Picoinjection של Microfluidic טיפות בלי אלקטרודות מתכת

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לתכנן, לייצר ולהשתמש בשבבי מיקרופלואידיקה המסוגלים להזריק ריאגנטים בצורה מדויקת ובשליטה לתוך טיפות מים בשמן, תהליך המכונה pico injection. דבר זה מושג תחילה על ידי תכנון התקן בעל תעלת אמולסיה המצטמצמת לקוטר קטן מזה של הטיפות הכדוריות, ומסדרת אותן במרווחים שווים בתוך שמן נשא אינרטי. כשלב שני, טיפות המים והשמן מוחדרות אל ההתקן וזורמות אל נקודת ההזרקה.

תעלה ניצבת המכילה את הריאגנטים להזרקה. לאחר מכן, מופעל מתח גבוה על נוזל ההזרקה בעת מעבר טיפות דרך נקודת ההזרקה, וזאת כדי לגרום למיזוג של הטיפות עם נוזל ההזרקה. התוצאות שהתקבלו מראות כי על ידי כוונון גודל המתח המופעל, ניתן לשלוט במדויק בנפח הריאגנט המוזרק ברזולוציה של פיקוליטרים. טכניקה זו נולדה מתוך הצורך לפשט את הייצור של המכשירים שלנו על ידי ביטול הצורך באלקטרודות מתכת.

היתרונות על פני טכניקות קיימות הם הקלות והפשטות בתכנון המכשיר, בייצורו ובשימוש בו. האלקטרודות המתכתיות ששימשו בשיטות קודמות היו נוטות להישבר ורגישות לאבק ולפסולת בתעלות במהלך הייצור. על ידי ביטול האלקטרודות, הפכנו את המכשירים שלנו לעמידים יותר ושיפרנו את יעילות הייצור. השלב הראשון הוא תכנון שבב מיקרופלואידי בהתאם לצרכי הניסוי.

השתמשו בתוכנה לתכנון בעזרת מחשב (CAD) עבור שלב זה, על מנת לאפשר שימוש בטכניקות פוטוליתוגרפיה בשלב מאוחר יותר. תכנון השבב כולל תעלות אמולסיה שגודלן קטן מהטיפות הכדוריות שבהן ייעשה שימוש, וזאת כדי לאפשר הזרקה פיקו-מטרית (pico injection) יעילה יותר. אתר ההזרקה הפיקו-מטרית מבוסס על תכנון המופיע בספרות המקצועית, ללא האלקטרודות המתכתיות.

תעלות נוספות משמשות כחפיר פאראדיי (Faraday moat) כדי למגן את הטפטפות במעלה הזרם מהשדה החשמלי. עם השלמת התכנון, השתמש בטכניקות פוטוליתוגרפיה רכות כדי לייצר את ההתקנים, ולאחר מכן הדבק אותם למסבכת זכוכית של מיקרוסקופ, וההתקן יהיה מוכן לשימוש. הכן משאבת בקרת לחץ אוויר כדי להפעיל לחץ על מאגר המכיל נוזל.

בצעו זאת על ידי שינוי פלט המשאבה כך שהאוויר המודלק ייצא דרך קטע של צינור פוליאתילן בעל קוטר פנימי של 2.7 millimeters. סגרו את קצה הצינור על ידי התאמתו לפטמה בחלקו האחורי של קצה מזרק. לאחר איטום המרווח שבין המזרק לצינור באמצעות אפוקסי, חברו מחט במידה 27.5 gauge תוך שימוש בריאגנטים המתאימים לניסוי.

הכינות תמיסות אמולסיה אחידה של טיפות מימיות התלויות בשמן נשאי. העבירו את האמולסיה למזרק של מיליליטר אחד המצויד במחט במידה 27.5 gauge. לאחר מכן, קבעו את המזרק במשאבת מזרקים וכוונו אותו כך שהמחט תפנה כלפי מעלה.

השלב הבא הוא הכנת הריאגנטים להחדרה למכשיר המיקרופלואידי ולמאגרים שלהם. התחילו עם מבחנה לצנטריפוגה של 15 milliliter ומכסה. השתמשו במנקב ביופסיה או בכלי נוח אחר כדי לנקב שלושה חורים של 0.5 millimeter במכסה.

הכינו אלקטרודת חוט בעלת קוטר של 0.5 מילימטרים ואורך העולה בכמה סנטימטרים מאורך מבחנת הצנטריפוגה. הכניסו אלקטרודה זו לתוך אחד החורים בפקק. ודאו שהיא מגיעה לתחתית המבחנה ובולטת מספר סנטימטרים מעבר לחלק העליון.

בשלב הבא, הכינו קטע צינור פוליאתילן באורך של כ-20 סנטימטרים. הכניסו אותו לחור השני. שוב, עליו להגיע לתחתית המבחנה בחור שנותר.

השחילו כ-2.5 centimeters של צינור פוליאתילן. צינור זה ינוח מעל מפלס הנוזל. מרחו אפוקסי לפתיעה באמצעות UV כדי לאטום מרווחים בחלקו העליון של הפקק.

עם השלמת הפילול, מלאו את המבחנה בנוזל ההזרקה לפיקו הרצוי, 100 millimolar sodium chloride, והבריגו את המכסה. חברו את היציאה ממשאבת בקרת לחץ האוויר לקטע הקצר יותר של הפיתול במכסה. עם הכנסת המחט לתוך הלומן, המחט צריכה להתהדק בתוכו.

הנח את מבחנת הצנטריפוגה במעמד שלה. המשך על ידי מילוי מזרק של 1 mL ב-sodium chloride בריכוז 1 M. כדי שישמש כנוזל של תעלת פאראדיי (Faraday moat), חבר מחט בכיול 27.5 gauge ואבטח את המזרק על משאבת מזרקים.

מלאו מזרק נוסף של מיליליטר אחד בשמן ספייסר נשא. חברו מחט בכילוי 27.5 ואבטחו אותה במשאבת מזרקים. בשלב זה, ניתן לבצע את החיבורים לשבב המיקרופלואידיקה.

ראשית, ודאו שהשבב מקובע על משטח שטוח. לאחר מכן, הביאו את הקצה הפתוח של הצינור הארוך ממכל נוזל ההזרקה אל השבב. חברו צינור זה ליציאת הכניסה של נוזל הפיקו-הזרקה בשבב המיקרופלואידי.

לאחר מכן, חבר צינור פוליאתילן למזרק המכיל sodium chloride והשחל אותו עד לשבב. חבר אותו לפתח הכניסה של תעלת פאראדיי (Faraday moat). כמו כן, השתמש בצינור כדי לחבר את המזרק המכיל את שמן הנשיאה לפתח הכניסה שלו במכשיר.

חברו צינור היוצא מפתח יציאת האמולסיה אל כלי איסוף. לבסוף, השתמשו בצינור כדי לחבר את פתח היציאה של תעלת פראדיי (Faraday moat) למכל מבודד חשמלית שאינו מוליך. בסיום, השבב המיקרופלואידי ייראה כך.

כעת קחו חוט מההארקה של מגבר המתח הגבוה וחברו אותו למחט של המזרק עם הנתרן כלוריד. השתמשו בתליש תנימים כדי לחבר את החוט למחט. הושטו חוט נוסף מיציאת המתח הגבוה של המגבר אל האלקטרודה הטבולה בנוזל ההזרקה לפיקו (pico injection fluid).

השתמשו בתפס תנימים כדי ליצור את החיבור כקלט למגבר. השתמשו ביציאת המחשב של מחולל גלי-צורה הנשלט על ידי תוכנה. התחילו את ההזרקה למערכת על ידי הכנסת נוזל Faraday mote של sodium chloride בריכוז one molar למכשיר בקצב של 100 µL לשעה.

לאחר מכן, התחילו את זרימת הטיפות, האמולסיה ושמן הנשא כדי לאפשר לטיפות לעבור דרך ה-pico injector במרווחי זמן קבועים, כאשר ביניהן מפריד מרווח של שמן נשא. התאימו את הלחץ המופעל על נוזל ה-pico injection, כך שהנוזל בפתח ה-pico injection יבלוט לתוך תעלת הטיפות, אך לא ינתק כדי ליצור טיפות משלו. השתמשו במחולל גלי נסוג (waveform generator) כדי להפיק אות AC בתדר 10 kilohertz עם אמפליטודה של 0 עד 10 volts, אשר יוגבר פי אלף על ידי מגבר המתח הגבוה.

כדי לבצע הזרקה בנפח פיקו (pico injection), יש להחיל אות זה על הטיפות בעת מעברן דרך פתח ההזרקה ולהשתמש באמפליטודה כפרמטר. סרטון זה מציג הזרקה סלקטיבית של טיפות בהתבסס על נוכחותו של צבע פלואורסצנטי.

במקרה זה, 200 טיפות לשנייה עברו דרך המזרק, אך קצבים של עד 10,000 לשנייה הם אפשריים עם מנגנון גילוי טיפות מתאים. נתונים אלו מראים את חלק הנפח המוזרק כפונקציה של המתח המופעל עבור נוזלי הזרקה בריכוזים מולריים שונים. ההנחה היא שמתחים גבוהים יותר גורמים לתחילת התמזגות מוקדמת יותר, דבר המוביל להארכת משכי ההזרקה ולהגדלת הנפחים.

מפת חום דו-ממדית זו מציגה את הקשר בין המולריות של התמיסה היונית לבין המתח הנדרש להשגת נפחי הזרקה. תמיסות בעלות מולריות נמוכה יותר דורשות מתחים גבוהים יותר, מכיוון שהן מפחיתות את השדה החשמלי באתר ההזרקה בקלות רבה יותר. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לתכנן ולייצר במהירות ובאמינות התקני מיקרו-פלואידיקה המאפשרים הזרקה מדויקת וניתנת לבקרה של ריאגנטים לתוך הטיפות שלכם.

אל תשכחו שעבודה עם מתח גבוה עלולה להיות מסוכנת ביותר; יש להשתמש תמיד באמצעי זהירות, כגון הארקה תקינה, ציוד מגן אישי ומנגנוני הגנה מובנים.