התבוננות וכימות דחיסה של ג'ל פיברובלסט בתיווך פיברין

המטרה הכללית של נוהל זה היא לתצפת ולנתח את השפעת האינטראקציות בין התאים למטריקס על סידור מחדש של סיבים ופעילויות של עיצוב מחדש של המטריקס במערכת של ג'ל פיברין. הדבר מושג תחילה על ידי פולימריזציה של ג'ל פיברין תלת-ממדי המכיל מיקרו-בידס (microbeads) על זכוכית כיסוי הממוקמת בתוך ביו-ראקטור עם בקרה סביבתית. השלב השני הוא הכנת תרחיף תאים בריכוז גבוה, המשמש למיקום של מקבצי פיברובלסטים או רסיסי רקמה (explants) של X בתבניות גיאומטריות על פני השטח של הג'ל.

בשלב הבא, הדגימה נסרקת בכל 15 דקות באמצעות מיקרוסקופיית ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (differential interference contrast microscopy) לאורך 48 שעות. השלב הסופי הוא מדידת מידת הארגון מחדש והעיצוב מחדש של הפיברין בצורה של מאמץ (strain) מאזורים שונים של הג'ל באמצעות קורלציית תמונות דיגיטלית (digital image correlation). בסופו של דבר, מערכת רקמת השתל (explant) זו מאפשרת לסדר את התאים בתבניות גאומטריות פשוטות, מה שמקל על ויזואליזציה ובחינה של המכניזמים העומדים בבסיס עיצוב מחדש של המטריקס וסידור מחדש של הסיבים המונחים על ידי התאים.

שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה המכנית, כגון מהן ההשפעות של רמזים מכניים מרחביים וזמניים על התנהגות התא והשינויים הנובעים מכך במטריצת הרקמה הסובבת. את הפרוצדורה ידגים Arabic de Jesus, סטודנט לתואר מתקדם מהמעבדה שלי. המיסו בעדינות fibrinogen בתוך סליין שחומם מראש ל-37 °C למשך הלילה כדי ליצור תמיסת סטוק בריכוז של 33.3 mg/mL. הכינו שבלונה על perfil כדי לקבוע את מיקומו של כל x explant בהתאם לגיאומטריית המרווח הרצויה.

כל נקודה במרחק של כ-1 עד 2 מילימטרים אחת מהשנייה. מרחק זה תואם לריווח אידיאלי ליצירת יישור סיבים בין אקספלאנטים. לאחר מכן, נקה ביסודיות את כל רכיבי הביוראקטור באמצעות 70% ethanol והנח את הרכיבים המנוקים תחת קרינת UV של מabilis תרביות רקמה למשך שעתיים עד שלוש שעות לפני תחילת התהליך.

לאחר עיקור רכיבי הביוריאקטור, הצמידו באמצעות סרט דביק את השבלונה מתחת לאזור של זכוכית הכיסוי בקוטר 60 מילימטר שבו תוכשן הדגימה. לאחר מכן, הכינו את תגלי הדנסיקה (microbead suspension), ולאחריהם את הפיברינוגן והתרומבין. להכנת תמיסות הסטוק, ערבבו 0.017 מיליליטר של תמיסת הסטוק של ה-Microbead ו-0.149 מיליליטר של DMEM בתוך מבחנה למיקרוצנטריפוגה כדי להגיע לריכוז של 10 מיליון חרוצים למיליליטר.

לאחר מכן, בצעו סוניקציה לתמיסה למשך 10 דקות כדי לפזר את החרוצים ולהומוגניזציה את התמיסה. הוסיפו 0.22 milliliters של תמיסת המלאי של הפיברינוגן ל-0.44 milliliters של HEPES buffer בריכוז 20 millimolar, ו-0.1667 milliliters של תמיסת המיקרו-חרוצים למבחנת צנטריפוגה של 15 milliliters. ערבבו בעדינות את הרכיבים ולאחר מכן הניחו את המבחנה על קרח בתוך מבחנת צנטריפוגה נפרדת של 15 milliliters.

ערבבו יחד: 32.8 µL של thrombin המומס במי מלח בריכוז של 25 units/mL, 131 µL של HEPES buffer בריכוז 20 mM, ו-2.46 µL של calcium chloride בריכוז 2 M.

לאחר מכן, ערבבו בזהירות את תמיסות ה-thrombin וה-fibrinogen שהוכן על ידי שאיבה ושחרור (pipetting) חמש עד 10 פעמים, עד שהתמיסה תהיה רגובה באופן אחיד. השתדלו לצמצם את כניסת בועות אוויר לתערובת על ידי הימנעות מריקון מלא של הפפטה במהלך הערבוב. העבירו את התמיסה המעורבבת באמצעות פפטה לתבניות PDMS של 8 מילימטרים רבוע על זכוכית כיסוי בהקדם האפשרי, והניחו לג'ל להתפולימר בטמפרטורת החדר.

הוספת thrombin תגרום לתמיסה להפוך לג'ל במהירות, תוך כ-30 שניות לאחר הפולימריזציה; יש לאטום את הביוריאקטור ולהכין את השתלי התאים. יש לקצור תאי פיברובלסטים עוריים אנושיים בהסמכה של 70% עד 90% מבקבוק T 75 באמצעות trypsin ולהסמיך אותם בצנטריפוגה ב-200 ×g למשך חמש דקות. העבירו את הביוריאקטור לקללת בטיחות ביולוגית והסירו בזהירות את המכסה תוך שמירה על תנאים אספטיים. לאחר מכן, שאבו את המצע ותלו את משקע התאים לריכוז סופי של 20 מיליון תאים למיליליטר ב-DMEM עם 10% FBS.

בשלב הבא, צרו אקספלנטים על ידי טעינת תאים לתוך מיקרו-פיפט והזרקת 0.3 µL מתלים התאים אל תוך ג'ל הפיברין הפולימרי. בהתאם לתבנית שבשבלונה, כל אקספלנט צריך להכיל כ-6,000 תאים. לאחר מיקום האקספלנטים על הג'ל, אטמו את הביוריאקטור.

לאחר מכן, הכניסו את בלוקי החימום וחברו את הצמדים התרמיים לבקר הטמפרטורה. הגדירו את בקר הטמפרטורה ל-37 °C והדגירו את הג'לים למשך שעה אחת כדי לאפשר לתאים לשקוע ולהיקשר למטריצת הפיברין. לאחר מכן, הוסיפו בערך 5 mL של DMEM שעבר התנייה למשך שעתיים עד שלוש שעות עם 5% CO2 והועשיר ב-10% fetal bovine serum, 1% penicillin streptomycin, 0.1% amphotericin B ו-10 µg/mL aprotinin ישירות לתוך תא הביוראקטור.

לאחר מכן, אטמו מחדש את הביוריאקטור. השתמשו במזרק כדי להחדיר חמישה מיליליטרים נוספים של מדיום המותנה ב-carbon dioxide דרך המחבר המשונן בפתח הכניסה כדי למלא את הביוריאקטור לחלוטין, והסירו בזהירות כל בועה שנוצרה. הגדירו משאבת מזרקים עם מזרק של 10 מיליליטר או 30 מיליליטר המלא במדיום נוסף המותנה ב-5% carbon dioxide. חברו את המזרק ישירות לפתח הכניסה במכסה הביוריאקטור באמצעות צינור סטרילי עם חיבור lure lock.

הגדירו את קצב הפרפוזיה במשאבת המזרקים ל-0.01 milliliters per minute. לאחר מכן, חברו קטעי צינוריות ששונו לשני פתחי היציאה והניחו את קצותיהם בתוך כוס כימית בנפח 100 milliliter. כדי לאסוף את הפסולת, השתמשו במעמד מעבדה מרומם (lab jack) כדי לקבוע את גובהי התזונות בכניסה וביציאה, כך שלא ייווצר הפרש לחצים באספקת הביוראקטור.

הוסף לביוראקטור מדיום רענן המותנה ב-5% carbon dioxide לאורך כל הניסוי. על מנת לשמור על ה-pH, לספק רכיבי תזונה ולהסיר תוצרי פסולת, מזרק של 10 milliliter מלא במדיום יספיק לכ-16 שעות. מקם את עדשת ה-20 XDIC תחת חלון התצוגה של המיקרוסקופ וודא שהמקטב (polarizer), האנליזטור והפריזמה כולם במקומם.

לאחר מכן, פתח את תוכנת ההדמיה. התאם את המוקד של העדשה לאזור שבין שלושת ה-x explan ושמור את קואורדינטות ה-X, Y ו-Z של מיקום זה בתוכנת ההדמיה. כדי להדמות את כל השטח שבין ומסביב ל-x explan, בחר באפשרות לרכישת תמונה גדולה והגדר את גודל השטח.

פעולה זו תאפשר רכישה של מספר תמונות סביב האזור המוגדר ויצירת תמונה אחת גדולה המורכבת מאריחים (tiled image); הגדירו את עוצמת האור ואת זמן החשיפה לערכים הנמוכים ביותר האפשריים. דבר זה יסייע במניעת מוות של תאים שנגרם מרעילות פוטוכימית (phototoxicity), תוך שהרזולוציה תישאר מספקת כדי להבחין בין תאים, חרוזי מיקרו (microbeads) וסיבי פיברין. שימו לב שבניסוי ספציפי זה, סיבי הפיברין אינם נראים בשל הצפיפות הגבוהה של חרוזי פיזור האור בגל; הפחיתו את צפיפות החרוזים או את עובי הגל כדי להבחין בסיבי הפיברין.

בשלב הבא, התחילו במעקב אחר המאמץ. ראשית, צרו או הורידו קוד MATLAB מותאם אישית, ולאחר מכן בצעו רישום (registration) של התמונות באמצעות חרוזי מיקרו (microbeads) הפזורים לאורך הג'ל כנקודות ייחוס. רישום התמונה יבטיח שהתמונות המתקבלות יצולמו בדיוק באותו מיקום בכל פעם.

נצפתה סבב יישור מחדש של סיבים בין דגימות באמצעות צילום תמונות בשיטת אריחים (tiled images) מדי 15 דקות. לאורך תקופה של 48 שעות, חולצו אזורים בודדים מהתמונות והנותחו באמצעות אלגוריתם למעקב אחר מאמצים (strain tracking algorithm). כדי למדוד מאמצים מקומיים מהעתקת חרוזי מיקרו (microbead displacement), מראים תרשימי קונטור את התפלגות המאמץ הראשי המקסימלי באזור יישור הסיבים המתאים לרצועה.

לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן להשלימה בערך בשלוש עד ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות כגון סימון פלואורסצנטי של קולגן וחלבונים של השלד התאי, וכן כימות של נדידת תאים, במטרה לענות על שאלות נוספות כגון אילו מסלולים מכנו-ביולוגיים מעורבים בעיצוב מחדש של רקמות (tissue remodeling), וכיצד תהליכים אלו מושפעים מחומרים ביוכימיים שונים.