Name: הערכה כמותית של אדם נויטרופילים הגירה מעבר מתורבת שלפוחית השתן האפיתל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-07T19:40:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: חקור מודל מעבדתי להערכת נדידת נויטרופילים אנושיים דרך אפיתל שלפוחית השתן בתגובה לזיהום חיידקי או מוליכים כימיים. שיטה זו מאפשרת הבנה מעמיקה של תגובות דלקתיות בזיהומי מערכת השתן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מענקי R01-DK080752 וP50-DK064540. אנו מודים לג&#39; Loughman על מאמציה בהקמת assay זה.

1. Culturing 5637 תאי אפיתל שלפוחית ​​השתן בצע את השלבים הבאים במכסת מנוע רקמות תרבות זרימה למינרית מוכנה עם קרינת UV וניגב את עם 70% אתנול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדיום RPMI-1640 מכיל 10% בסרום שור העובר (FBS) [+ RPMI כינה], מסנן לעקר באמצעות מסנן 0.22 גודל נקבובית מיקרומטר, וחם ל37 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר cryovial של 5637 תאים (אמריקאי סוג תרבות אוסף HTB-9; נגזר מקרצינומה של שלפוחית ​​השתן) באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. במהירות להעביר את התאים מופשרים בבקבוק תרבית רקמה 75 2 סנטימטר המכיל 20 מיליליטר RPMI +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הבקבוק על 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified עם 5% CO 2 עד לתאים ומחוברות כ 95% (~ 6 x 10 6 תאים לכל בקבוק), כ -4 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתת 5637 תאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא את המדיה מהבקבוק. לשטוף את התאים עם פוספט שנאגר סאלין של 10 מיליליטר Dulbeccoדואר (DPBS) בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 6 מיליליטר טריפסין החם (37 מעלות צלזיוס) 0.05%, 0.02% פתרון EDTA לבקבוק, ולדגור על 37 ° C עם 5% CO 2 למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את תאי צינור 15 מיליליטר חרוטי, וגלולה ידי צנטריפוגה ב XG 300 למשך 5 דקות. הסר את פתרון טריפסין / EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי 6 מיליליטר + (10 6 תאים / מיליליטר), ומיליליטר RPMI העברה 1 (10 6 תאים) ל75 סנטימטר 2 בקבוק חדש המכיל 20 מיליליטר RPMI +. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 1.4 לתת תאים כל 4 ימים או כאשר התאים מגיעים למפגש 95%. </li></ol> 2. זריעה וגידול 5637 על תאים בתומכים חדיר בצע את השלבים הבאים במכסת מנוע בתרבית רקמה באמצעות טכניקת aseptic. לקבלת תוצאות אופטימליות, השתמש 5637 תאים שעברו פחות מ 10 תת תרבות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים סטריליות, להפוך את תומך החדיר בצלחת תרבות רקמות עמוקה 25 מ&quot;מ סטרילי. </li><li&gt; Trypsinize בקבוק 75 2 סנטימטר של 5637 תאים במפגש 95% על פי צעדים 1.4.1-1.4.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה 1,000 μl, בעדינות resuspend התאים ~ 2 מיליליטר RPMI + לריכוז של 3 x 10 6 מיליליטר תאים /, נקבע על ידי תא לספור באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 50 μl של ההשעיה התא (1.5 x 10 5 תאים) לכל תמיכה חדירה בלי לגעת בקרום. מניחים את המכסה על הצלחת, ומניח בזהירות את הצלחת על 37 ° C עם 5% CO 2 למשך לא יותר מ 16 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים סטריליות, נכון תומך החדיר לתוך צלחת 24 גם מכילה 0.6 מיליליטר + RPMI לכל טוב. הוסף 0.1 מיליליטר RPMI + למאגר העליון של כל תמיכה חדירה. לדגור על 37 ° C עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיום כל 2 ימים. ראשית, בינוני לשאוב מהמאגר העליון ואחריו המאגר התחתון, ולאחר מכן להחיל טרי RPMI + בבסדר ההפוך, למאגר התחתון (0.6 מיליליטר) ולאחר מכן העליון reservoir (0.1 מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבעה ימים לאחר זריעה תומכת החדיר עם 5637 תאים, להעריך את המפגש של התאים. למלא את המאגר העליון עם RPMI + (~ 0.35 מיליליטר). התאים במידה מספקת הם מחוברות כאשר המדיום אינו לאזן בין המאגרים העליונים ותחתונים. </li></ol> 3. הכנת הבידוד בקטריאלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות טכניקת aseptic, להוסיף 20 מיליליטר של מרק התרבות המתאים לבקבוק 250 מיליליטר עם מכסה. השתמש במרק לוריא-Bertani (LB) לE. תרבויות coli, ולהוסיף אנטיביוטיקה למרק שבו מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בחיסון לולאת סטרילי, לחסן את המרק עם חיידקים ממניות גליצרול או צלחת פס. לזני UPEC, דגירה תרבות החיידקים ב37 מעלות צלזיוס למשך כ 16 שעות, בלי ללחוץ (כדי לקדם את הייצור של פילים מסוג 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את תרבות החיידקים לצינור צנטריפוגות. גלולה החיידקים על ידי צנטריפוגה ב8,000 XG 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג supernatant, ו resuspend החיידקים בPBS לOD 600 = 1.000, שווה ערך ל ~ 10 9 CFU / מיליליטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור גירוי חיידקים-נהרג חום, דגירה aliquot (למשל ~ 1.5 x 10 8 CFU ב150 μl) של חיידקי resuspended ב55 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. פלייט aliquot של ההשעיה נהרג חום כדי לאשר מות חיידקים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לפני השימוש, לדלל את חיידקי resuspended (לחיות או נהרג חום) של פי 10 ל10 8 CFU / מיליליטר בRPMI סרום ללא חם [RPMI-כינה] בצינור microfuge. </li></ol> 4. בידוד של נויטרופילים אנושיים מהדם היקפי האוסף של דם ממתנדבים מבוגרים דורש ביקורת מראש ואישור מועדת בדיקה מוסדית. ללבוש ציוד מגן אישי מתאים ולהשליך כיאות חומרים מסוכנים, כדי למנוע חשיפה לדם אנושי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 25 מיליליטר של דם ורידים מv הבוגר ובריאolunteer צריך להיגרר ל3 צינורות איסוף דם סטרילית נתרן המכיל הפרין על ידי צוות המיומן בphlebotomy. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חוזקה עוטף את צינורית גומי סביב הזרוע העליונה, מעל המרפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את אתר הכניסה, פוסה antecubital, תוך שימוש באלכוהול 70% סטרילי לנגב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף בעל צינור פלסטיק למערכת מחט פרפר מכונפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט לתוך וריד antecubital בזווית 30 מעלות או פחות, שיפוע כלפי מעלה. המחט ניקבה את וריד כשפרץ של דם מופיע בצינורות הפלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס צינור איסוף דם לתוך מחזיק צינור פלסטיק. כאשר צינור האיסוף הראשון הוא מלא, להחליף עם צינור האיסוף השני. חזור עם הצינור השלישי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר צינור האיסוף השלישי הוא כמחצית מלא, להסיר את חוסם עורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה את האתר לנקב עם כדור צמר גפן סטרילי ולסגת באיטיות את המחט מהווריד. הסט את מגן עליי המחט והמקוםBiohazard na חד מיכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפעיל לחץ על האתר לנקב. כסה את כדור האתר לנקב וכותנה עם תחבושת דביקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להפוך את צינורות איסוף דם כדי לפזר את הפרין. </li></ol></li></ol> בצע את השלבים הבאים במכסת מנוע בתרבית רקמה באמצעות טכניקת aseptic. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה 10 מיליליטר, בעדינות להעביר את הדם לצינור חרוטי טרי, מיליליטר 50 סטרילי. הוסף נפח שווה ערך של 3% (w / v) dextran ב0.9% NaCl ומערבבים על ידי היפוך. דגירה הצינור זקוף בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבלי לשבש את השכבה התחתונה, לשאוב בזהירות את השכבה העליונה ולהעביר אותו לצינור חרוטי 50 מיליליטר חדש. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה XG 300 10 דקות. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה בנפח של .0.9% NaCl שווה להתחלת נפח דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכבת 10 מיליליטר של תמיסת צנטריפוגה צפיפות תחת ההשעיה תא, עמ &#39;שומר את הממשק בין שני השלבים. צנטריפוגה ב XG 400 ל30 דקות עם בלם לא. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לlyse תאי דם אדומים שנותרו, resuspend התא גלולה ב 10 מיליליטר 0.2% קרים NaCl. דגירה במשך 30 שניות, ולאחר מכן מייד להוסיף 10 מיליליטר 1.6% קרים NaCl לשחזר isotonicity. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים על ידי צנטריפוגה XG 300 6 דקות. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 4.6-4.7 עד התא גלולה מופיע להיות חופשי של תאי דם אדומים, בדרך כלל 3 סיבובים של תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה 1,000 μl, resuspend התא גלולה, בעיקר PMN, בחם (37 מעלות צלזיוס) RPMI לריכוז של 10 7 תאים / מיליליטר, שנקבע על ידי תא לספור באמצעות hemocytometer. שמור את התאים על 37 מעלות צלזיוס עד לשימוש. בדרך כלל, כדאיות PMN וטהרה הן&gt; 99% כפי שהוערך על ידי הרחקת trypan הכחולה ויזואליזציה של מורפולוגיה גרעינית לאחר הצביעה, בהתאמה. </li></ol> 5. Transuroepithelial נויטרופילים הגירה כפילומר בצע את השלבים הבאים במכסת מנוע בתרבית רקמה באמצעות טכניקת aseptic. השתמש אך ורק תומך חדיר נושאות שכבות תאים ומחוברות 5637, כפי שנקבע בשלב 2.7. יכולות-RPMI להיות מוכנה 24 גם צלחות המכילות מראש ושמרו על 37 ° C עם 5% CO 2 עד לשימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 1 מ&quot;ל לחמם RPMI לכל גם בצלחת 24 גם; להכין 3 בארות לתמיכה חדירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום מהמאגרים העליונים ותחתונים של תומך החדיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים סטריליות, להעביר את תומך החדיר לצלחת 24 גם מוכנה בשלב 5.1. שטוף את תומך החדיר שלוש פעמים על ידי העברת התמיכות מהיטב היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הבידוד חיידקים הוא לשמש, להפוך תומכת החדיר בצלחת תרבות רקמות עמוקה 25 מ&quot;מ סטרילי. אם chemoattractant (למשל, N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) או IL-8) הוא לשמש, המשך לשלב 5.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניסויים עם bact חי או נהרגגירויי erial, לחסן צד הפסגה של כל תמיכה חדירה עם 60 μl RPMI-(דלקת מדומה) או עם הבידוד החיידקים (6 x 10 6 CFU) מוכן בשלב 3.5. מניחים את המכסה על הצלחת ולדגור על 37 ° C עם 5% CO 2 למשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 0.6 מיליליטר RPMI לכל גם ל24 גם צלחת נמוכה מצורף; להכין 1 גם לתמיכה חדירה. הכן 3 בארות המכילות 0.5 מיליליטר RPMI-למנות קלט PMN. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם chemoattractant נמצאת בשימוש במקום של חיידקים, להוסיף chemoattractant ל0.6 מיליליטר RPMI-בצלחת 24 גם מוכנה בשלב 5.6. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העכבר תומך החדיר לתוך הצלחת נמוכה המצורף 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.1 מיליליטר PMN (10 6 PMN), מוכן בשלב 4.9, למאגר העליון (צד basolateral) של כל תמיכה חדירה. הוספת 100 PMN μl ישירות לבארות המכילות 500 μl RPMI. לדגור על 37 ° C עם 5% CO 2 למשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים סטריליות, בעדינות לגרדהממברנה של התמיכה חדירה כנגד קצה היטב כדי להסיר PMN נוסף מהצד הפסגה ולאחר מכן להשליך את התמיכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף PMN ידי בעדינות מגרד את תחתית היטב כל אחד עם קצה פיפטה 1,000 μl, ולהעביר את מתלי PMN לmicrofuge צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת PMN באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את המספר הכולל של PMN במאגר התחתון, הכפל את מספר PMN ב1 מ&quot;מ 2 (100 NL) על ידי 6,000. ניתן לדווח על הנתונים כאחוז מPMN הקלט, או כמספרי PMN מנורמלים 10 6 PMN קלט. </li></ol>

<ol><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+chamber+in+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Orientation chamber in chemotaxis.</a> Methods Enzymol. 162, 65-72 (1988).</li>
<li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> J. Cell Sci. 99 (Pt. 4), 769-775 (1991).</li>
<li>Chin, A. C., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathobiology+of+neutrophil+transepithelial+migration%3A+implications+in+mediating+epithelial+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury.</a> Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).</li>
<li>Zemans, R. L., Colgan, S. P., Downey, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+migration+of+neutrophils%3A+mechanisms+and+implications+for+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transepithelial migration of neutrophils: mechanisms and implications for acute lung injury.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 40, 519-535 (2009).</li>
<li>Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+human+neutrophil+migration+and+function+by+uropathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Attenuation of human neutrophil migration and function by uropathogenic bacteria.</a> Microbes Infect. 13, 555-565 (2011).</li>
<li>Lau, M. E., Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YbcL+of+uropathogenic+Escherichia+coli+suppresses+transepithelial+neutrophil+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">YbcL of uropathogenic Escherichia coli suppresses transepithelial neutrophil migration.</a> Infect. Immun. 80, 4123-4132 (2012).</li>
<li>Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+indoleamine+2%2C3-dioxygenase+by+uropathogenic+bacteria+attenuates+innate+responses+to+epithelial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase by uropathogenic bacteria attenuates innate responses to epithelial infection.</a> J. Infect. Dis. 205, 1830-1839 (2012).</li>
<li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+of+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Urol%22%5BJournal%5D)">The epidemiology of urinary tract infection.</a> Nat. Rev. Urol. 7, 653-660 (1038).</li>
<li>Haraoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+recruitment+and+resistance+to+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Neutrophil recruitment and resistance to urinary tract infection.</a> J. Infect. Dis. 180, 1220-1229 (1999).</li>
<li>Billips, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+host+innate+immune+response+in+the+bladder+by+uropathogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Modulation of host innate immune response in the bladder by uropathogenic Escherichia coli.</a> Infect. Immun. 75, 5353-5360 (2007).</li>
<li>Bozeman, P. M., Learn, D. B., Thomas, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+the+human+leukocyte+enzymes+myeloperoxidase+and+eosinophil+peroxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Assay of the human leukocyte enzymes myeloperoxidase and eosinophil peroxidase.</a> J. Immunol. Methods. 126, 125-133 (1990).</li>
<li>Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+neutrophil+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro neutrophil transepithelial migration.</a> Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).</li>
<li>Säve, S., Mohlin, C., Vumma, R., Persson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+adenosine+A2A+receptors+inhibits+neutrophil+transuroepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Activation of adenosine A2A receptors inhibits neutrophil transuroepithelial migration.</a> Infect. Immun. 79, 3431-3437 (2011).</li>
<li>Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+induces+transuroepithelial+neutrophil+migration+by+an+intercellular+adhesion+molecule-1-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism.</a> Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).</li>
<li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A murine model of urinary tract infection.</a> Nat. Protoc. 4, 1230-1243 (2009).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

באמצעות קו תרבותי אפיתל שלפוחית ​​תא וPMN אדם המבודד טרי, הקמנו מודל במבחנה של הגירת נויטרופילים transuroepithelial. מודל זה כבר סייע במתחיל לנתח את המורכבות של התגובה החיסונית המולדת בדלקת בדרכי שתן (UTI), זיהום חיידקים נפוץ מאוד שנגרם בדרך כלל על ידי 9 UPEC. במהלך הזיהום של שלפוחית ​​השתן, או דלקת בשלפוחית ​​השתן, גיוס של PMN ללומן שלפוחית ​​השתן הוא חיוני לסילוק חיידקים 10. כדי לבסס דריסת רגל בפרצוף של תגובה דלקתית, UPEC לעכב את הגעתו של PMN לשלפו...

התנועה של תאים בכל הגוף, לעתים קרובות על פני מרחקים ארוכים, נדרשת לצמיחה והתפתחות, ריפוי פצעים, ותגובה חיסונית. נדידת תאים היא מורכבת ודורשת התיאום של תהליכים רבים ושונים, כוללים מפלי איתות והסידור מחדש של רכיבי cytoskeletal. תאים יכולים לנוע באופן אקראי (chemokinesis), כמו גם לכיוון הדרגתיים מוגדר כימי (chemotaxis). טכניקות רבות פותחו ללמוד נדידת תאים במבחנה. הטכניקה העתיקה ביותר והנפוצה ביותר, קאמרי בוידן, מורכב ממערכת שתי קאמרית אנכית שבו חומר chemoattractant ממוקם בתא והתאים של עניין התחתון ממוקמות בתא העליון 1. התנועה של תאים על פני המסנן החדיר, עם נקבוביות בגודל מוגדר, בין שני התאים היא תחת פיקוח. טכניקות נוספות פותחו כדי לחקור את נדידת תאים, כוללים תא זיגמונד 2 וקאמרי דאן3. גישות קולקטיביות אלו הניבו תובנה משמעותית לתנועה של תאים מסוגים רבים ושונים. בנוסף לחקירה את העקרונות הבסיסיים של chemokinesis וchemotaxis, מבחני שני קאמריים הקלו החקירה של נדידת תאים באמצעות רכיבי מטריצה ​​תאיים ושני שכבות תאי אנדותל ואפיתל. יתרון של מערכות שתי קאמריות על פני שיטות אחרות הוא שהקרום הנקבובי יכול להיות מצופה עם חלבונים כגון קולגן או פיברינוגן, ונדידת תאים על פני מחסום כמו מטריקס-תאי ניתן להעריך. בנוסף, ניתן לגדל שורות תאים בתרבית ומובחנות על תומך החדיר. כדי לחקור את התנועה של תאים על פני מכשול אנדותל, תאי אנדותל בתרבית הם זורעים וגדלו במאגר העליון של תומך החדיר. תאי ניעתי, כגון תאים חיסוניים, מתווספים למאגר וההגירה העליונים למאגר התחתון ברחבי enמחסום dothelial בכיוון הקודקוד לbasolateral הפיזיולוגי הוא ציין. מודל זה כבר לא יסולא בפז בהבנת extravasation של תאים חיסוניים מחוץ לזרם הדם. בניגוד לtransendothelial הגירה, התנועה של תאים על פני מחסום האפיתל מתרחשת בדרך כלל בכיוון basolateral לפסגה. על מנת לבנות מודל אירועים אלה במבחנה, חוקרי הזרעים ולגדל תאי אפיתל בתרבית בחלק התחתון של תומך החדיר. תאי ניעתי מתווספים למאגר העליון וההגירה על פני מחסום אפיתל, המייצג את כיוון basolateral לפסגה, הוא תחת פיקוח. מודלים כאלה של הגירת transepithelial תרמו באופן משמעותי להבנה של תגובות דלקתיות במשטחים הריריים, במיוחד אלו של הריאות ובטן 4,5 שלנו. בניגוד לכך, סחר בתא חיסון דרך האפיתל של דרכי השתן זכה להרבה פחות תשומת לב. כדי לקדם את understanding של תגובות חיסוניים מולדים בדרכי השתן במהלך זיהום בחיידקי Escherichia uropathogenic (UPEC), פיתחנו assay במבחנה, assay הגירת נויטרופילים transuroepithelial, המאפשר חקירה של ויקוציטים polymorphonuclear (PMN; נויטרופילים) תנועה על פני מחסום האפיתל בשלפוחית ​​השתן 6 -8. כמו בדגמים שני קאמריים אחרים של הגירת transepithelial, תאי שלפוחית ​​השתן אנושיים בתרבית האפיתל גדלים על החלק התחתון של תמיכה חדירה ויוצרים שכבות אפיתל ומחוברות. נויטרופילים אנושיים, מבודדים מהדם ורידים, מוחלים על צד basolateral של שכבת האפיתל, והגירה על פני האפיתל בכיוון basolateral לפסגה הרלוונטי מבחינה פיזיולוגית היא לכמת בתגובה לזיהום עם זנים שונים של א coli או הנוכחות של מולקולות chemoattractant. מחקרים רבים שהתמקדו בתנועת נויטרופילים, שניהם chemokinesis וchemotaxis, בהעדר סוגים נוספים של תאים. Assay הגירת נויטרופילים transuroepithelial הוא יתרון כפי שהוא לוקח בחשבון את יחסי גומלין מורכבים בין תאי אפיתל שלפוחית ​​השתן ותאי מערכת החיסון בזיהום. יש מודל צייתן זה במבחנה את הפוטנציאל כדי לאפשר את החקירה מפורטת של תגובות חיסוניים במשטחי uroepithelial.

<table><tbody><tr><td>תוספות Transwell (כלומר&nbsp; תומכים חדירים )</td><td>קורנינג</td><td>3472</td><td>6.5 מ"מ, 3 &mu; m נקבוביות, פוליאסטר ממברנה להכניס</td></tr><tr><td>BD Vacutainer צינורות איסוף דם</td><td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td> <td>366480</td><td>16 מ"מ x 100 מ"מ x 10 מ"ל צינורות כובע ירוק המכילים נתרן הפרין</td></tr><tr><td>BD Safety-Lok איסוף ועירוי דם</td><td>סט Becton, Dickinson and Company (BD)</td><td>367281</td><td>21 גרם x 0.75 במחט x 12 בצינורות</td></tr><tr><td>BD Vacutainer לשימוש חד פעמי, מחזיק שאינו ניתן לערום</td><td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td><td>364815</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4876</td><td>מ-Leuconostoc mesenteroides</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS פתרון צנטריפוגה בצפיפות</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>לוחות חיבור נמוכים במיוחד</td><td>Corning</td><td>3473</td><td>24-well, תחתית שטוחה</td></tr> <tr><td>שקופהN-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3506</td><td>שוחזר ב-DMSO ל-10 מ"מ</td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי CXCL8/IL-8</td><td>R& D Systems</td><td>208-IL</td><td>שוחזר ב-PBS ל-100 &mu; גרם/מ"ל</td></tr></tbody></table>

הערכה כמותית של אדם נויטרופילים הגירה מעבר מתורבת שלפוחית ​​השתן האפיתל

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

הגיוס של תאי מערכת החיסון מהפריפריה לאתר של דלקת הוא צעד חיוני בתגובה החיסונית המולדת בכל משטח הרירי. במהלך הזיהום של שלפוחית ​​השתן, כדוריות דם לבנות polymorphonuclear (PMN; נויטרופילים) נודדים ממחזור הדם ולעבור את אפיתל שלפוחית ​​השתן. כישלון לפתור את הזיהום בהעדר תגובת neutrophilic מדגים את החשיבות של PMN בהגנה על שלפוחית ​​השתן. כדי להקל על קולוניזציה של אפיתל שלפוחית ​​השתן, Escherichia coli uropathogenic (UPEC), הסוכן סיבתי של רוב הדלקות בדרכי שתן (זיהומים בדרכי השתן), לדכא את התגובה הדלקתית חריפה באמצעות מגוון של מנגנונים שהוגדרו באופן חלקי. כדי לחקור את יחסי הגומלין בין המארח ופתוגן חיידקים נוסף, פיתחנו מודל במבחנה של היבט זה של התגובה החיסונית המולדת לUPEC. ב assay הגירת נויטרופילים transuroepithelial, וריאציה על חדר בוידן, epith שלפוחית ​​השתן בתרביתתאי elial גדלים למפגש בחלק התחתון של תמיכה חדירה. PMN מבודדים מהדם ורידי אדם ומוחל על צד basolateral של שכבות תאי אפיתל שלפוחית ​​השתן. הגירת PMN המייצגת את כיוון basolateral לפסגה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית בתגובה לזיהום חיידקים או מולקולות chemoattractant נפקדת באמצעות hemocytometer. מודל זה יכול לשמש כדי לחקור אינטראקציות בין UPEC ותאי אוקריוטים כמו גם לחקור את הדרישות מולקולריות לחציית האפיתלים שלפוחית ​​השתן על ידי PMN. מודל נדידת נויטרופילים transuroepithelial יהיה לקדם את ההבנה של התגובה הדלקתית הראשונית לUPEC בשלפוחית ​​השתן שלנו.

Assay הגירת נויטרופילים transuroepithelial מאפשר הערכה כמותית של הגירת PMN האנושי על פני שכבות תאי אפיתל שלפוחית ​​השתן בתרבית בתגובה לגירויים שונים (איור 1). בעוד הפרוטוקול הוא פשוט, יש מספר משתנה שיכול להשפיע על הגירת PMN וכתוצאה מכך משפיעה על שחזור של assay זה. יש לנקוט אמצעים בעת ההכנה תומכת החדיר וPMN להפחית שונות בין משכפל הטכני וביולוגי. לדוגמא, יש להשתמש רק תומך חדיר המכילים שכבות תאים מספיק מחוברות 5637 בניסוי. מפגש של 5637 התאים נבחנים באמצעות assay פונק...

פיתחנו מודל במבחנה המחקה מרכיב חשוב בתגובה הדלקתית החריף במהלך הזיהום של שלפוחית ​​השתן עם חיידקי Escherichia uropathogenic. Assay הגירת נויטרופילים transuroepithelial מאפשר הערכה כמותית של הגירת נויטרופילים אנושיים על פני epithelia שלפוחית ​​השתן, בתרבית על תומך חדיר, בתגובה לזיהום חיידקים או חומרי chemoattractant.

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לכמת את רמת נדידת הנוטרופילים דרך מחסום אפיתליאלי של שלפוחית השתן במהלך זיהום חיידקי, או בתגובה למולקולות פיתוי כימי (chemo attractant). מטרה זו מושגת תחילה על ידי גידול של תאי אפיתל של שלפוחית השתן בתרבית עד להגעה למצב של התלכדות (confluence) על תמיכות חדירות. השלב השני הוא הדבקת תאי האפיתל של שלפוחית השתן בחיידקים שונים או הוספת מולקולות פיתוי כימי למכל המקשר התחתון של התמיכות החדירות.בשלב הבא מבודדים נויטרופילים מדם ורידי ומעבירים אותם למאגר העליון של התמכים המאווררים. השלב הסופי הוא ספירת הנויטרופילים במאגר התחתון לאחר שעה אחת באמצעות המוציטומטר. בסופו של דבר, מערך בדיקה של נדידת נויטרופילים דרך אפיתל משמש להערכת הבדלים בנידידת נויטרופילים המושרת על ידי גירויים שונים.אף ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי היבטים של התגובה החיסונית המולדת במהלך זיהום בדרכי השתן, ניתן להשתמש בה גם לחקירת מחלות אחרות, כולל זיהומים חיידקיים המתרחשים במשטחי רירית אחרים. בצעו הליך זה במC-hood לתרביות רקמה תוך שימוש בטכניקה סטרילית ובפינצטות סטריליות. הפכו את התומכים המאפשרים מעבר (permeable supports) לתוך צלחת תרביות רקמה סטרילית בעומק 25 מילימטר.לקבלת תוצאות אופטימליות, יש להשתמש בתאי אפיתל של שלפוחית השתן מדגם 5 6 3 7 שעברו פחות מ-10 מעברים של טריפסין. השתמש בבקבוק תרבית של 75 סנטימטר רבוע עם תאי 5 6 3 7 בהסמכה (confluence) של 95% בהתאם לטקסט הכתוב. באמצעות פיפט של 1000 מיקרוליטר, השהה בעדינות את התאים בכשני שני מיליליטר של RPMI פלוס, עד לריכוז של 3 מיליון תאים למיליליטר כפי שנקבע בספירת תאים.בעזרת המו-סייטומטר (hemo cytometer), העבירו 50 µL מתלי suspension התאים לכל תמיכה חדירה (permeable support), תוך הקפדה על אי-מגע עם הממברנה. הניחו את המכסה על הצלחת והכניסו אותה בזהירות לאנקובטור בטמפרטורה של 37 °C ובריכוז של 5% CO2 למשך זמן שאינו עולה על 16 שעות. השתמשו בפינצטה סטרילית.הניחו את התומכים החדירים (permeable supports) לתוך פלטת 24 בארות המכילה 0.6 milliliters של RPMI plus לכל באר. הוסיפו 0.1 milliliters של RPMI plus למאגר העליון של כל תומך חדיר לפני הדגירת הפלטה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עם 5%CO2. החליפו את המצע מדי יומיים על ידי שאיבת המצע מהמאגר העליון, ולאחר מכן מהמאגר התחתון.לאחר מכן, יש להוסיף RPMI טרי בסדר הפוך, על ידי הוספת 0.6 milliliters למאגר התחתון ולאחר מכן 0.1 milliliters למאגר העליון. שבעה ימים לאחר זריעת התאים 5 6 3 7 על התמיכות המאווררות, יש להעריך את התכנסות התאים (confluence) על ידי מילוי המאגר העליון ב-0.35 milliliters של RPMI.בנוסף, התאים נחשבים למספיק סמיכים (confluent) כאשר המצע אינו מאזן בין המאגרים העליון והתחתון. הכינו את האינוקולום החיידקי ואספו דם ממתנדבים מבוגרים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, בתוך מabilis לתרבית רקמות. השתמשו בפיפטה של 10 מיליליטר כדי להעביר בעדינות את הדם לפקעת קונוסית סטרילית נקייה של 50 מיליליטר.הוסיפו כמות שקולה של 3% dextran ב-0.9% Sodium chloride. דגרו את המבחנה במצב אנכי בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות, ללא הפרעה לשכבה התחתונה. שאבו בזהירות את השכבה העליונה והעבירו אותה למבחנה קונית חדשה של 50 מילילטר.שקיעו את התאים על ידי סנטריפוגה ב-300 ×g למשך 10 דקות; לאחר הסנטריפוגה, השליכו את הנוזל העליון (supernatant). השעיכו את משקע התאים בנפח של 0.9% sodium chloride השווה לנפח הדם ההתחלתי. לאחר מכן, שכבו 10 מיליליטר של תמיסה לסנטריפוגת צפיפות מתחת לתשעיה של התאים.תוך שמירה על הממשק בין שני השלבים, סבב במערך צנטריפוגה ב-400 ×g למשך 30 דקות ללא בלימה (no break) לפני השליפת של הנוזל העליון (supernatant) כדי ל lysed את תאי הדם האדומים הנותרים. השהה את משקע התאים ב-10 milliliters של 0.2% sodium chloride קר; לאחר דגירה של 30 שניות, הוסף מיד 10 milliliters של 1.6% sodium chloride קר כדי להחזיר את האיזוטוניות. השק את התאים על ידי סבב בצנטריפוגה ב-300 ×g למשך שש דקות והסר את הנוזל העליון. חזור על שלבים אלו עד שמשקע התאים נראה נקי מתאי דם אדומים.בדרך כלל מבצעים שלושה סבבים של ליזיס באמצעות פיפטה של 1000 µL. השהו את משקע התאים, בעיקר לוקוציטים פולימורפוניוקליאריים (PMN), ב-RPMI minus חמים עד לריכוז של 10 מיליון תאים ל-mL, כפי שנקבע על ידי ספירת תאים באמצעות המוציטומטר. שמרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C עד לשימוש.בדרך כלל, החיות והטוהר של pm n גבוהים מ-99%, כפי שהוערכו באמצעות דחיית trypan blue והדמיה של המורפולוגיה הגרעינית לאחר צביעה, בהתאמה. עבור בדיגת הנדידה, השתמשו רק בתמיכות חדירות הנושאות שכבות תאים סמיכות (confluent) של 5 6 3 7.הוסיפו 1 mL של RPMI warm לכל באר. בלוח של 24 בארות, בהכנה של שלוש בארות לכל תמיכה חדירה (permeable support), שאבו את המצע מהמאגרים העליונים והתחתונים של התמיכות החדירות באמצעות פינצטה סטרילית. העבירו את התמיכות החדירות ללוח 24 הבארות ושטפו את התמיכות החדירות שלוש פעמים על ידי העברתן מבאר לבאר.במידה ויש להשתמש באינוקולום חיידקי, העבירו את התמיכות החדירות (permeable supports) למצב הפוך בתוך צלחת לתרבית רקמות סטרילית בעומק 25 מילימטר. עבור ניסויים עם גירויי חיידקים חיים או הרוגים, החדירו לצד האפיקלי של כל תמיכה חדירה 60 µL של RPMI עבור זיהום דמה (mock infection), או את האינוקולום החיידקי שהוכן. הניחו את המכסה על הצלחת והדגירו בטמפרטורה של 37 °C עם 5% CO2 למשך שעה אחת.לאחר מכן, הוסיפו 0.6 מיליליטר של RPMI minus לכל באר בלוח של 24 בארות בעל הידבקות נמוכה. הכינו באר אחת עבור כל תמיכה חדירה. הכינו שלוש בארות המכילות 0.5 מיליליטר של RPMI minus לצורך ספירה של כמות ה-PMN שהוכנסה.לחלופין, אם נעשה שימוש במשיך כימי במקום בחיידקים, הוסיפו את המשיך הכימי ל-0.6 milliliters של RPMI minus בתוך פלטת 24 הבארים שהוכנה. השלב הבא עבור שני הניסויים הוא להכניס את התמיכות המאפשרות חדירה (permeable supports) לתוך פלטת 24 הבארים עם ההיצמדות הנמוכה (low attachment plate). לאחר מכן, הוסיפו 0.1 milliliters של PMN שהוכן למכל העליון של כל תמיכה מאפשרת חדירה.הוסיפו 0.1 מיליליטר של PMN ישירות לבאריים המכילים 0.5 מיליליטר של RPMI minus והדגרימו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2 למשך שעה אחת. באמצעות פיפט של 1000 מיקרוליטר, שטפו את הצד התחתון של ממבנה הממברנה של התמיכה חדירה (permeable support) באמצעות מצע מהמאגר התחתון בעזרת פינצטה סטרילית, תוך גירוד עדין של הממברנה כנגד דופן הבאר.כדי להסיר PMN נוספים מהצד האפpeekלי, אספו את ה-PMN על ידי גירוד עדין של תחתית כל באר באמצעות טיפ של פיפט של 1000 microliter. העבירו את תרחיפי ה-PMN למבחנות מיקרו-צנטריפוגה. ספרו את ה-PMN באמצעות המוציא דם (hemo cytometer) כדי לחשב את המספר הכולל של PMN במאגר התחתון.הכפילו את מספר ה-PMN במילימטר רבוע אחד ב-6,000. ניתן לדווח על הנתונים כאחוז מכלל ה-PMN שהוכנסו או כמספרי PMN מנורמלים ל-10⁶. היצמדות של ה-PMN שהוכנסו לפרוטוקול המתואר בסרטון זה, תוך תשומת לב לפרטים, מאפשרת את ספירת נדידת ה-PMN בתגובה לגירויים, כולל חיידקים וחומרים כימואטרקטיביים, או זיהום עם זן E. coli לא פתוגני MG 1655.חשיפה ל-MG 1655 שהורג בחום או למוטציה של PEC מעוררת הגירה של pm n משמעותית יותר מאשר זיהום דמה (mock infection) או זיהום עם זן pec הפראי UTI 89, בידוד של ציסטיטיס. הוספת חומרים מושכי כימותרפיים (chemo attractants), FMLF או IL 8 למאגר התחתון, מובילה לרמות גבוהות משמעותית של PM והגירה מאשר טיפול דמה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להעריך הגירה של נויטרופילים דרך מחסום אפיתלי בתגובה לגירויים כימוטקטיים.

quantitative-assessment-human-neutrophil-migration-across-cultured

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מתארים פרוטוקול של מיקרוסקופיה brightfield intravital למדידת דינמי נויטרופילים-אנדותל האינטראקציות התא במהלך לגיוס נויטרופילים בתגובה מקור chemoattractant נויטרופילים in vivo. זחילה נויטרופילים intraluminal, הגירה chemotaxis transendothelial ו ברקמת השריר cremaster העכבר הם דמיינו עם הצילום בזמן שחלף וידאו מעקב עם ImageJ.

מעקב זחילה Intraluminal נויטרופילים, הגירה Chemotaxis Transendothelial ועל רקמות על ידי מיקרוסקופית וידאו Intravital

מאמר זה מתאר 1 נוהל בידוד לתאי אנדותל אנושיים מן הוורידים הטבור ולאחר מכן מראה כיצד להשתמש בתאים אלו כדי לבחון גלגול נויטרופילים בתנאי זרימה. באמצעות תא בנפח נמוך זרימת עשוי פולימר עם מאפיינים אופטיים של הזכוכית, חי תאים הדמיה הניאון של אוכלוסיות תאים נדירות הוא גם אפשרי.

בידודו של האדם וריד טבורי תאים אנדותל והשימוש בהם לחקר גלגול נשמות נויטרופילים בתנאי זרימה

דבקות נויטרופילים לאנדותל מופעל באתרים של זיהום היא מרכיב בלתי נפרד של התגובה הדלקתית של המארח. שתואר בדוח זה הוא assay מחייב נויטרופילים...

כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

אנו מציגים vivo לשעבר assay נדידת תאים המאפשר כימות מדויק של פוטנציאל נדידת תאי רכס העצבי enteric בנוכחות של גורמי גדילה שונים.

Assay נדידת תאים כמותיות לMurine אבות עצביים enteric

נדידת חיידקים טרנס-אפיתל נויטרופילים בתגובה לזיהום חיידקי ריר תורמת לפגיעה באפיתל ומחלות קליניות. פותח מודל במבחנה המשלב פתוגן, נויטרופילים אנושיים ושכבות תא אפיתל אנושיות מקוטבות הגדלות על מסנני טרנסוול כדי להקל על חקירות לקראת פענוח המנגנונים המולקולריים המתזמרים תופעה זו.

במבחנה Coculture Assay כדי להעריך פתוגן המושרה נדידת נויטרופילים טרנס אפיתל

פרוטוקול זה מפרט assay נועד למדוד chemotaxis נויטרופילים אדם מטיפה אחת של דם מלא עם שחזור חזק. גישה זו עוקפת את הצורך בהפרדת נויטרופילים ודורשת זמן הכנת assay רק כמה דקות. שבב microfluidic מאפשר למדוד החוזרים ונשנים של chemotaxis נויטרופילים לאורך זמן בתינוקות או יונקים קטנים, שבו נפח דגימה מוגבל.

פלטפורמת microfluidic למדידת נויטרופילים Chemotaxis מדם מלא לא מעובד

כדוריות דם לבנות לחצות את monolayer אנדותל באמצעות paracellular או מסלול transcellular. פיתחנו assay פשוט כדי לעקוב אחר חלוקת junctional אנדוגני VE-cadherin וPECAM-1 במהלך נדידת transendothelial יקוציט תחת זרימה פיזיולוגית להפלות בין שני מסלולי הגלגול.

הדמיה בזמן אמת של תאי תאי צומת האנדותל במהלך נויטרופילים גלגול תחת פיזיולוגית זרימה

מאמר זה מספק את השיטה המפורטת של ביצוע assay chemotaxis נויטרופילי מהיר על ידי שילוב של בידוד שבב נויטרופילי מן הדם כולו ואת הבדיקה chemotaxis על שבב microfluidic יחיד.

שיטה All-on- שבב עבור ניתוח נויטרופילי מהיר Chemotaxis ישירות מתוך ירידה של דם

פרוטוקולים עבור הערכה כמותית של לימפוציטים כימוטקסיס והעברה הן כלי חשוב עבור מחקר באימונולוגיה. . הנה, פרוטוקול במבחנה מתואר כי היתרים בזמן אמת, מרובב הערכה של נדידת תאים, כמו גם משלימים ויוו טכניקה המאפשרת מעקב של תאים מקורית על הטחול.

לכימות מונוציט האנושי כימוטקסיס במבחנה , לימפוציט מאתר סחר In Vivo

כאן, אנו מציגים שלוש שיטות להערכת הגירה נויטרופילים והסתננות הן בvivo והן בתוך מבחנה. שיטות אלה ניתן להשתמש כדי לגלות מבטיח therapeutics פילוח הגירה נויטרופילים.

מזהה הגירה הסתננות של נויטרופילים בעכברים

פרוטוקול זה יוצר מיקרו-מערכים ביוביופית המספקים שורצים בעלי מליטה באמצעות הספפיל. הוא מספק גישה קלה למגשרים כי נויטרופילים שחרור במהלך הגירה ומאפשר ניתוח הדמיה כמותית.

ביו-מאמר מיקרומערכים למיקרוטקטיקה וניתוח מולקולרי של נויטרופילים אנושיים

חקור מודל מעבדתי להערכת נדידת נויטרופילים אנושיים דרך אפיתל שלפוחית השתן בתגובה לזיהום חיידקי או מוליכים כימיים. שיטה זו מאפשרת הבנה מעמיקה של תגובות דלקתיות בזיהומי מערכת השתן.

הערכה כמותית של אדם נויטרופילים הגירה מעבר מתורבת שלפוחית ​​השתן האפיתל

גלה סרטונים נוספים

הערכה כמותית של אדם נויטרופילים הגירה מעבר מתורבת שלפוחית השתן האפיתל