Photostimulation לייזר לסריקת של מעגלים מוח קדמי ממוקדים Optogenetically

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליישם טכניקות אופטוגנטיות מודרניות כדי לעורר מסלולים עצביים ממוקדים בתכשירים של פרוסות מבחנה. זה מושג על ידי ביטוי ראשון של מוט התעלה דוסין בקווי התאים העצביים המעניינים. השלב השני של ההליך הוא הכנת פרוסות חריפות של מבני המוח הרלוונטיים למחקר.

השלב הבא הוא רישום תגובות של נוירונים בהכנת הפרוסה בתגובה לגירוי פוטו של התעלה, מוט דוסין המבטא סיבים. השלב האחרון הוא לדמות את התפלגות אופסין הערוץ המבטא נוירונים וסיבים. בסופו של דבר, גישה זו מאפשרת הערכה של הטופוגרפיה התפקודית והתכונות הסינפטיות של מעגלים עצביים באמצעות גירוי פוטו של סריקת לייזר של רכיבים עצביים ממוקדים אופטוגנטית.

היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות גירוי חשמלי מסורתיות הם היכולת למקד ולעורר באופן ספציפי סוגים מסוימים של תאים עצביים ולבחון את ההקרנות ארוכות הטווח שלהם במבחנה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח של מערכות, כגון ארגון פונקציונלי של שקעי מלחמה מורכבים. הכן מזרק ומחט להזרקת התמיסה הנגיפית, המכילה ארבעה מיקרוגרם למיליליטר פולי כדי לשפר את הטרנספקציה.

לאחר מכן הזרקת לחץ של 200 ננוליטר מהתמיסה באמצעות משאבת המזרק, שבועיים-שלושה לאחר מכן, יהיה ביטוי הולם של מוט התעלה פרוסת דוסין. יש לבצע הכנה במהירות האפשרית לאחר הסרת המוח המוזרק, צרו גוש של המוח בכיוון הרצוי בעזרת סכין גילוח נקי. לאחר מכן, הדביקו את פני השטח החסומים של המוח לשלב החיתוך באמצעות דבק דבק מיידי.

לאחר מכן העבירו את הבמה לתא חיתוך ויבראם מקורר במקפיא ושפכו CSF קר כקרח לתא החיתוך. פורסים את חלקי המוח באמצעות ויום למקטעים בעובי של ארבעה עד 500 מיקרון. העבירו את פרוסות המוח לתא אחסון מחומצן ואפשרו להן לדגור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות לפני שתמשיכו בניסוי.

כאשר מוכנים להתחיל בניסוי, העבירו את פרוסת המוח לשלב של מתקן ההקלטה האלקטרופיזיולוגי. הקלט תא עצב באמצעות טכניקות סטנדרטיות של מהדק תיקון תא שלם. מקם בקצרה את פיפטת ההקלטה על ידי הנוירון תוך הפעלת לחץ חיובי על הפיפטה.

לאחר יצירת מגע עם התא, שחרר את הלחץ והפעל יניקה ליצירת חותם הג'יגה. לאחר מכן הפעל יניקה קצרה כדי לשבור את הממברנה לתצורת התא כולו ולצלם הקלטות במצבי מהדק מתח או זרם. הפעל את סורק הלייזר עם תוכנת רכישת נתונים של גל גאות או EFAs.

יש לכייל את התוכנה לדיודת הצילום לפני השימוש כדי לשלוט בעוצמת הלייזר. גלגל צפיפות ניטרלית משתנה ממוקם בדרכו. סיבוב הגלגל מתאים את עוצמת הלייזר על ידי מדידה במישור המוקד האחורי.

ההספק מוגדר בדרך כלל בין 25 ל-D מילי-וואט. פרמטר הדופק של התריס שולט באורך ובתזמון הגירוי בתוכנה. ניתן ליצור תמונה של האזור שיש לגרות מפונקציית הווידיאו לתפוס.

לאחר מכן, הגדר את רשת הגירוי כגון רשת של 16 על 16 עם מרווח של 80 מיקרון. לאחר מכן שכב את הרשת על התמונה שנרכשה והתאם את קואורדינטות ה-XY ואת מידת ההיסט כדי לייעל את הכיוון כדי להתחיל את הגירוי. הפעל את פונקציית המפה.

הנתונים נשמרים וניתן לנתח אותם באמצעות תוכנית הניתוח הלא מקוונת בגל גאות, או שניתן לנתח אותם באמצעות תוכנית ניתוח המפות בתוכנת EFAs. לאחר השלמת ההקלטות הפיזיולוגיות על הפרוסה, ניתן לתעד את דפוס הביטוי של אופסין ערוץ מתויג YFP. ראשית, תקן את הפרוסה למשך הלילה ב-4% PFA ב-0.01 PBS מולארי בארבע מעלות צלזיוס.

למחרת, העבירו את הפרוסה לתמיסת 30% סוכרוז 4% PFA להגנה מפני קריו למשך הלילה. למחרת, חתכו חלקים של 50 מיקרון מהפרוסה על קריוסטט. שטפו את הפרוסות ב-PBS והרכיבו אותן להדמיה עם מדיום נגד דהייה במיקרוסקופ הקונפוקלי.

לאחר מציאת אזור העניין באור לבן, השתמש באורך גל מעורר של 514 ננומטר ובאורך גל פליטה של 527 ננומטר. להדמיית מבנה ויראלי YFPA המניע ביטוי של מוט ערוץ דובסון, EYFP. בנוירונים גלוטמטרגיים מעוררים הוזרקו לקליפת המוח הראייתית הראשונית של עכבר BSY.

ביטוי ויראלי נמצא במסלולים בין קליפת המוח הראייתית הראשונית והמשנית, ובסיבי הקורטיקו התלמוסיים של מהדק התיקון של התא השלם LGN שהקליטו מתא עצב בקליפת המוח הראייתית המשנית המסומנת על ידי הכוכב חשפו e PSCs. בעקבות גירוי פוטו של סריקת לייזר של התעלה, מוט דוסין מבטא סיבים בשכבות התחתונות של V שתי הקרנות תלמוסיות של קורטיקו משכבה שש של קליפת המוח הסומטוסנסורית הראשונית. הגרעין האחורי הגחוני נחקר באמצעות גישת CRE LAX כדי לבטא דוסין מוט תעלה בשכבה שש נוירונים תלמיים של קורטיקו, ובהקרנות שלהם כצפוי טרנספקציה על ידי מבנה A V להקה לעכבר טרנסגני CRE הביא לביטוי דוזין מוט תעלה בשכבה הממוקדת שישה נוירונים וסיביהם המשתרעים לשכבה ארבע.

מוט ערוץ דובסון, ביטוי EYFP נצפה גם בסיבים המקרינים לרשומות פיזיולוגיות VP מנוירון VP. שימוש במהדק טלאי תא שלם גילה כי ניתן לעורר e PSCs בעקבות גירוי פוטו ליד תא העצב המוקלט, המסומן על ידי הכוכב. ניתוח לא מקוון מתאר את משרעת התגובה הממוצעת לגירוי פוטו בפרוסות VP 50 מיקרון של נוירונים תלמיים קורטיקו שכבה שש המבטאים ערוץ רודן EYFP חשף דפוס עדין של סיבים מסומנים החוצים משכבה שש לשכבה ארבע שם הם הסתיימו וסוכות באופן נרחב.

בנוסף, נצפו סיבי קורטיקו תלמוס נכנסים לחומר הלבן וחוצים לכיוון התלמוס. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליישם טכניקות אופטוגנטיות מודרניות כדי לעורר מסלולים עצביים ממוקדים בתכשירים של פרוסות מבחנה. אל תשכח, עבודה עם לייזרים עלולה להיות מסוכנת ביותר כאשר אתה מבצע שלבי כיול הקשורים להליך זה.

הרכיבו משקפי מגן.