Name: התבוננות וכימות דחיסה של גל פיברובלסט בתיווך פיברין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: חקור דחיסת ג'ל פיברובלסט בתיווך פיברין באמצעות מיקרוסקופיה time-lapse לאורך 48 שעות. שיטה זו מאפשרת ניתוח דינמי של שינויי מטריקס ויישור סיבים בתהליכי הנדסת רקמות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים לג'ורג' ג'ודיס וסטיבן אליסון על תרומת פיברובלסטים עוריים אנושיים ורמש ראגופתיה על העזרה באלגוריתם מעקב המתחים. תמיכה בעבודה זו ניתנה על ידי ארה"ב. המחלקה לחינוך בוגר סיוע בתחומים של מלגת הצורך הלאומי (GAANN P200A120071).

1. הכנת סטנסיל
הכינו סטנסיל בפרפילם לפריסת המיקום של כל הסבר, בהתאם לגיאומטריה הרצויה(איורים 1A ו-1B). רווח כל explant כ 1-2 מ"מ זה מזה. מרחק זה תואם למרווח אידיאלי ליצירת יישור סיבים בין תערוכות. חבר את הסטנסיל מתחת לאזור הכיסוי שבו הדגימה תהיה מוכנה עם קלטת.
2. עיקור
יש לנקות ביסודיות את כל הרכיבים של הביוריאקטור באמצעות 70% אתנול ולחטא במשך 2-3 שעות תחת אור UV לפני הניסוי. אם כלי חלופי נמצא בשימוש במקום bioreactor אז טכניקות עיקור נאותה יש להשתמש. ראה שלב 4.12 להערות על שימוש בצלחת פטרי תחתית זכוכית.
3. הכנת ג'ל פיברין
לאחר שרכיבי הביוריאקטור עברו עיקור, הטילו שכבה דקה של ג'ל פיברין על פני השטח של המשקפיים. פרטים להכנת פתרונות מלאי פיברינוגן ותרומבין להכנת 6.6 מ"ג / מ"ל ג'ל פיברין מתוארים סנדר ואח '. 13 פרוטוקול דומה של Ye et al. 19 להכנת 3.3 מ"ג / מיליליטר פיברין ג'ל ניתן לראות גם באתר האינטרנט של JoVE.
<ol><li>הכינו פתרון של חיידקים פלואורסצנטיים ב-DMEM בריכוז של 10 מיליון חרוזים/מ"ל. החרוזים ישמשו כדי לסייע במעקב אחר עקירת ג'ל. כדי להשיג ריכוז זה, לשלב 0.017 מ"ל של פתרון מלאי microbead ו 0.149 מ"ל של DMEM לתוך צינור microcentrifuge.</li>
	<li>Sonicate השעיה זו במשך 10 דקות כדי לפזר את החרוזים הומוגניזציה הפתרון.</li>
	<li>פיברין פתרון — ב 15 מיליליטר c-tube, לערבב 0.22 מ"ל של פתרון מלאי פיברינוגן עם 0.44 מ"ל של 20 mM HEPES מאגר. הוסף את 0.1667 מ"ל של DMEM עם microbeads שנוצרו בשלב 3.1.</li>
	<li>פתרון תרומבין - בצינור c נפרד של 15 מ"ל, יש לערבב יחד 0.0328 מ"ל של תמיסת מלאי תרומבין, 0.131 מ"ל של חיץ HEPES של 20 מ"מ ו-0.00246 מ"ל של 2 M CaCl2.</li>
	<li>בזהירות לערבב את פתרון תרומבין (שלב 3.4) עם פתרון פיברינוגן (שלב 3.3) על ידי pipetting למעלה ולמטה 5-10x עד הפתרון מופץ באופן שווה. הימנע החדרת בועות ככל האפשר. כדי להפחית את כמות הבועות המיוצרות, היזהר לא לפרוק באופן מלא את פיפטה תוך ערבוב.</li>
	<li>תוספת של תרומבין יגרום הפתרון ג'ל במהירות (~ 30 שניות). פיפטה הפתרון המעורב על כיסוי בהקדם האפשרי. אפשרו לג'ל לטבול ב-RT.</li>
	<li>לאטום את bioreactor, להכניס את בלוקי החימום, ולחבר את התרמוקולים לבקר הטמפרטורה. דגירה את הג'ל ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15-30 דקות.</li>
</ol>4. הכנת הסבר תא
<ol><li>הסר מדיום מבקבוק T-75 המכיל את תאי הפיברובלסט העוריים האנושיים.</li>
	<li>יש לשטוף בזהירות את פני השטח בכ-5 מ"ל מלוחים עם אגירת פוספט (PBS) להסרת חלבוני סרום. מוסיפים 1 מ"ל של טריפסין-EDTA ומדגרים במשך 3 דקות, או עד שהתאים מורמות.</li>
	<li>לאחר התאים הוסרו, לסובב את ההשעיה למטה בצנטריפוגה ב 200 x g במשך 5 דקות. הסר את supernatant ו resuspend גלולה בנפח של DMEM שיאפשר ריכוז סופי של 20 מיליון תאים / מיליליטר.</li>
	<li>בזמן שהתאים מסתובבים למטה בצנטריפוגה לנתק את bioreactor מגושי החימום ואת התרמוקופלים. להעביר את bioreactor לארון biosafety ולהסיר בזהירות את המכסה הבאים טכניקות אספטיות.</li>
	<li>צור explants על ידי pipetting 0.3 μl של התא השעיה על ג'ל פיברין פולימר, בעקבות התבנית על הסטנסיל. כל הסבר צריך להכיל כ-6,000 תאים. ודא כי טיפים מיקרופיפט בנפח נמוך משמשים (0.1-10 μl).</li>
	<li>אפשר לתאים להתיישב ולהתחבר למטריצת הפיברין למשך שעה ב-37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>עם bioreactor עדיין פתוח, להוסיף כ 5 מ"ל של DMEM בתוספת 10% סרום שור עוברי (FBS), 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 0.1% amphotericin B, ו 10 מ"ג / מ"ל אפרוטינין ישירות לתוך תא bioreactor. DMEM הוא מאגר ביקרבונט ודורש 5% CO2 כדי לשמור על pH ניטרלי. מאז bioreactor אינו מסופק עם CO2, מצב המדיום באינקובטור עם 5% CO2 עבור 2-3 שעות לפני השימוש. אפרוטינין הוא מעכב פרוטאז סרין כי הוא בשימוש נרחב כדי להפחית את שיעור השפלה פיברין20.</li>
	<li>תחסום מחדש את הביוריאקטור. השתמש במזרק כדי לספק 5 מ"ל נוספים של CO2 בינוני מותנה באמצעות התאמת דוקרני על יציאת הכניסה. לוותר על המדיום לאט ולוודא את כל הנפח של תא bioreactor מלא. הסר בזהירות בועות היוצרות בביוריאקטור.</li>
	<li>לספק טרי, 5% CO2 מותנה בינוני bioreactor לאורך כל הניסוי על מנת לשמור על pH, לספק חומרים מזינים, ולהסיר מוצרי פסולת. הגדר משאבת מזרק עם מזרק 10 מ"ל או 30 מ"ל מלא 5% CO2 בינוני מותנה. חבר את המזרק ישירות ליציאת הכניסה על מכסה הביוריאקטור עם צינורות סטריליים מצוידים בנעילת לואר. הסר את ההתאמה הגברית וחבר את הצינור להתאמת התיל בביוריאקטור (ראו איור 1C).</li>
	<li>הגדר את קצב הזלוף ל- 0.01 מ"ל/דקה. חבר חתיכות צינורות מותאמים לשתי יציאות היציאה והנח את הקצוות לתוך 100 מל כדי לאסוף פסולת.</li>
	<li>השתמשו בשקע מעבדה כדי לקבוע את גובה ההזנה של המפרצון והשקע כך שלא יתפתח הפרש לחץ בביוריאקטור (עיין באיור 1D לעיון).</li>
	<li>אם bioreactor אינו זמין, להכין דגימות 35 מ"מ זכוכית התחתונה פטרי מנות עם צמרות זכוכית. השתמש באחד עם גודל כריכה הממוטב עבור קבוצת המטרות הספציפית לשימוש. דגימות המוכנות במנות פטרי צריכות להישמר באינקובטור ב 37 °C (69 °F) ו 5% CO2. הערה: פוליסטירן depolarizes אור יפריע הדמיה DIC, כך צמרות זכוכית יש להשתמש אם הדמיה DIC יתבצע. ניגודיות פאזה היא מודל הדמיה חלופי מתאים. העברת כלים בין החממה למיקרוסקופ תקשה על רישום התמונה. אם התמונות אינן נרשמות כראוי אז המתח המחושב בסעיף 6 לא יהיה מדויק.</li>
</ol>5. הדמיה לשגות בזמן
<ol><li>לאחר הכנת הדגימה, יש לאתום מחדש את הביוריאקטור, לחבר מחדש את גושי החימום והתרמוקולים, ולהגדיר את טמפרטורת הביוריאקטור ל-37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הניחו את הביוריאקטור על הבמה הממונעת המותקנת על המיקרוסקופ. מקם את המטרה DIC 20X מתחת ליציאת התצוגה. מטרת הגדלה נמוכה יותר מקובלת, במיוחד אם שלב ממונע מדויק אינו זמין. ודא כי הקיטוב, המנתח והפיזמה נמצאים כולם במקום. לחלופין, ניתן גם לדמות דגימות באמצעות ניגודיות פאזה.</li>
	<li>פתח את תוכנת ההדמיה.</li>
	<li>למקד את המטרה על האזור בין שלושת explants.</li>
	<li>שמור את הקואורדינטות (x, y ו- z) של מיקום זה בתוכנת הדימות.</li>
	<li>כדי לדמות את כל האזור בין המקללים וסביבם, בחרו באפשרות לרכוש תמונה גדולה וציינו את גודל האזור. פעולה זו תאפשר רכישה של תמונות מרובות סביב האזור שצוין ותיצור תמונה פרושה המייצגת אזור גדול יותר של המדגם.</li>
	<li>הגדר את זמן החשיפה ואת עוצמת האור לערכים הנמוכים ביותר האפשריים כדי למנוע מוות של תאים הנגרמים על ידי phototoxicity, תוך מתן רזולוציה מספקת כדי להפלות בין תאים, microbeads, סיבי פיברין.</li>
</ol>6. מעקב אחר זנים
לפרטים והוראות על התוכנה למעקב אחר זנים (איור 2) המשמשת ראה ראגופתיה ואח '. 21 האלגוריתם הוא קוד MATLAB מותאם אישית שניתן להוריד <a href="http://www.license.umn.edu/default.aspx">http://www.license.umn.edu/default.aspx</a>. שים לב שלתמונות DIC יש לעתים קרובות מספיק מרקם למעקב אחר זנים. המיקרוביאדים כלולים כדי לשמש כבדיקה על שדות המתח המחושבים. אם מעקב מאמץ ייעשה זה קריטי כי התמונות שהושגו נלקחים באותו מיקום בדיוק, כך התמונות נרשמות. תמונות לא רשומות ייצרו זנים מזויפים.

<ol><li>Grinnell, F., Petroll WM, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+motility+and+mechanics+in+three-dimensional+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices.</a> Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2001).</li>
<li>Sander, E. A., Barocas, V. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSander%2C+EA+%22Biomimetic+collagen+tissues%3A+collagenous+tissue+engineering+and+other+applications.+In%3A+Collagen%3A+Structure+and+Mechanics%22">Biomimetic collagen tissues: collagenous tissue engineering and other applications. In: Collagen: Structure and Mechanics</a>. , Springer. New York. (2008).</li>
<li>Pedersen JA,, Swartz MA, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+in+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology in the third dimension.</a> Ann. Biomed. Eng. 33 (11), 1469-1490 (2005).</li>
<li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (3), 1274 (1979).</li>
<li>Guidry, C., Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+mechanism+of+hydrated+collagen+gel+reorganization+by+human+skin+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Studies on the mechanism of hydrated collagen gel reorganization by human skin fibroblasts.</a> J. Cell. Sci. 79 (1), 67-81 (1985).</li>
<li>Fluck, J., Querfeld, C., Cremer, A., Niland, S., Krieg, T., Sollberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+human+primary+fibroblasts+undergo+apoptosis+in+three-dimensional+contractile+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Normal human primary fibroblasts undergo apoptosis in three-dimensional contractile collagen gels.</a> J. Invest. Dermatol. 110 (2), 153-157 (1998).</li>
<li>Rosenfeldt, H., Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+quiescence+and+the+disruption+of+ERK+signaling+in+mechanically+unloaded+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fibroblast quiescence and the disruption of ERK signaling in mechanically unloaded collagen matrices.</a> J. Biol. Chem. 275 (5), 3088-3092 (2000).</li>
<li>Nakagawa, S., Pawelek, P., Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+fibroblasts+in+contracted+collagen+gels%3A+Effects+on+cell+growth+and+biosynthetic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of fibroblasts in contracted collagen gels: Effects on cell growth and biosynthetic activity.</a> J. Invest. Dermatol. 93 (6), 792-798 (1989).</li>
<li>Harris, A. K., Stopak, D., Wild, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+traction+as+a+mechanism+for+collagen+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fibroblast traction as a mechanism for collagen morphogenesis.</a> Nature. 290, 249-251 (1981).</li>
<li>Stopak, D., Harris AK, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connective+tissue+morphogenesis+by+fibroblast+traction%3A+I.+tissue+culture+observations%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Connective tissue morphogenesis by fibroblast traction: I. tissue culture observations.</a> Dev. Biol. 90 (2), 383-398 (1982).</li>
<li>Sawhney, R. K., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+local+movements+of+collagen+fibers+by+fibroblasts+drive+the+rapid+global+self-organization+of+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Slow local movements of collagen fibers by fibroblasts drive the rapid global self-organization of collagen gels.</a> J. Cell. Biol. 157 (6), 1083-1092 (2002).</li>
<li>Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+guidance+mediated+three-dimensional+cell+migration+is+regulated+by+rho%2FROCK-dependent+matrix+reorganization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by rho/ROCK-dependent matrix reorganization.</a> Biophys. J. 95 (11), 5374 (2008).</li>
<li>Sander, E., Barocas, V., Tranquillo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+fiber+alignment+pattern+alters+extracellular+matrix+synthesis+in+fibroblast-populated+fibrin+gel+cruciforms+and+correlates+with+predicted+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension.</a> Ann. Biomed. Eng. 39 (2), 714-729 (2011).</li>
<li>Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anisotropic+biphasic+theory+of+tissue-equivalent+mechanics%3A+the+interplay+among+cell+traction%2C+fibrillar+network+deformation%2C+fibril+alignment%2C+and+cell+contact+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance.</a> J. Biomech. Eng. 119, 137-146 (1997).</li>
<li>Neidert, M. R., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+valves+with+commissural+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered valves with commissural alignment.</a> Tissue Eng. 12 (4), 891-903 (2006).</li>
<li>Robinson PS,, Robinson PS, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+biaxial+behavior+of+fibrin-based+tissue-engineered+heart+valve+leaflets%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Planar biaxial behavior of fibrin-based tissue-engineered heart valve leaflets.</a> Tissue Eng. Part A. 15 (10), 2763-2772 (2009).</li>
<li>Grassl, E., Oegema, T., Tranquillo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+as+an+alternative+biopolymer+to+type+I+collagen+for+the+fabrication+of+a+media+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Fibrin as an alternative biopolymer to type I collagen for the fabrication of a media equivalent.</a> J. Biomed. Mater. Res. 60 (4), 607-612 (2002).</li>
<li>Paten, J. A., Zareian, R., Saeidi, N., Melotti, S. A., Ruberti, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+performance+of+an+optically+accessible%2C+low-volume%2C+mechanobioreactor+for+long-term+study+of+living+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Design and performance of an optically accessible, low-volume, mechanobioreactor for long-term study of living constructs.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17 (7), 775-788 (2001).</li>
<li>Ye KY,, Sulli van KE,, Black LD, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+cardiomyocytes+in+a+fibrin+hydrogel+for+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of cardiomyocytes in a fibrin hydrogel for cardiac tissue engineering.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li>
<li>Ahmann, K. A., Weinbaum, J. S., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+degradation+enhances+vascular+smooth+muscle+cell+proliferation+and+matrix+deposition+in+fibrin-based+tissue+constructs+fabricated+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Fibrin degradation enhances vascular smooth muscle cell proliferation and matrix deposition in fibrin-based tissue constructs fabricated in vitro.</a> Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3261-3270 (2010).</li>
<li>Raghupathy, R., Witzenburg, C., Lake, S. P., Sander, E. A., Barocas, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+regional+mechanical+anisotropy+in+soft+tissue+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">Identification of regional mechanical anisotropy in soft tissue analogs.</a> J. Biomech. Eng. 133, (2011).</li>
<li>Robinson, P. S., Johnson, S. L., Evans, M. C., Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+tissue-engineered+valves+from+cell-remodeled+fibrin+with+commissural+alignment+of+cell-produced+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Functional tissue-engineered valves from cell-remodeled fibrin with commissural alignment of cell-produced collagen.</a> Tissue Eng. Part A. 14 (1), 83-95 (2008).</li>
<li>Gabbiani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myofibroblast+in+wound+healing+and+fibrocontractive+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">The myofibroblast in wound healing and fibrocontractive diseases.</a> J. Pathol. 200 (4), 500-503 (2003).</li>
<li>PaszeK, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li>
<li>Grinnell, F., Rocha L, B., Iucu, C., Rhee, S., Jiang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nested+collagen+matrices%3A+A+new+model+to+study+migration+of+human+fibroblast+populations+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Nested collagen matrices: A new model to study migration of human fibroblast populations in three dimensions.</a> Exp. Cell. Res. 312 (1), 86-94 (2006).</li>
<li>Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differential+regulation+of+cell+motile+activity+through+matrix+stiffness+and+porosity+in+three+dimensional+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices.</a> Biomaterials. 31 (25), 6425-6435 (2010).</li>
<li>Wakatsuki, T., Kolodney MS,, Zahalak GI,, Elson EL, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics+studied+by+a+reconstituted+model+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics studied by a reconstituted model tissue.</a> Biophys. J. 79 (5), 2353-2368 (2000).</li>
<li>De Jesus, A., Aghvami, M., Sander, E. Fibroblast-mediated fiber realignment in fibrin gels. ASME Summer Bioengineering Conference, 2013 Jun 26-29, Sunriver, OR, , (2013).</li>
<li>Aghvami, M., Barocas, V. H., Sander, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+mechanical+simulations+of+cell+compacted+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">Multiscale mechanical simulations of cell compacted collagen gels.</a> J. Biomech. Eng. 135, (2013).</li>
</ol>

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

פרוטוקול זה פותח לצורך התבוננות וכימות המכניקה המעורבת בשיפוץ ECM בתיווך תאים. תהליכים כאלה ביסוד מספר תופעות ביולוגיות ויש להם השלכות חשובות על רקמות הנדסיות2,22, הפחתת צלקת1,23, והבנת רקמות פתולוגיות שיפוץ12,24. השימוש במיקרוסקופיה DIC לשגות זמן מאפשר אחד לפתור ולכמת את התזוזה והיישור של סיבי פיברין המתרחשת כתוצאה של כוחות המתיחה התא. הארגון מחדש שנצפה כאן הוא השלב הראשון של תהליך השיפוץ, והוא עוקב אחר הדפוסים הארגוניים שנצפו בקולגן11. ארגון מחדש מלווה בשילוב של השפלת פיברין ...

כלי חשוב לחקר אינטראקציות מטריצת תאים הוא ג'ל קולגן מאוכלסבתאים 1,2. הג'ל מספק סביבה תלת מימדית הקרובה יותר לאופי ה- in vivo של הרקמה ומתאימה יותר להבנת התנהגות התאים מאשר מוצעת על ידי תרביות דו-ממדיות מסורתיות3. מחקרים מוקדמים שבהם פיברובלסטים הופצו באופן הומוגני בתוך ג'ל קולגן מצאו כי התאים מאחדים במהירות את סיבי הקולגן וקומפקטיים את הג'ל4,5. פיברובלסטים התכווצות בג'לים צפים חינם ואז לעבור למצב רגיעה זמן קצר לאחר הג'ל הגיע במלואו קומפקטית1,6,7. הפיברובלסטים בג'לים המוגבלים בגבולות נשארים במצב פעיל וסינתטי8 והם יוצרים יישור סיבים באופן התלוי בגיאומטריית ג'ל ואילוצים חיצוניים5,9. נראה כי ההבדלים בפעילות התאים הם תוצאה של המתח הפנימי (או היעדרם) המתפתח כאשר התאים מפעילים כוחות גרירה באמצעות אונטגרינים על סיבי הקולגן בג'ל.
גרסה של טכניקה זו כרוכה בהצבת explants fibroblast(כלומר גושים של תאים) מרחק זה מזה בתוך ג'ל קולגן והתבוננות אינטראקציות מטריצת תאים ופיתוח הדרגתי של יישור סיבים בין explants (המכונה לעתים רצועות כמו רצועה)10-12. היתרון העיקרי של מערכת explant הוא שהיא מאפשרת לארגן את התאים לתוך דפוסים גיאומטריים פשוטים, מה שהופך אותו קל יותר לדמיין ולבדוק את המנגנונים הבסיסיים יישור מחדש של סיבים מונחי תאים. דפוסי יישור אלה - התלויים בעיקר בגומלין בין כוחות המתיחה של התא, התפלגות המרחבית של התאים, גיאומטריית הג'ל והאילוצים המכניים על הג'ל - חשובים להבנה משום שהם ממלאים תפקיד מרכזי בארגון הרקמה העולמי, בתפקוד המכני ובסביבה המכנית המקומית13.
בתחום הנדסת רקמות, אסטרטגיה אחת לייצור פונקציונלי מכני, רקמות מהונדסות כרוך בשליטה על דפוס יישור סיבים המתפתחת מדחיסת תאים, כך הרקמה המהונדסת בעל יישור סיבים המחקה את זה של הרקמה המקורית14,15. יישור כזה הוא האמין הכרחי עבור רקמות מהונדסות לשכפל את ההתנהגות המכנית המורכבת של רקמות מקוריות. שינוי באסטרטגיה זו הוא להחליף את ג'ל הקולגן בג'ל פיברין16. ג'ל פיברין מפתח תבנית יישור דומה כמו ג'ל קולגן במהלך דחיסה. עם הזמן הסיברין מתפרק ומוחלף ב- ECM מסונתז לתאים העוקב אחר תבנית יישור סיבי הפיברין הראשונית. המבנה המהונדס וכתוצאה מכך שיפרה באופן משמעותי תכונות מכניות בהשוואה לג'ל קולגן נגזר מבנים17.
תהליך היישור ואירועי השיפוץ הבאים בג'ל פיברין ממשיכים בצורה מורכבת ולא מובנת. כדי לאפיין טוב יותר את האינטראקציות הללו ואת השפעתן על התנהגות התאים ועל שיפוץ ECM, פיתחנו הליך המבוסס על שיטת ההסבר. בשיטה זו, explants fibroblast ממוקמים על ג'ל פיברין בתבניות גיאומטריות שונות. הג'לים מתוחזקים בביוריאקטור18מבוקר על ידי מיקרוסקופ, ותהליך הדחיסה וארגון מחדש של הסיבים מנוטר באמצעות מיקרוסקופיה של הפרעה דיפרנציאלית (DIC). שדות תזוזה מכמתים באמצעות אלגוריתמים מותאמים אישית. לנתונים המתקבלים מניסויים אלה יש השלכות רחבות היקף על מספר תהליכים, כולל אופטימיזציה של אסטרטגיות להנדסת רקמות, שיפור ריפוי פצעים וטיפול בשיפוץ רקמות פתולוגיות.

<table><tbody><tr><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F8630</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T4648</td><td></td><td></td></tr><tr><td>גיבקו</td><td>11965-092</td><td></td><td></td></tr><tr><td>גיבקו</td><td>15140-122</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A2942</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H0887</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>223506</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen</td><td>3000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lonza</td><td>DE14-701F</td><td></td><td></td></tr><tr><td>בדיקות מולקולריות</td><td>F8858</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GIBCO</td><td>A10483-01</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GIBCO</td><td>11430-030</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisher-Scientific</td><td>SS264-1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A3428-25MG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ביו-ריאקטור ביוטנסי</td><td>ADMET</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti-Eclipe מיקרוסקופ</td><td>ניקון</td><td></td><td></td></tr> <tr><td># 0 35 מ"מ צלחת פטרי תחתונה זכוכית</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr><tr><td># 0 35 מ"מ זכוכית עליונה צלחת פטרי</td><td>MatTek</td><td>P35GTOP-0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>אביזרי פלסטיק לואר, צינורות PVC עם קצוות לואר</td><td>Cole-Parmer</td><td>30600-65</td><td></td></tr></tbody></table>

התבוננות וכימות דחיסה של ג'ל פיברובלסט בתיווך פיברין

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

תאים המוטמעים בקולגן ובג'ל פיברין מחברים ומפעילים כוחות גרירה על סיבי הג'ל. כוחות אלה יכולים להוביל לארגון מחדש מקומי וגלובלי ולארגון מחדש של מבנה הג'ל. תהליך זה ממשיך באופן מורכב התלוי בחלקו בגומלין בין מיקום התאים, הגיאומטריה של הג'ל והאילוצים המכניים על הג'ל. כדי להבין טוב יותר כיצד משתנים אלה מייצרים דפוסי יישור סיבים גלובליים, אנו משתמשים במיקרוסקופיית הפרעות דיפרנציאלית (DIC) במרווחים גיאומטריים בשילוב עם ביוריאקטור מבוקר לסביבה כדי לבחון את תהליך הדחיסה בין אקספלנטים במרווחים גיאומטריים (אשכולות של פיברובלסטים). לאחר מכן התמונות מנותחות באמצעות אלגוריתם עיבוד תמונה מותאם אישית כדי להשיג מפות של המתח. ניתן להשתמש במידע המתקבל מטכניקה זו כדי לחקור את המכנוביולוגיה של אינטראקציות שונות של מטריצת תאים, שיש להן השלכות חשובות להבנת תהליכים בריפוי פצעים, פיתוח מחלות ויישומים הנדסי רקמות.

שיפוץ רקמות הוא תהליך מורכב המונע בחלקו על ידי אינטראקציות פיזיות הדדיות בין התאים לבין המטריצה שמסביב. התאים לארגן מחדש את הסיבים שמסביב וליצור מתח ברשת הסיבים. היישור של סיבים וסביבה מכנית בתורו שולט בהתנהגות התא, כך הן תאים מטריצה ברחבי העולם לארגן מחדש כדי לייצר רקמה משופצת. בניסוי זה, תאי האקספלנטים, בתחילה עגולים במורפולוגיה, החלו להתרחב לתוך הג'ל ולהיצמד לסיבי הסיברין(איור 3). התאים הפעילו כוחות גרירה שהתפשטו דרך הג'ל והושרו על ידי יישור סיבים במקביל לציר שבין האקספלנטים. תוך שעות ספורות נראו ה"רצ...

מיקרוסקופיה וטכניקות לעיבוד תמונה שימשו להתבוננות וניתוח של דחיסת ג'ל בתיווך פיברובלסט וארגון מחדש של סיבי פיברין בביוריאקטור מבוקר לסביבה על פני תקופה של 48 שעות.

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

המטרה הכללית של נוהל זה היא לתצפת ולנתח את השפעת האינטראקציות בין התאים למטריקס על סידור מחדש של סיבים ופעילויות של עיצוב מחדש של המטריקס במערכת של ג'ל פיברין. הדבר מושג תחילה על ידי פולימריזציה של ג'ל פיברין תלת-ממדי המכיל מיקרו-בידס (microbeads) על זכוכית כיסוי הממוקמת בתוך ביו-ראקטור עם בקרה סביבתית. השלב השני הוא הכנת תרחיף תאים בריכוז גבוה, המשמש למיקום של מקבצי פיברובלסטים או רסיסי רקמה (explants) של X בתבניות גיאומטריות על פני השטח של הג'ל.בשלב הבא, הדגימה נסרקת בכל 15 דקות באמצעות מיקרוסקופיית ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (differential interference contrast microscopy) לאורך 48 שעות. השלב הסופי הוא מדידת מידת הארגון מחדש והעיצוב מחדש של הפיברין בצורה של מאמץ (strain) מאזורים שונים של הג'ל באמצעות קורלציית תמונות דיגיטלית (digital image correlation). בסופו של דבר, מערכת רקמת השתל (explant) זו מאפשרת לסדר את התאים בתבניות גאומטריות פשוטות, מה שמקל על ויזואליזציה ובחינה של המכניזמים העומדים בבסיס עיצוב מחדש של המטריקס וסידור מחדש של הסיבים המונחים על ידי התאים.שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה המכנית, כגון מהן ההשפעות של רמזים מכניים מרחביים וזמניים על התנהגות התא והשינויים הנובעים מכך במטריצת הרקמה הסובבת. את הפרוצדורה ידגים Arabic de Jesus, סטודנט לתואר מתקדם מ

observing-and-quantifying-fibroblast-mediated-fibrin-gel-compaction

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

וידאו זה מדגים את פרוטוקול ב assay אנגיוגנזה במבחנה כי משחזר שלבים שונים של אנגיוגנזה. זמן לשגות תמונות של הנבטה, היווצרות לומן, הסתעפות ו השקה - התכונות העיקריות של אנגיוגנזה - מוצגים.

אופטימליים הפיברין ג&#39;ל ביד Assay לחקר אנגיוגנזה

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את ניסיוני בטכניקות בשימוש לפברק תואם, תאי המטריצה ​​(ECM) מצעים מצופה מתאים תרבית תאים, ואשר ניתנים במיקרוסקופ כוח המתיחה והתבוננות ההשפעות של קשיחות ECM על התנהגות התא.

הכנת מטריצות תלונה לכימות התכווצות נייד

סרטון זה מציג מיקרוסקופ כמותי בהילוך מהיר להערכת הפצת מונוציטוגנים תלויי קשיחות מטריצה חוץ-תאית באמצעות תאי אנדותל. הידרוג'ל רך יותר מאפשר הפצה מהירה יותר של חיידקים דרך תאי אנדותל בהשוואה לעמיתים נוקשים יותר, ומדגיש את ההשפעה של קשיחות מטריצה על הפצת חיידקים.

מיקרוסקופ כמותי בהילוך מהיר להערכת הפצת חיידקים חוץ-תאיים תלויי קשיחות

מערכת מודל זה מתחילה מג'ל הפיברין myofibroblast-מאוכלס שיכול לשמש כדי לחקור קולגן אנדוגני (מחדש) ארגון בזמן האמת באופן הרסני. מערכת המודל היא מאוד מתכונן, כפי שהוא יכול להיות בשימוש עם מקורות תאים שונים, תוספים בינוניים, וניתן להתאים בקלות לצרכי ספציפיים.

בונה הנדסת רקמות מבוססת הפיברין מmyofibroblasts ויישום של אילוצים ומתח כדי לגרום לתא וקולגן ארגון (בעניין)

בכתב יד זה מוצגות טכניקות ניסיוניות, כולל הכנת דם, מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח קצב ליזה, לבחינת ההבדלים המורפולוגיים בין מבני קרישים נורמליים וחריגים עקב מצבים חולים.

טכניקות ניסיוניות והדמיה לבחינת מבני פיברין קריש בבריאה והחולה הברית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד הפתופיזיולוגיה של רטינופתיה סוכרתית proliferative באמצעות רקמות החולה נגזר, טוחנות בניתוח, fibrovascular לתרבות vivo לשעבר ואפיון רקמות יליד תלת מימדי. Ex-vivo תרבות דגם זה גם לשכנוע בדיקה או לפתח טיפולים חדשים.

מודל תרביות רקמה לשעבר Vivo עבור סיבוכים Fibrovascular Proliferative רטינופתיה סוכרתית

קבלת אוכלוסייה טהורה של פיברותקיעות חיונית כדי ללמוד את תפקידם בתיקון פצעים פיברוזיס. המתואר כאן היא שיטה מפורטת כדי לבודד את הפיברוכדורים ומיוריסותליות מלבבות העכבר שנפגעו ונפצעו ולאחר מכן אפיון הטוהר והפונקציונליות שלהם על ידי immunofluorescence RTPCR, מיון תאים בסיוע פלואורסצנטית, ו התכווצות ג'ל לקולגן.

בידוד ואפיון של מבוגרים ופיברותקיעות לב ומיופיברופיצוצים

השיטה המוצגת כוללת מתיחה חד-אקסיאלית של הידרוג'לים רכים תלת-ממדיים המוטמעים בגומי סיליקון תוך מתן אפשרות למיקרוסקופיה קונפוקלית חיה. אפיון של זני הידרוג'ל חיצוניים ופנימיים, כמו גם יישור סיבים מודגמים. המכשיר והפרוטוקול שפותחו יכולים להעריך את התגובה של תאים למשטרי זנים שונים.

זן מבוקר של הידרוג'ל תלת מימדי תחת הדמיה מיקרוסקופית חיה

מוצג כאן פרוטוקול ליצירת רקמות חיבור מהונדסות לתרבות מקבילה של 48 רקמות בלוח רב-בארות עם מוטות כפולים, המתאימים למחקרים מכאניסטיים, מידול מחלות ויישומי סינון. הפרוטוקול תואם פיברובלסטים מאיברים ומינים שונים ומודגם כאן עם פיברובלסטים לב ראשוניים אנושיים.

פיברובלסט נגזר רקמת חיבור מהונדסת אנושית עבור יישומי הקרנה

מאמר זה מתאר כיצד להדפיס ביו-ממד הידרוג'לים פוטו-ממדיים כדי לחקור התקשות מטריצה חוץ-תאית והפעלת פיברובלסטים.

הדפסה ביולוגית תלת-ממדית הידרוג'לים פוטו-ממדיים לחקר הפעלת פיברובלסטים

מקטע כלי דם סטרומה מבודד מכנית (SVF) בשילוב עם הידרוג'ל פיברין מציע נשאות קלה ויעילה לתאי סטרומה ברי קיימא שמקורם בשומן עבור אינדיקציות שונות, כולל הנדסת רקמות או מטרות ריפוי פצעים. כאן, אנו מציגים את ההכנה של מבנה מכני SVF (mSVF)-פיברין הידרוג'ל למחקר תרגומי ויישום קליני.

השילוב של מקטע כלי דם סטרומה מבודד מכנית והידרוג'ל פיברין: פרוטוקול עיבוד

חקור דחיסת ג'ל פיברובלסט בתיווך פיברין באמצעות מיקרוסקופיה time-lapse לאורך 48 שעות. שיטה זו מאפשרת ניתוח דינמי של שינויי מטריקס ויישור סיבים בתהליכי הנדסת רקמות.

התבוננות וכימות דחיסה של ג'ל פיברובלסט בתיווך פיברין

גלה סרטונים נוספים