Name: הקמת דגם בניתוח מושרה בעכברים כדי לחקור את תפקיד מגן של progranulin בדלקת מפרקים ניוונית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-25T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: חקור את מודל DMM בעכברים לחקר דלקת מפרקים ניוונית ותפקידו ההגנתי של פרוגרנולין. שיטה זו מאפשרת הערכת נזק מפרקי ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי NIH מענקי מחקר R01AR062207, R01AR061484, R56AI100901, K01AR053210, ומענק מחקר ממוקד מחלה מקרן ראומטולוגיה מחקר (ליו יי).

כל הניתוחים הקשורים לבעלי החיים צריכים להיות מאושר על ידי הטיפול בבעלי חיים ובועדת האתיקה של מוסד המקומי, עם מאמץ שנעשה כדי למזער את כאב ואי נוחות הנגרמת על ידי הניתוח. 1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר C57BL / 6 עכברי זכרים 8-12 שבועות ישנים עם משקל גוף של כ 25 גרם לניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את בעלי החיים באמצעות זריקת intraperitoneal של קוקטייל המכיל גם xylazine (5 מ&quot;ג / קילוגרם) וקטמין (40 מ&quot;ג / קילוגרם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את הברך עם סכיני גילוח, ולאחר מכן בניתוח לעטוף את בעלי החיים ולעקר את האתר כירורגית עם בטאדין ואלכוהול (3x) ולכסות את עיני עכבר עם משחה. </li></ol> 2. תהליך כירורגי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך para-patellar 1 סנטימטר אורך המדיאלי לחשוף את מפרק הברך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את מפרק הברך בעדינות דרך העקירה רוחב של הפיקה ורצועות פיקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את קופסית מפרק הברך אורכיםדרך חתך para-הפיקה המדיאלי בשלב 2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח קופסית מפרק הברך עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את חלקו האחורי של כף רגל אחורית עם יד שמאל, ולבצע עקירה לרוחב של הפיקה ורצועות פיקה עם מלקחיים. החזק את כף הרגל האחורית בעדינות ולוודא כדי למנוע טראומה בכפה. טוב יותר קופסית המפרק מנותחת, יידרש פחות הכוח כדי להפוך את העקירה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפטף מי מלח סטריליים על פני השטח של סחוס במפרק במהלך פעולה, כדי למנוע התייבשות של משטח סחוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך את רצועות meniscotibial המדיאלי המעגנת את המניסקוס המדיאלי לרמת השוקה. הימנע מפגיעה בסחוס מתחת המניסקוס המדיאלי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את המניסקוס המדיאלי אשר מאתר בין condyle המדיאלי של עצם ירך ומישור המדיאלי של עצם השוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את רצועת meniscotibial שמחברת את הצד הלטרלי של המניסקוס המדיאלי עם רוממות intercondylar של שוקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את ההייnd כפה בעדינות עם יד, ולחתוך את רצועות meniscotibial המדיאלי בקפידה על ידי שימוש בלהב כירורגי מס 10. ודא שלא לגרום לפוצעים במפרק סחוס ורצועות אחרות. במקרים רבים, המכסה את כרית השומן צריכה להיות משכה לצד, אבל לא שיש להסירו על מנת לזהות את הרצועה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את קופסית מפרק הברך עם תפר נספג 6-0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את העור עם 6-0 תפר משי. </li></ol> 3. טיפול שלאחר ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחול ירידה של bupivacaine 0.25% אחד באתר כירורגית של כל עכבר כדי למזער את הכאב שלאחר ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את העכברים פעלו בחינם כדי לקבל מים ומזון. </li></ol> 4. ניקוד היסטולוגית של דגם DMM כירורגי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את העכברים בנקודות שצוינו זמן (למשל 4 שבועות, 8 שבועות, ו12 שבועות. כאן אנו הראו תוצאות של 8 שבועות כנציג) לאחר הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מפרקי הברך כולו הם קבועים, decalcified, לפdded ידי פרפין ולאחר מכן נותח באופן סדרתי ב5 מרווח מיקרומטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הגפיים אחוריות שלמים עם מס &#39;10 להבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את העור ושרירים של הגפיים האחורי בזהירות, ולתקן את הדגימות עם PFA 4% במשך 3 ימים בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PFA, ולנקות את הדגימות עם מים. לאחר מכן, decalcify הדגימות בEDTA על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשים את הדגימות בשיפוע אתנול. בפירוט, לשמור את הדגימות באתנול 70% עבור שעה 1, ולאחר מכן לשנות את אתנול ולשמור את הדגימות בסט חדש של 70% אתנול לO / נ לאחר מכן, הכניס את הדגימות ב80% ו90% אתנול כתוצאה מכך, ולשמור אותם לשעה 1, בהתאמה, ואחריו אתנול 100% לO / נ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את אתנול. שמור את הדגימות בoxylene עבור שעה 1, ולעבור לקבוצה חדשה של oxylene. חזור 3x שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את הדגימות לתוך תבנית פרפין באמצעות מרכז הטבעה לייקה. לאחר מכן, הדגימות הם מחולק ב5 מיקרומטר באמצעות microtome סיבובי (לייקה RM2255, גרמניה) ולאחר מכן נאסף על גבי שקופיות זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי sagittal סידוריים נחתכים עבור כל דגימה פורש אזור ממרכז condyle לרוחב למרכז של condyle המדיאלי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים Safranin O מבוצע, ואחריו ניקוד וניתוח סטטיסטי באמצעות שיטת ניקוד OARSI כפי שתואר לעיל 25. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, deparaffinize השקופיות בoxylene, ומימה בשיפוע אתנול למים מזוקקים. לאחר מכן, הם מוכתמים השקופיות דרך ברזל Hematoxylin הפתרון של וייגרט, פתרון 0.05% ירוקים מהיר (FCF), 1% חומצה אצטית פתרון, ו0.1% O פתרון Safranin. הר השקופיות באמצעות מדיום שרף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציון השקופיות המוכתמות Safranin O מבוסס על אובדן proteoglycan (צבע אדום) בסחוס ואחוז ההרס במבנה סחוס, לעשות ניתוח סטטיסטי לציון היסטולוגית. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Herndon, J. H., Davidson, S. M., Apazidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+socioeconomic+trends+in+orthopaedic+practice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Joint+Surg.+Am%22%5BJournal%5D)">Recent socioeconomic trends in orthopaedic practice.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 83, 1097-1105 (2001).</li>
<li>Johnson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stem+cell-based+approach+to+cartilage+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A stem cell-based approach to cartilage repair.</a> Science. 336, 717-721 (2012).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor-2alpha+is+a+catabolic+regulator+of+osteoarthritic+cartilage+destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor-2alpha is a catabolic regulator of osteoarthritic cartilage destruction.</a> Nat. Med. 16, 687-693 (2010).</li>
<li>Glasson, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+active+ADAMTS5+prevents+cartilage+degradation+in+a+murine+model+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Deletion of active ADAMTS5 prevents cartilage degradation in a murine model of osteoarthritis.</a> Nature. 434, 644-648 (2005).</li>
<li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+%28DMM%29+model+of+osteoarthritis+in+the+129%2FSvEv+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthr.+Cart%22%5BJournal%5D)">The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse.</a> Osteoarthr. Cart. 15, 1061-1069 (2007).</li>
<li>Chia, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+2+is+an+intrinsic+chondroprotective+agent+that+suppresses+ADAMTS-5+and+delays+cartilage+degradation+in+murine+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 2 is an intrinsic chondroprotective agent that suppresses ADAMTS-5 and delays cartilage degradation in murine osteoarthritis.</a> Arthritis Rheum. 60, 2019-2027 (2009).</li>
<li>Miller, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR2+chemokine+receptor+signaling+mediates+pain+in+experimental+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">CCR2 chemokine receptor signaling mediates pain in experimental osteoarthritis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20602-20607 (2012).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+central+role+for+complement+in+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of a central role for complement in osteoarthritis.</a> Nat. Med. 17, 1674-1679 (2011).</li>
<li>He, Z., Ong, C. H., Halper, J., Bateman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progranulin+is+a+mediator+of+the+wound+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Progranulin is a mediator of the wound response.</a> Nat. Med. 9, 225-229 (2003).</li>
<li>Bateman, A., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+granulin+gene+family%3A+from+cancer+to+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">The granulin gene family: from cancer to dementia.</a> Bioessays. 31, 1245-1254 (2009).</li>
<li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteinase+3+and+neutrophil+elastase+enhance+inflammation+in+mice+by+inactivating+antiinflammatoryprogranulin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Proteinase 3 and neutrophil elastase enhance inflammation in mice by inactivating antiinflammatoryprogranulin.</a> J. Clin. Invest. 118, 2438-2447 (2008).</li>
<li>Yin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exaggerated+inflammation%2C+impaired+host+defense%2C+and+neuropathology+in+progranulin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Exaggerated inflammation, impaired host defense, and neuropathology in progranulin-deficient mice.</a> J. Exp. Med. 207, 117-128 (2010).</li>
<li>Liu, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progranulin%3A+A+promising+therapeutic+target+for+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Progranulin: A promising therapeutic target for rheumatoid arthritis.</a> FEBS Lett. , (2011).</li>
<li>Tang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growth+factor+progranulin+binds+to+TNF+receptors+and+is+therapeutic+against+inflammatory+arthritis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The growth factor progranulin binds to TNF receptors and is therapeutic against inflammatory arthritis in mice.</a> Science. 332, 478-484 (2011).</li>
<li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+proepithelin+to+epithelins%3A+roles+of+SLPI+and+elastase+in+host+defense+and+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Conversion of proepithelin to epithelins: roles of SLPI and elastase in host defense and wound repair.</a> Cell. 111, 867-878 (2002).</li>
<li>Baker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+progranulin+cause+tau-negative+frontotemporal+dementia+linked+to+chromosome+17%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations in progranulin cause tau-negative frontotemporal dementia linked to chromosome 17.</a> Nature. 442, 916-919 (2006).</li>
<li>Cruts, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Null+mutations+in+progranulin+cause+ubiquitin-positive+frontotemporal+dementia+linked+to+chromosome+17q21%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Null mutations in progranulin cause ubiquitin-positive frontotemporal dementia linked to chromosome 17q21.</a> Nature. 442, 920-924 (2006).</li>
<li>Wils, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+ageing%2C+increased+mortality+and+FTLD-TDP-associated+neuropathology+in+progranulin+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cellular ageing, increased mortality and FTLD-TDP-associated neuropathology in progranulin knockout mice.</a> J. Pathol. , (2012).</li>
<li>Guo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulin-epithelin+precursor+binds+directly+to+ADAMTS-7+and+ADAMTS-12+and+inhibits+their+degradation+of+cartilage+oligomeric+matrix+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Granulin-epithelin precursor binds directly to ADAMTS-7 and ADAMTS-12 and inhibits their degradation of cartilage oligomeric matrix protein.</a> Arthritis Rheum. 62, 2023-2036 (2010).</li>
<li>Xu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+oligomeric+matrix+protein+associates+with+granulin-epithelin+precursor+%28GEP%29+and+potentiates+GEP-stimulated+chondrocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cartilage oligomeric matrix protein associates with granulin-epithelin precursor (GEP) and potentiates GEP-stimulated chondrocyte proliferation.</a> J. Biol. Chem. 282, 11347-11355 (2007).</li>
<li>Bai, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAMTS-7%2C+a+direct+target+of+PTHrP%2C+adversely+regulates+endochondral+bone+growth+by+associating+with+and+inactivating+GEP+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">ADAMTS-7, a direct target of PTHrP, adversely regulates endochondral bone growth by associating with and inactivating GEP growth factor.</a> Mol. Cell. Biol. 29, 4201-4219 (2009).</li>
<li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulinepithelin+precursor%3A+a+bone+morphogenic+protein+2-inducible+growth+factor+that+activates+Erk1%2F2+signaling+and+JunB+transcription+factor+in+chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Granulinepithelin precursor: a bone morphogenic protein 2-inducible growth factor that activates Erk1/2 signaling and JunB transcription factor in chondrogenesis.</a> FASEB J. 24, 1879-1892 (2010).</li>
<li>Liu, C. J., Bosch, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progranulin%3A+A+growth+factor%2C+a+novel+TNFR+ligand+and+a+drug+target%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Therap%22%5BJournal%5D)">Progranulin: A growth factor, a novel TNFR ligand and a drug target.</a> Pharmacol. Therap. 133, 124-132 (2012).</li>
<li>Wu, H., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progranulin+Resolves+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Progranulin Resolves Inflammation.</a> Science. 332, 427-428 (2011).</li>
<li>Glasson, S. S., Chambers, M. G., Den Berg, W. B. V. an, Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+OARSI+histopathology+initiative+-+recommendations+for+histological+assessments+of+osteoarthritis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthr.+Cart%22%5BJournal%5D)">The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse.</a> Osteoarthr. Cart. 18, 17-23 (2010).</li>
<li>Glasson, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+osteoarthritis+target+validation+utilizing+genetically-modified+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">In vivo osteoarthritis target validation utilizing genetically-modified mice.</a> Curr. Drug Targets. 8, 367-376 (2007).</li>
<li>Ma, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritis+severity+is+sex+dependent+in+a+surgical+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthr.+Cart%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model.</a> Osteoarthr. Cart. 15, 695-700 (2007).</li>
<li>Lin, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+hedgehog+signaling+can+attenuate+the+severity+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Modulating hedgehog signaling can attenuate the severity of osteoarthritis.</a> Nat. Med. 15, 1421-1425 (2009).</li>
<li>Malfait, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAMTS-5+deficient+mice+do+not+develop+mechanical+allodynia+associated+with+osteoarthritis+following+medial+meniscal+destabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthr.+Cart%22%5BJournal%5D)">ADAMTS-5 deficient mice do not develop mechanical allodynia associated with osteoarthritis following medial meniscal destabilization.</a> Osteoarthr. Cart. 18, 572-580 (2010).</li>
</ol>

אנחנו בזאת מצהירים כי אין לנו שום ניגוד עניינים.

הוא דיווח כי הזן של עכברים הוא חשוב מאוד לזירוז מודל DMM, זנים שונים כמו של עכברים דרגות חומרה שונים של OA אחרי DMM, עם הרמה הגבוהה ביותר במתח 129/SvEv, ואחריו C57BL6, 129/SvInJ ולאחר מכן FVB / n 26. חלק גדול מtransgenes הוקם בעכברי C57BL6, כגון PGRN-/ - עכברים ששמשנו במחקר הנוכחי, שהם יחסית רגישים לDMM. עם זאת, אם transgene מבוסס על זן רגיש כגון FVB / n עכברים, יש צורך ההכלאה לאחור עכברים אלה עם זנים רגישים לפני גיוס DMM. המין של עכברים המשמשים לזירוז DMM הוא גם מאוד ח...

דלקת מפרקים ניוונית (OA), המכונה גם דלקת פרקים ניוונית, משפיע 15% מאוכלוסיית העולם של ומעל 46 מיליון אנשים בתוך ארצות הברית, ומאופיין בדלקת, ניוון סחוס, והיווצרות osteophyte 1. זה יכול להיות תוצאה של יחסי גומלין מורכבים של גורמים גנטיים, מטבולים, ביומכנית וביוכימיים. המנגנון הבסיסי של OA ימשיך להתחמק מהקהילה המדעית. קיימים כיום מודלים של בעלי חיים רבים שיכולים לחקות את הפתוגנזה של OA 2,3. זה חשוב להקים מודלים של בעלי חיים בעכברים בגלל שתי הזמינות של עכברים מהונדסים גנטי שונים ועלות התועלת של ניסויים. בין סוגים שונים של מודלים OA ניסויים השונים, היציבות הנגרמת בניתוח של המניסקוס המדיאלי מודל (DMM) היא מודל OA היטב קיבל בגלל שחזור הטוב שלה והתקדמות איטית יחסית בפיתוח OA. שתי התכונות האלה יש ליהיה מפתח להערכת התקדמות OA בטיפולים שונים או transgenes 3-8. עם זאת, העקביות של מודל OA כירורגית מושפעת מגורמים שונים במהלך הניתוח וכתוצאה מכך, היישום של מודל עכבר כירורגית מוגבל. Progranulin (PGRN) הוא גורם גדילה רב תפקודי המתבטא בתאים שונים. זה ידוע כי PGRN משחק תפקיד קריטי בתהליכים פיסיולוגיים ומחלות שונים, כגון ריפוי פצעים 9, tumorigenesis 10, ודלקת 11-15. מחקרים גם הראו כי אי ספיקה של PGRN יכולה לגרום למחל ניווניות של מערכת עצבים בבני האדם ועכברים 16-18. זה ידוע כי PGRN בא לידי ביטוי בסחוס במפרק אנושי, ורמתו גבוהה באופן משמעותי בסחוס של חולים עם OA ודלקת מפרקים שגרונית 19. בנוסף, PGRN גם ממלא תפקיד מכריע בהתפשטות הכונדרוציטים 20, בידול וendochondralהתאבנות של צלחת צמיחה במהלך פיתוח 21,22. לאחרונה, דיווח כי PGRN קומם TNF-α באמצעות קשירה לקולטנים TNF והציג פונקציה אנטי דלקתית במודלים של דלקת מפרקים דלקתיים 13,14,23,24. עם זאת, תפקידיו של PGRN בOA, במיוחד in vivo, נותר חידה. בזאת, אנו מציגים את ההליך כדי לגרום למודל DMM כירורגית, ולחקור את התפקיד של PGRN בפיתוח OA באמצעות הקמת מודל DMM ב WT וPGRN-/ - עכברים.

<table><tbody><tr><td>מס' 10 להבים כירורגיים</td><td>נוצה</td><td>25-2976#10</td><td></td></tr><tr><td>6-0 תפר</td><td>שיניים יישומי</td><td>WG-N53133</td><td></td></tr></tbody></table>

הקמת דגם בניתוח מושרה בעכברים כדי לחקור את תפקיד מגן של progranulin בדלקת מפרקים ניוונית

Establishment of a Surgically-induced Model in Mice to Investigate the Protective Role of Progranulin in Osteoarthritis

יציבות של המניסקוס המדיאלי מודל (DMM) הוא כלי חשוב ללימוד תפקידי pathophysiological של מולקולות דלקת פרקים רבות הקשורים בפתוגנזה של דלקת מפרקים ניוונית (OA) in vivo. עם זאת, מפורט, במיוחד הפרוטוקול דמיינו להקמת מודל מסובך זה בעכברים, אינו זמין. במסמך זה אנו ניצלנו wildtype וprogranulin (PGRN) - / - עכברים כדוגמאות להציג את פרוטוקול לגרימת מודל DMM בעכברים, ולעומת תחילתה של OA לאחר הקמת מודל מושרה בניתוח זה. הפעולות שבוצעו על עכברים היו או פעולת דמה, שנפתחה רק כמוסה משותפת, או בהפעלת DMM, אשר חתכה את רצועת menisco-השוקה וגרמה להתערערות של המניסקוס המדיאלי. חומרת דלקת מפרקים ניוונית הוערכה באמצעות assay היסטולוגית (למשל צביעת Safranin O), ביטויים של גנים הקשורים OA, צורת השפלה של מולקולות תאי מטריקס סחוס, וosteophyteation. פעולת DMM מושרה בהצלחה ייזום OA והתקדמות בשני wildtype וPGRN-/ - עכברים, ואובדן של גורם גדילת PGNR הוביל לפנוטיפ OA חמור יותר במודל מושרה בניתוח זה.

מודל DMM הוקם בהצלחה בעכברים, וחסר של PGRN מוגזם פיתוח OA בניתוח מושרה. פעולות דמה וDMM (איור 1) בוצעו ב WT וPGRN-/ - עכברים. 8 שבועות לאחר הניתוח, העכברים הוקרבו, ומכתים Safranin O בוצע על החלקים ממפרקי הברך, ואחרי ניתוח סטטיסטי של ציון בדלקת מפרקים המבוסס על היסטולוגיה. כפי שניתן לראות באיור 2 א, לא היה מובן מאליו ניוון של סחוס בשני גנוטיפים בקבוצות פעולת דמה ה...

אנו מתארים פרוטוקול ליציבות של המניסקוס המדיאלי מודל (DMM) בעכברים, כלי יעיל למחקר דלקת מפרקים ניוונית (OA). בנוסף, יש לנו הפגנו מחסור זה של פיתוח progranulincan להגזים OA והתקדמות באמצעות מודל זה, המציין כי progranulin משחק תפקיד מגן בפתוגנזה של OA.

Destabilization of medial meniscus (DMM) model is an important tool for studying the pathophysiological roles of numerous arthritis associated molecules ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ליצור מודל DMM בעכברים ולבחון את הופעת הדלקת המפרקית (osteoarthritis) בעקבות ניתוח ה-DMM. לאחר הכנת בעלי החיים, מבוצע חתך אורכי של סנטימטר אחד במדיאל פארה-פטלה (medial para patella) כדי לחשוף את מפרק הברך. לאחר מכן, קפסולת מפרק הברך מופרדת ומבוצעת דיסלוקציה מדיאלית של הברך.השלב האחרון הוא חיתוך של הרצועה הטיביאלית של המניסקוס המדיאלי (medial meniscal tibial ligament) ותפירת הברך. בסופו של דבר, נעשה שימוש בניתוחים היסטופתולוגיים כדי להראות הרס של מבנה המפרק, כמו גם אובדן של פרוטאוגליקנים ודלקת מפרקים ניוונית (osteoarthritis). חומרת הפגיעה מוערכת באמצעות מדדי MANKIN של צביעת saffron ו-o.בדרך כלל, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בביצועה אלא אם כן צפו בניתוח המבוצע בעכברים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית. מכיוון שהשלבים המפורטים קשים ללמידה ומבוצעים כעת תחת מיקרוסקופ, יש לזהות בבירור כל מבנה של מפרק הברך.כדי להקים מודל זה, הכין את העכבר לניתוח של דסטביליזציה של המניסקוס המדיאלי (DMM) על ידי הרדמה של עכבר זכר מסוג C 57 black six בן שמונה עד 12 שבועות, השוקל כ-25 גרם. לאחר מכן, מרח משחה אופתלמית על העיניים לאחר גילוח האזור שסביב הברך. סטריליז את האזור עם Betadine ואלכוהול שלוש פעמים, וכסה את השטח בסדין כירורגי.התחילו את הניתוח בביצוע חתך אורכי של סנטימטר אחד במקומיות לצד הפיקה (medial para patella) כדי לחשוף את מפרק הברך. לאחר מכן, חתכו בזהירות את קפסולת מפרק הברך לאורכה דרך החתך המדיאלי עד לחשיפת הפמור. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי לשחרר את מבנה הקפסולה על ידי הרחבתה והעמקתה של החתירה.יש לתפוס בעדינות את החלק הדיסטלי של כף הרגל האחורית ביד אחת. השתמשו בפינצטה כדי לבצע פריקה לטרלית של הפיקה ושל רצועת הפיקה. הפריקה לא אמורה לדרוש כוח רב אם קפסולת המפרק נחתכה לאורכה. במהלך שאר שלבי הניתוח, טפטפו סליין סטרילי על פני השטח של הסחוס המפרקי כדי למנוע את התייבשותו.כעת, זהו את המניסקוס המדיאלי (medial meniscus), הממוקם בין הקונדיל המדיאלי של הפמור לבין הפלטו המדיאלי של הטיביה. במידת הצורך, הזיזו הצידה את כרית השומן המכסה את הרצועה הטיביאלית של המניסקוס כדי לחשוף את הרצועה הטיביאלית של המניסקוס, המחברת את הצד הלטרלי של המניסקוס המדיאלי לבליטה האינטרקונדילרית של הטיביה. החזיקו את כף הרגל האחורית בעדינות ביד אחת.בצע את ניתוח ה-DMM על ידי חיתוך זהיר של ה-medial meniscal tibial ligament באמצעות להב כירורגי מספר 10. ודא שלא נגרם נזק לסחוס המפרקי או לרצועות אחרות. לאחר מכן, סגור את קפסולת מפרק הברך באמצעות תפר ספיג absorbed של 6-0 וסגור את העור באמצעות תפר משי של 6-0.כדי להמזער את הכאב לאחר הניתוח, יש לתת זריקה תת-עורית של 10 milligrams per kilogram meloxicam ולהחזיר את העכבר לכלובו לאחר שהשפעת ההרדמה תפסיק. מספר שבועות לאחר הניתוח, יש להקריב את העכבר ולהסיר את שתי הגפיים האחוריות באמצעות להב מספר 10. לאחר מכן, יש להפריד בזהירות את העור והשרירים מהגפיים האחוריות ולקבע את הדגימה ב-4%Paraform aldehyde למשך שלושה ימים בטמפרטורת החדר.לאחר שלושה ימים, הסירו את הפאראפורמאלדהיד ונקו את הדגימות במים מזוקקים במשך שלוש דקות. לאחר מכן, בצעו דקאלציפיקציה לדגימות ב-EDTA בטמפרטורה של 4 °C למשך שבועיים. לאחר שבועיים, בצעו דהידרטציה לדגימות במדרג של אתנול.לאחר הסרת האתנול האחרון, השריה את הדגימות בשלוש אמבטיות Lene למשך שעה אחת כל אחת. לאחר מכן, טמיע את הדגימות בתבנית פאראפין. השתמש במיקרוטום סיבובי להכנת חתכים בעובי של 5 מיקרון ואסוף את החתכים על גבי פלטה מזכוכית.המשיכו לחתוך חתכים סגיטליים סדרתיים ממרכז הקונדיליז הלטרלי (השוקשוק החיצוני) למרכז הקונדיליז המדיאלי (השוקשוק הפנימי) לצורך ביצוע צביעת ספרון ואוצ'זין (safranin O). ראשית, בצעו דה-פאראפיניזציה לשקופיות בקסילן למשך שלוש עד חמש דקות, וחזרו על רחצה זו בקסילן פעמיים.לאחר מכן, בצעו הידרציה לשקופיות במדרג אתנול המסתיים במים מזוקקים. לאחר מכן, העבירו את השקופיות דרך תמיסת Weigert's iron hematin, תמיסת fast green בריכוז 0.05%, תמיסת חומצה אצטית בריכוז 1%, ותמיסת saffron and O בריכוז 0.1%. כעת, קבעו את השקופיות באמצעות מדיום שרפי; דרגו את השקופיות שצבעו ב-saffron and O על בסיס אובדן צבע ה-red prot glycan בסחוס ועל בסיס אחוז ההרס של מבנה הסחוס.לאחר מכן, בצעו ניתוח סטטיסטי באמצעות מערכת הדירוג ההיסטולוגית O-A-R-S-I. תמונות אלו מראות מפרקי ברכיים עם צביעת saffron ו-O בעכברים מסוג wild type ובעכברי PG rrn knockout, שמונה שבועות לאחר ניתוח sham או ניתוח DMM. לא נצפתה דגנרציה ניכרת של הסחוס באף אחד מהגנוטיפים לאחר ניתוח sham.עם זאת, שמונה שבועות לאחר ניתוח DMM, נראה אובדן של פרוטאוגליקן כפי שבא לידי ביטוי באובדן הצבע האדום בסחוס, וכן הרס של מבנה הסחוס כפי שמסומן על ידי החיצים האדומים הן בעכברים מסוג wild type והן בעכברי PGRN knockout, מה שמעיד על השראה מוצלחת של פנוטיפ של דלקת מפרקים שבירה (osteoarthritis). השוואה של ציוני דלקת מפרקים שבירה בין עכברי wild type לעכברי PGRN knockout בעקבות ניתוח DMM מראה ציון גבוה באופן משמעותי בעכברי ה-knockout, דבר המדגים כי אובדן של PGRN הוביל לפנוטיפ חמור יותר של דלקת מפרקים שבירה כפי שסומן.ניתן לבצע טכניקה זו ב-10 עד 15 דקות אם היא מבוצעת כהלכה. לאחר צפייה בסרטון זה, תגעירו הבנה טובה של אופן ביצוע פעולת DMM בהמוניקה.

establishment-surgically-induced-model-mice-to-investigate-protective

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

התמיינות של תאים קודמים לאוסטאוקלסטים מווסתת על ידי ציטוקינים וגורמי גדילה. כאן, מתוארת טכניקה חדשה להעברת גנים להתמיינות של אוסטאוקלסטים in vivo ופרוטוקולי תרבית תאים להתמיינות תאים קודמים לאוסטאוקלסטים במבחנה כשיטה לחקר ההשפעות של ציטוקינים על אוסטאוקלסטוגנזה.

רומן In vivo טכניקה וין העברה במבחנה לחקר אובדן עצם בפרעות השלד והשרירים

למרות שמודלים של עכברים הם כלים יקרי ערך להנדסת רקמות עצם, מודלים של פגמים בעצמות ארוכות הם דלילים. צורך זה הניע את פיתוח הפרוטוקול הנוכחי המשתמש בלוחית נעילה עם ארבעה ברגים וג'יג ייעודי לביצוע וייצוב פגם בגודל קריטי הניתן לשחזור, עצם הירך עם תחלואה נמוכה.

הקמת דגם פגם קריטי בגודל הירך מגזרית עכברים מיוצב על ידי פלייט Osteosynthesis

אוסטיאוארתריטיס (OA), או מחלת מפרקים ניוונית, הוא מצב מתישה הקשורים כאב נשאר רק מבוקרת חלקית משככי כאבים זמינים. במודלים של בעלי חיים מפותחים כדי לשפר את ההבנה שלנו של מנגנוני הכאב הקשורות OA. כאן אנו מתארים את המתודולוגיה מודל monoiodoacetate כאב OA בתוך העכבר.

מודל Monoiodoacetate של אוסטיאוארתריטיס כאב העכבר

פרוטוקול זה מתאר מודל העכבר של כירורגיה אורתופדית, שבו נעשה שימוש כדי לחקור מנגנונים של neuroinflammation לאחר הניתוח, שינויים התנהגותיים, וכאשר בשילוב עם parabiosis, ללמוד התחדשות רקמות במהלך ההזדקנות.

דגם העכבר של כירורגיה אורתופדית ללמוד לאחר הניתוח בתפקוד הקוגניטיבי ו התחדשות רקמות

הפרוטוקול הנוכחי יוצר שיטה קפדנית ומתוכנות לכמת של שינויים מורפולוגיים המלווים אוסטיאוארתריטיס. יישום פרוטוקול זה יכול להיות בעל ערך בניטור התקדמות המחלה והערכת התערבויות טיפוליות אוסטיאוארתריטיס.

מתוקננת הערכה היסטראורמטרית של אוסטיאוארתריטיס במודל עכבר כירורגי

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את שריטות המיקרובלייד המבוקרות על פני השטח של הסחוס המפרקי לאחר ערעור היציבות של ברך העכבר על ידי חיתוך הרצועה המיניסקוטיבית המדיאלית. מודל חייתי זה מציג צורה מואצת של דלקת מפרקים ניוונית (OA) המתאימה לחקר היווצרות אוסטאופיטים, אוסטאוסקלרוזיס וכאבים בשלב מוקדם.

ערעור היציבות של המניסקוס המדיאלי ושריטה הסחוס מודל מורין של דלקת מפרקים ניוונית מואצת

פרוטוקול זה מציג שיטה חסכונית ויעילה להערכה כמותית של מיקרו-ארכיטקטורה של עצם במודל עכברי של אוסטאופורוזיס על ידי שילוב של צביעת Hematoxylin-Eosin (HE) וטכניקות טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (Micro-CT).

הערכת מיקרו-ארכיטקטורה של עצם טרבקולרית במודל עכבר אוסטאופורוזיס

כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול המבסס מודל עכבר של דלקת מפרקים שגרונית (RA) באמצעות העברה מאמצת של תאי CD4+ T מעכברי SKG, המספק כלי ניסיוני מהיר ואמין לחקירת המנגנונים החיסוניים, התקדמות פתולוגית ופיתוח טיפולים חדשים לדלקת מפרקים שגרונית.

מודל העברה מאמץ של דלקת מפרקים שגרונית בעכברים

מאמר זה מתאר את ההליכים הבסיסיים לעריכת ניסויים מיפוי אופטי בלב Langendorff-perfused הארנב באמצעות מערכת הדמיה פנורמית, ואת שיטת כפול (מתח סידן) הדמיה.

Multiparametric מיפוי אופטי של הלב Langendorff-perfused הארנב

עצמית התאספו monolayers (Sams) נוצר זמן alkane thiols על שרשרת זהב לספק מוגדרים היטב מצעים ליצירת דפוסי חלבון תא הכליאה. הדפסה Microcontact של hexadecanethiol באמצעות חותמת (PDMS) polydimethylsiloxane ואחריו למלא את משבצות עם גליקול, הסתיים alkane תיאול מונומר מייצר דפוס שבו חלבונים בתאים לספוג רק לאזור hexadecanethiol חותמת.

יצירת דו מימדי מצעים Patterned עבור החזקת חלבון ו-Cell

חקור את מודל DMM בעכברים לחקר דלקת מפרקים ניוונית ותפקידו ההגנתי של פרוגרנולין. שיטה זו מאפשרת הערכת נזק מפרקי ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות.

הקמת דגם בניתוח מושרה בעכברים כדי לחקור את תפקיד מגן של progranulin בדלקת מפרקים ניוונית

גלה סרטונים נוספים