</li>
<li>Saha, B., Ypsilanti, A. R., Boutin, C., Cremer, H., Chedotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plexin-b2+regulates+the+proliferation+and+migration+of+neuroblasts+in+the+postnatal+and+adult+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Plexin-b2 regulates the proliferation and migration of neuroblasts in the postnatal and adult subventricular zone.</a> J. Neurosci. 32, 16892-16905 (2012).</li>
<li>Sanai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corridors+of+migrating+neurons+in+the+human+brain+and+their+decline+during+infancy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy.</a> Nature. 478, 382-386 (2011).</li>
<li>Tattersfield, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+striatum+of+the+quinolinic+acid+lesion+model+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the striatum of the quinolinic acid lesion model of Huntington's disease.</a> Neuroscience. 127, 319-332 (2004).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
<li>Lledo, P. M., Alonso, M., Grubb, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+and+functional+plasticity+in+neuronal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).</li>
<li>Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+neuroblast+migration+in+acute+slices+of+the+adult+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain.</a> J. Vis. Exp. (67), e4061(2012).</li>
<li>Snapyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li>
<li>Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tonic+activation+of+GLUK5+kainate+receptors+decreases+neuroblast+migration+in+whole-mounts+of+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone.</a> J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).</li>
<li>Schaar, B. T., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+coordination+during+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal coordination during neuronal migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).</li>
<li>Valiente, M., Marin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+migration+mechanisms+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal migration mechanisms in development and disease.</a> Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).</li>
<li>Comte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-3+maintains+cell+motility+from+the+subventricular+zone+to+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb.</a> J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).</li>
<li>Sonego, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fascin+regulates+the+migration+of+subventricular+zone-derived+neuroblasts+in+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

הגירה יעילה של אבות עצביים לאורך RMS מבטיחה ההתבגרות הבאה שלהם לתוך הנוירונים פונקציונליים 10. בולטים זרמים של אבות עצביים מכוונים OB גלויים בינקות אדם ועשויים לשחק תפקיד חשוב בהתפתחות המוח האנושי לאחר לידה המוקדמת 27. יתר על כן, תאים אלה מסוגלים למקד לאתרים של המוח המושפע מפציעה ו4,28 ניוון מוחיים. היכולת לפקח בזמן אמת האפקט של מניפולציה גנטית על דינמיקת neuroblast הופכת להיות חיונית כדי להבין איך תנועת neuroblast מונחה ומוסדרת. <p class="jove...

במוח של היונקים, הדור של נוירונים חדשים (נוירוגנזה) מתרחש לאחר לידה בעיקר בשני אזורים, אזור subventricular (SVZ) של החדרים לרוחב ואזור subgranular ברכס משוננת של ההיפוקמפוס 1. ראיות רבות שנאספו בשנים האחרונות תומכת בתפקיד קריטי לנוירוגנזה לאחר לידה בתפקודי זיכרון הנורה בהיפוקמפוס וחוש ריח 1-3. חשוב לציין, נוירוגנזה לאחר הלידה גם בעל פוטנציאל טיפולי בגלל מערכת היחסים שלה עם הפרעות נוירולוגיות ניווניות, ואת היכולת של neuroblasts להגר לאתרים פגועים במוח 4-6. אזור subventricular (SVZ) התפתחה לאחרונה כנישת נוירוגנית מכרעת. neuroblasts נגזרת SVZ נודדות לכיוון הנורה חוש הריח (OB) דרך הזרם מקורי נודד (RMS), מה שהופך את זה לתהליך ההגירה הארוך ביותר ב1,7,8 המוח לאחר הלידה. / RMS / מערכת OB היונקים SVZ הפכהמודל שימושי ללמוד צעדים שונים בנוירוגנזה, כגון התפשטות, הגירה ו1,8 בידול. גורמי גדילה רבים ורמזים תאיים להסדיר נוירוגנזה SVZ והגירה לאורך RMS, אבל המנגנונים המולקולריים תאיים רחוקים מלהיות באופן מלא הבינו 1,9. הגירה נכונה לאורך RMS היא קריטית להבשלה המאוחרת של נוירונים יילוד 10. בנוסף, חלק מהמחקרים הראו כי neuroblasts נגזרת SVZ יכולה להעביר מתוך RMS לאתרי פגיעה מוחית 4-6,11-13. לכן, חוקר את נדידת neuroblast ויסות מנגנוני איתות הוא יסוד לא רק להבין נוירוגנזה אלא גם ליישומים טיפוליים פוטנציאליים. כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לתייג אבות עצביים SVZ ידי in vivo electroporation לאחר הלידה ולעקוב אחר הנדידה שלהם לאורך RMS בתרבויות פרוס מוח חריפות באמצעות microsco confocal הדיסק מסתובב זמן לשגותpy. Electroporation נעשה שימוש נרחב במחקרים התפתחותיים מעובריים לשלבים בוגרים 14-18. זהו כלים רבי עוצמה כדי לכוון ולתפעל אבות עצביים SVZ ומהווה חלופה זולה יותר והרבה יותר מהר להזרקת stereotactic של וקטורים או דור ויראלי של מודלים מהונדסים 1,15,19,20. זהו הליך פשוט יחסית, שאינו זקוק לניתוח ויש לו שיעורי הישרדות גבוהים. Electroporation של shRNA או פלסמידים-להביע recombinase CRE במודלים גנטיים עכבר העסקת מערכת LoxP יכול לשמש יעד גנים של עניין או להשיג תיוג קבוע של אבות SVZ, ובכך מייצג את כלי שימושי ללימודי neurogenesis למבוגרים 21,22. הגירת neuroblast RMS הדמיה במוח השלמה היא עדיין מאתגרת בשל מגבלות טכניות הנוכחיות. עם זאת, ניתן לנטר את התהליך הזה באמצעות מיקרוסקופיה זמן לשגות ספינינג confocal דיסק של פרוסות מוח חריפות, המספקות syst מתאיםשלהם דומים מאוד מצב in vivo גם נתונים למניפולציה תרופתית 23,24. הצימוד ב electroporation vivo לאחר הלידה עם הזמן לשגות הדמיה יקל על ההבנה של המנגנונים המולקולריים שליטה תנועתיות neuroblast ולתרום לפיתוח גישות חדשות כדי לקדם את תיקון מוח.

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>35 מ"מ צלחת תרבית תחתונה מזכוכית</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>מדיה מאוזנת של Gey's</td><td>Sigma</td><td>G9779-500ML</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז, 45%</td> <td>Sigma</td><td>G8769-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-25G</td><td></td></tr><tr><td>עט/ Strep</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>GIBCO</td><td>10109-163</td><td></td></tr><tr><td>תוסף B27</td> <td><a>Invitrogen Life Technologies</a></td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td><a>Invitrogen Life Technologies</a></td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (נטול פנול אדום)</td><td>GIBCO</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>סיגמא ירוק מהיר</td><td></td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית להזרקה</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>30-0057</td><td></td></tr><tr><td>צינור שואב</td><td>סיגמא</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>סאטר P-97 חולץ נימי</td><td>מכשיר סאטר</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>ECM830 גל מרובע אלקטרופורטור</td><td>הרווארד</td><td>מכשיר 45-0052</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה פלטינה 7 מ"מ</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>45-0488</td><td></td></tr><tr><td>מתג רגליים דגם 1250F</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>45-0211</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל לאלקטרודות</td><td>Cefar Compex</td><td>6602048</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Merial</td><td>AP/DRUGS/220/96</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>דבק</td><td>Roti coll</td><td>Roti coll 1</td><td></td></tr><tr><td>UltraViEW VoX מערכת דיסק מסתובב</td><td>פרקין אלמר</td><td></td><td>התקנה מותאמת אישית (ניתן להשתמש במספר מקורות לייזר) מצוידת במצלמת Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD</td></tr><tr><td>תוכנה Volocity</td><td>פרקין אלמר</td><td></td><td>רכישה, כמות, הדמיה מודולים</td></tr><tr><td>תא סביבתי למיקרוסקופיה</td><td>Solent Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך Ti-E</td> בהתאמה אישית <td>ניקון</td><td></td><td>CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA המטרה מומלצת ליישום המתואר במאמר זה</td></tr></tbody></table>

in vivo electroporation ואחרי הלידה וזמן לשגות הדמיה של neuroblast הגירה בעכבר חריפה פרוסות המוח

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

אזור subventricular (SVZ) הוא אחת מהנישות העצביות העיקריות במוח לאחר הלידה. כאן, אבות עצביים להתרבות ולהצמיח neuroblasts מסוגל לנוע לאורך הנחל מקורי נודד (RMS) לכיוון הנורה חוש הריח (OB). נדידה למרחקים ארוכים זו נדרשת להבשלה המאוחרת של נוירונים יילוד בOB, אבל המנגנונים המולקולריים המסדירים את התהליך הזה עדיין אינם ברורים. חוקר את מסלולי איתות שליטה תנועתיות neuroblast יכול לא רק לעזור להבין צעד מהותי בנוירוגנזה, אבל יש גם פוטנציאל התחדשות טיפולי, בהתחשב ביכולת של neuroblasts אלה כדי למקד לאתרים במוח מושפעים מפציעה, שבץ מוחי או ניוון. בכתב היד הזה אנו מתארים פרוטוקול מפורט לin vivo electroporation לאחר הלידה והזמן לשגות ההדמיה הבאה של הגירת neuroblast בRMS העכבר. electroporation אחרי הלידה יכול ביעילות transfect אב SVZתאים, אשר בתורו ליצור neuroblasts נודד לאורך RMS. באמצעות confocal ספינינג מיקרוסקופיה זמן לשגות דיסק בתרבויות פרוסה מוח חריפים, הגירת neuroblast ניתן לנטר בסביבה הדומה למצב in vivo בשיתוף פעולה הדוק. יתר על כן, תנועתיות neuroblast יכולות להיות במעקב וכמותית מנותחת. כדוגמא, אנו מתארים כיצד להשתמש בvivo electroporation לאחר הלידה של פלסמיד-GFP-לבטא לתייג ולדמיין neuroblasts נודד לאורך RMS. גם electroporation של פלסמידים-להביע recombinase shRNA או CRE בעכברים בנוקאאוט מותנים העסקת מערכת LoxP יכול לשמש יעד הגנים של עניין. מניפולציה תרופתית של תרבויות פרוסה מוח חריפות ניתן לבצע כדי לחקור את התפקיד של מולקולות איתות שונות בהגירה neuroblast. על ידי צימוד ב electroporation vivo עם הזמן לשגות הדמיה, אנו מקווים להבין את המנגנונים המולקולריים שליטה תנועתיות neuroblast ולתרום לפיתוחment של גישות חדשות כדי לקדם את תיקון מוח.

תיוג של neuroblasts נודד נגזר SVZ ניתן לצפות יחד RMS, בדרך כלל 4-8 ימים לאחר electroporation מוצלח (איור 1). יכולות להיות גם שנבחרו נקודות זמן ארוכות יותר, אך פחות תאים יימצאו בRMS מאחר שרובם יהיה נכנסו OB. Neuroblasts להתחיל לרכוש מורפולוגיה ותכונות אופייניות של תאי גרגיר בוגרים בOB סביב 2-3 שבועות לאחר electroporation (לא מוצגת). לאחר culturing ל~ 1 שעות, פרוסות מוח מגורי עכבר electroporated ניתן הדמיה באופן אמין לתקופה של עד 3-4 שעות. כפי שדווח בעבר 23,26,...

הגירת neuroblast היא אירוע מהותי בנוירוגנזה לאחר לידה. אנו מתארים פרוטוקול תיוג יעיל של neuroblasts ידי in vivo electroporation לאחר לידה ולאחר מכן להדמיה של ההגירה שלהם באמצעות זמן לשגות הדמיה של פרוסות מוח חריפות. אנו כוללים תיאור לניתוח כמותי של דינמיקת neuroblast ידי מעקב וידאו.

In vivo electroporation ואחרי הלידה וזמן לשגות הדמיה של neuroblast הגירה בעכבר חריפה פרוסות המוח

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין ולנתח את הנדידה של נוירובלסט לאורך זרם הנדידה הרוסטרלי במוח העכבר לאחר הלידה. זה מושג על ידי אלקטרופורציה ראשונה, חלבון פלואורסצנטי ירוק בציפוי פלסמיד DNA בחדר הצדדי של העכבר. השלב השני הוא הכנת פרוסות מוח מהעכברים החשמליים.לאחר מכן, הפרוסות עם אות ה- GFP הטוב ביותר נבחרות לתרבות. השלב האחרון הוא הדמיית זמן-lapse של פרוסות המוח המכילות את ה-GFP המסומן נוירובלסט נודד באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב. בסופו של דבר, סרטי ה-Time-lapse משמשים למעקב אחר תאים וניתוח כמותי של נדידת נוירובלסטים.שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירוגנזה, כגון כיצד התנועה של נוירובלסט שמקורו בתאי גזע מונחית ומווסתת במוח שלאחר הלידה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו העברת וקטור ויראלי הוא שהיא קלה יותר, זולה יותר וגוזלת פחות זמן. בנוסף, הוא מאפשר תיוג דליל של נוירובלסט, ולכן מאפשר ניתוח מפורט של דינמיקת הנדידה שלהם.התחל הליך זה על ידי הגדרת המתח של האלקטרופורט לחמישה פולסים מרובעים, 50 מילישניות לפולס ב-100 וולט במרווחים של 850 אלפיות השנייה. לאחר מכן טען מחט נימית עם מיקרוליטר אחד עד שניים של DNA באמצעות צינור שואב המחובר לנימים. לאחר מכן, הוציאו גור עכבר מהכלוב לאחר הלידה והרדימו אותו על ידי שאיפת פלואור.לאחר מכן, החזיקו את ראש הגור בין האגודל לאצבע המורה של היד הפחות דומיננטית שלכם. משוך מעט את העור לאחור על הראש כדי לסייע בזיהוי נקודת ההזרקה הנכונה. חשבו על קו וירטואלי בין העין לבין ציון הדרך הגולגולתי למבדה.לאחר מכן הכנס את המחט הנימים בכשליש מאורך הקו הזה מהלמבדה לעומק של כשני מילימטרים לאחר מכן, הזריק פלסמיד על ידי נשיפה איטית דרך הפה. במהלך הליך זה, ודא שהאצבעות שלך אינן מפעילות לחץ רב מדי על המוח. הפסק את ההזרקה כאשר נותרה כמות מינימלית של תמיסת DNA בנימים.לאחר מכן מצפים את שתי האלקטרודות בג'ל ומניחים אותן עם הצד החיובי בצד הצדדי של חצי הכדור שבו הוזרק ה-DNA. לשילוב DNA ב- Rostral SVZ מקם את האלקטרודות מעט רוסטרליות לנקודת ההזרקה. לאחר מכן, התחל את העברת הזרם על ידי לחיצה על דוושת מתג רגל הדופק.לאחר מכן נגב את הג'ל מראשו של הגור, החייה את הגור בחמצן על כרית חימום למשך מספר דקות. לאחר מכן, החזירו אותו לכלוב והניחו אותו הרחק מהאם. ודא שהאם מוציאה את הגור ומאחדת אותו עם שאר הגור.בהליך זה הנח תוספות תא מילי-לתוך צלחת תרבית תחתית זכוכית בגודל 35 מילימטר המכילה מיליליטר אחד של מדיום סרט. לאחר מכן מניחים את צלחת התרבות בחממה לחה בחום של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני. לאחר עריפת ראשו של גור העכברים, הסר את הקרקפת בעזרת אזמל.לאחר מכן, חותכים את הגולגולת לאורך התפר הסגיטלי האמצעי מהמוח הקטן לנורת הריח. בצע כמה חתכים רוחביים נוספים על הגולגולת והסר בעדינות את דשי הגולגולת באמצעות מלקחיים. וודאו שהמוח כולו חשוף ונתח אותו בזהירות באמצעות מרית, תוך הקפדה מיוחדת לא לפגוע ברקמה.לאחר מכן המיס מנתח את המוח עם סכין גילוח ומשליך את חצי הכדור המוזרק. לאחר מכן הניח פיסת סרט קטנה על מחזיק הוויברם. השתמש בכמות הדבק המינימלית הדרושה כדי לחבר עליו את חצי הכדור של המוח.התחל לחתוך את חצי המוח לפרוסות של 300 מיקרון. לאחר מכן אוספים את הפרוסות בעזרת מברשת צבע קטנה או לולאת חיסון רכה. לאחר מכן, בדוק את שני צידי הפרוסות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי רגיל עבור אות GFP ובחר את אלה המראים פלואורסצנטיות בהירה לאורך רוב זרם הנדידה הרוסטרלי.במכסה המנוע של תרבות עצמית, חתכו את השליש הכי מפנק של פרוסת המוח והסירו את כל עקבות הדבק. לאחר מכן, שאפו את הפרוסה באמצעות פיפטה מפלסטיק והניחו אותה במרכז תוספת תא מילי חמה מראש. הסר את תמיסת החיתוך העודפת על גבי התותב בעזרת פיפטה של גילסון.לאחר מכן השאירו את תרביות הפרוסות להתיישב בחממת פחמן דו חמצני של 37 מעלות צלזיוס 5% למשך שעה לפחות. לפני הדמיה תוך שעתיים מהכנת פרוסת המוח. הניחו את צלחת הזכוכית התחתונה שמכילה את פרוסת המוח בתא ההדמיה על במת המיקרוסקופ.לאחר מכן, השתמש במטרה של 20 x 0.45 תחת האור הפלואורסצנטי המתאים כדי לבחור ולמקד את אזור הפרוסה שיצולם. כדי להגדיר את הדמיית ה-Time-lapse במיקרוסקופ, לחץ על כפתור L 100 כדי לאפשר סריקת לייזר של הדגימה. הבא במהירות, פתח את מחליף הלייזר אולטרה view על ידי בחירת הלייזר המתאים.הגדר את רווח זמן החשיפה ואת עוצמת הלייזר. לאחר מכן בחר את מרווח Zack כדי לדמות בתוך המוח. לאחר מכן, בחר את המרווח בין כל תמונת אוסף ZS.בחר את מרווח הזמן בין כל לכידת מחסנית ZS ואת משך ההדמיה הכולל. לאחר מכן לחץ על סמל השמירה כדי לשמור את השינויים בפרמטרי ההדמיה. בסוף, לחץ על כפתור ההקלטה כדי להתחיל בהדמיה במודול כימות המהירות.פתח את הספרייה הרצויה שנוצרה. לאחר השלמת ניסוי זמן-lapse, בחר מיקוד מורחב מהתיבה השמאלית העליונה. לחץ על לשונית המידות כדי להציג את חלון המדידה.רשימת משימות גלויה בפינה השמאלית התחתונה של המסך. גרור/י את הרצועה בשטח שמעל. פעולה זו תגרום לפתיחת חלון חדש הנקרא מסלול.בחלק השמאלי העליון של המסך, בחר נקודות מלשונית הקלט בחלון הרצועה. לחץ על כלי הנקודות, לחץ על הכרטיסייה כלים ובחר באפשרות עקוב אחר אובייקטים באופן ידני יופיע חלון כדי לאפשר למפעיל להתחיל לעקוב אחר התאים. התחילו לעקוב אחר הנוירובלסט הנודד על ידי לחיצה עם העכבר על האזור המרכזי של גוף התא, והמשיכו לעקוב אחר תנועת התא עד שתגיע לנקודת הזמן האחרונה של חלוף הזמן.כדי להשיג נתונים, בחר צור פריט מדידה. מתפריט המדידות, יופיע חלון במרכז המסך. בחלון זה, בחר פריט מדידה חדש שנקרא והקלד שם פריט מדידה.קובץ המכיל פרמטרים לניתוח כמותי יופיע תחת קובץ ה-time-lapse. לחץ פעמיים על קובץ פריט מדידה זה כדי לפתוח אותו כחלון להמחשת המסלולים הבודדים של תאים מנותחים. בחר נקודת מעקב מאפשרויות התצוגה ובחר את התאים שיש להמחיש עבור נתיב הנדידה שלהם.כדי לנתח פרמטרי הגירה לחץ לחיצה ימנית על קובץ פריט המדידה וייצא אותו כקובץ טקסט, אותו ניתן לייבא לאחר מכן בתוכנות כמו Excel. אלו הן תמונות הדיסק המסתובב של נוירובלסט שנלקחו מפרוסת מוח סגיטלית של עכבר. חמישה ימים לאחר אלקטרופורציה של GFP המבטא תמונות פלסמיד בהפרש של שעה.כל פאנל הוא הקרנת זאק של 28 תמונות עוקבות בהפרש של ארבעה מיקרונים. ראשי החצים מצביעים על ארבעה נוירובלסטים מייצגים הנודדים לאורך ה-RMS לכיוון פקעת הריח. אלו הם מסלולי הנדידה המייצגים המתקבלים מהדמיית זמן-lapse של ארבעה נוירובלסטים.הגרף הזה מראה את המרחק שנדד עם הזמן של שני נוירובלסטים מייצגים. תאים אלה מציגים התנהגות תנועתית מלחית אופיינית. סרטון זה מציג קטע של העכבר RMS עם GFP שכותרתו מעבר.נוירובלסט שהתקבל חמישה ימים לאחר אלקטרופורציה של A GFP המבטא פלסמיד. נורת הריח ממוקמת מחוץ לטווח הראייה לכיוון הפינה הימנית התחתונה. ערימות ה-Z הקונפוקליות נלכדו על קונפוקל דיסק מסתובב.עם מטרה של פי 20 כל שלוש דקות למשך שלוש שעות במרווח של 120 מיקרון, מהירות המשחק היא 10 פריימים לשנייה. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לתרגל אלקטרופורציה לפני תחילת הניסויים וגם להכין בזהירות את תרביות פרוסות המוח החריפות בזמן הקצר ביותר האפשרי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לדמיין ולנתח את נדידת הנוירובלסטים במוח העכבר שלאחר הלידה.

in-vivo-postnatal-electroporation-time-lapse-imaging-neuroblast

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מתארים פרוטוקול עבור videoimaging בזמן האמת של הנדידה עצבית במוח הקדמי בעכבר. ההגירה של מבשרי נוירונים שכותרת-ויראלי או מושתלים נרשמה בפרוסות חיות חריפות באמצעות הדמית ניאון שדה רחב עם מרווח רכישה מהירה יחסית כדי ללמוד את השלבים השונים של נדידת תאים, כולל את משכי הזמן של שלבי הגירה והנייחת והמהירות הגירה.

הדמית זמן לשגות הגירת Neuroblast בפרוסות חריפות של המוח הקדמי המאוס למבוגרים

Source: Wiegreffe, C., et. al.,  הדמיה קונפוקלית של נוירונים נודדים בתרבית פרוסה אורגנוטיפית של מוח עכבר עוברי באמצעות In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (2017) סרטון זה מדגים מיקרוסקופיה קונפוקלית של זמן-lapse כדי לצפות בנדידה רדיאלית של נוירונים בקליפת המוח מהאזור התת-חדרי לצלחת קליפת המוח באמצעות פיגומי גליה רדיאליים בפרוסות מוח עובריות של עכבר.

הדמיית זמן-lapse של נדידה רדיאלית של נוירונים בקליפת המוח בפרוסות מוח עובריות של עכבר

הגירת neuroblast היא צעד חיוני בנוירוגנזה לאחר לידה. הפרוטוקול מתואר כאן ניתן להשתמש בם כדי לחקור את התפקיד של רגולטורים מועמד של הגירת neuroblast ידי העסקת nucleofection DNA / RNA סיכת הראש קטן (shRNA) וassay הגירת 3D עם neuroblasts מבודדת מהזרם הנודדות מקורי לאחר הלידה המכרסם.

Nucleofection של neuroblasts מכרסמים לחקר הגירת neuroblast<em&gt; במבחנה</em

פרוטוקול זה מספק הוראות תצפית ישירה של נוירונים קליפת המוח נודדת. ב electroporation ברחם , תרבות פרוסות organotypic, הדמיה confocal זמן לשגות משולבים ישירות באופן דינמי ללמוד את ההשפעות של overexpression או downregulation של גנים של עניין נודדים נודדות ולנתח את ההבחנה שלהם במהלך הפיתוח.

זמן לשגות Confocal הדמיה של נוירונים נודדים תרבות פרוסה Organotypic של המוח עכבר עובריים באמצעות<em&gt; באוטרו</em&gt; Electroporation

כאן, אנו מספקים שיטה נמוכים ואמין כדי ליצור electroporated המוח organotypic פרוסה תרבויות מעוברים עכבר מתאים מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות הדמיה לחיות.

. פשוט תאכל לשעבר אלקטרופורציה ותרבויות פרוסה Organotypic מוח עובריים בעכבר עבור Live-הדמיה של העברת Interneurons GABAergic

פרוטוקול זה מדגים שיטה פשוטה וחזקה לחקר גדילת אקסון באתרו ודינמיקת חרוט גדילה. הוא מתאר כיצד להכין פרוסות מוח חריפות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית ex vivo ומספק צינור ניתוח ידידותי למשתמש.

באתרו הדמיה של גדילה וצמיחה של דינמיקת חרוט אקסון בתרביות פרוסות מוח עובריות אקס-ויוו חריפות

במהלך התפתחות קליפת המוח, נוירונים ותאי גלייה מקורם באזור החדר המצפה את החדר ונודדים לעבר פני המוח. גנים רבים מעורבים בתהליך זה. פרוטוקול זה מציג את הטכניקה לדימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה.

דימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה בפרוסות מוח עובריות של עכבר

פרוטוקול זה מתאר assay פרוסה organotypic אופטימיזציה עבור המוח לאחר הלידה ברזולוציה גבוהה זמן לשגות הדמיה של הגירה neuroblast בזרם נודדות מקורי.

Assay Slice Organotypic עבור זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה נדידת הנוירונים במוח אחרי לידה

הסרטון הנוכחי מדגים שיטה אשר מנצל שילוב של electroporation ו מיקרוסקופיה confocal לבצע הדמיה לחיות על הפרט ובתאים עצבית forebrain דג הזברה מתפתח.

זמן לשגות הדמיה חיה של Related Clonally ובתאים עצבית של פיתוח דג הזברה forebrain

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

למדו לדמיין נוירובלסטים נודדים במוח עכברים לאחר הלידה באמצעות אלקטרופורציה של GFP וצילום time-lapse. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר תנועת תאים וניתוח כמותי של דינמיקת הגירה לאורך הזרם הנודד הקדמי.

In vivo electroporation ואחרי הלידה וזמן לשגות הדמיה של neuroblast הגירה בעכבר חריפה פרוסות המוח

גלה סרטונים נוספים