למתוח בתאי אנדותל כלי הדם במוח (cEND) כ

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדגים את השימוש בפגיעת מתיחה כמודל לפגיעה מוחית טראומטית. דבר זה מושג תחילה על ידי גידול של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים בבארים בעלות תחתית גמישה. השלב השני הוא בידול התאים באמצעות הפחתה של סרום עגל עוברי (fetal calf serum) במדיום התרבית.

בשלב הבא, גורמים לפגיעה בתאים באמצעות מכשיר מתיחת התאים (cell stretcher). השלב האחרון הוא הערכת מידת הפגיעה בתאים. בסופו של דבר, נעשה שימוש בפגיעה מושרית-מתיחה בתאי אנדותל של המוח כדי להדגים פגיעה במחסום הדם-מוח in vitro.

ההשלכות של טכניקה זו חולשות לעבר טיפול בפגיעות מוח טראומטיות, כיוון שהיא מדמה את ההשפעה הממשית המתרחשת במהלך TBI במחסום דם-מוח באמצעות פגיעת מתיחה של תאי אנדותל של מוח ממקור ימי. את הפרוצדורה תדגים ד"ר אליין סלבדור, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלי. התחילו את הפרוצדורה על ידי גידול של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של מוח ימי בבקבוק תרבית T 75.

החליפו את המצע פעמיים בשבוע עד להגעה לקונופלואנס (confluence). לאחר מכן, שטפו את התאים ב-PBS. לאחר מכן הסירו את ה-PBS ואת ה-tryps.

יש לעבד את התאים עם שני מיליליטר של תמיסת tryin EDTA חמה. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך חמש דקות או עד לפיזור שכבת התאים. לאחר מכן, הוסיפו שמונה מיליליטר של מצע גידול לתאים, והקישו על הבקבוק מספר פעמים כדי לנתק את התאים.

הבט בתאים תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שהם ניתקו לחלוטין מהבקבוק. לאחר מכן, בצע שאיבה והזרקה (pipette) של המדיום עם התאים שניתקו. סובב את הבקבוק כדי לערבב את תרחיף התאים לאחר מכן.

הוסיפו 20 µL מתליה suspension של התאים לתוך המוציטומטר (hemo cytometer), וספרו את מספר התאים. קבעו את צפיפות התאים וודאו שישנם 20,000 תאים לסמ"ר בתוך הבאר. לאחר מכן, העבירו את תליה suspension של התאים לתוך קולגן.

מלאו שישה לוחיות תרבית בעלות תחתית גמישה במקדם קוד, בנפח כולל של 3 mL לבאר. החליפו את מצע התרבית פעמיים בשבוע וגדלו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך שבוע עד להגעה למצב של התרבות מלאה (confluent).

עבור דיפרנציאציה של התאים, החליפו את מצע הגידול של התאים במצע דיפרנציאציה, והדגירו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 שעות. בהליך זה, הפעילו את מכשיר בקרת הפגיעה התאית והגדירו את השהיית (delay) ל-50 milliseconds. לאחר מכן, הגדירו את לחץ הווסת ל-15 PSI ולחצו על ההדק מספר פעמים עד ששיא הלחץ הרשום יהיה יציב.

לאחר מכן, הגדירו את לחץ הווסת לערך הרצוי. לאחר מכן, הניחו את פלטת התרבית בעלת שש בארות עם תחתית גמישה לתוך תומך המגש. ודאו שבורר הבארות מוגדר לגודל הבארה הנכון.

לאחר מכן, מקמו את תקע המתאם בחוזקה מעל ה-, החזיקו את התקע בחוזקה במקומו ביד אחת, ובעזרת היד השנייה לחצו על ההדק; רשמו את לחץ השיא שנוצר לאחר מכן. החזירו מיד את הפלטה למדגרה בטמפרטורה של 37 °C למשך הזמן הרצוי, או השתמשו בה מיד לניסויים או להערכות המשך כדי להעריך את פגיעת המתיחה באמצעות בדיקת ספיגת DI. מיד לאחר מתיחת התאים, הוסיפו לתווך תרבית התאים 30 µL של צבע חיוניות בריכוז 1 mg/mL המשמש כסמן לציטוטוקסיות.

כדי להעריך את הפגיעה כתוצאה ממתיחה באמצעות שחרור lactate dehydrogenase. לאחר המתיחה, הסר מיד 200 microliters של מצע תרבית תאים מהבאר; בצע את אותה פעולה עבור כל נקודת זמן לאחר הפגיעה שברצונך לכלול בבדיקת שחרור ה-LDH. לאחר מכן, סבב את מצע תרבית התאים בצנטריפוגה מיקרוסקופית בהגדרה הגבוהה ביותר למשך חמש דקות.

כדי להסיר שאריות תאים, יש להסיר את הנוזל העליון (supernatant) ולהשתמש בו לשלבים הבאים. לאחר דגימת הדגימות הנדרשות מנקודות הזמן השונות, יש לבצע ליזיס לתאים באמצעות תמיסת הליזיס המצורפת לערכה לבדיקת LDH. לאחר מכן, יש להוסיף 100 µL של תווך הבדיקה המצורף לערכה לכל באער של פלטת 96 באערים המסופקת בערכה.

לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של מצע תרבית תאים ללא תאים לשתי בארות מקבילות בלוחית של 96 בארות. דגרו את הלוחית בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות ומדדו את הבליעה באורך גל של 492 nm. מוצגת כאן בדיקה במיקרוסקופ אור של תאים תקינים לעומת תאים פגועים.

שכבת התאים התשופית (monolayer) התקינה והלא-מתוחה דחוסה מאוד; כאשר התאים נמתחים על ידי הפעלת פולס של לחץ שיא של 1.8 עד 2.0 PSI, הם נראים פחות דחוסים. כאשר התאים נפגעים במידה מתונה על ידי פולס של לחץ שיא של 2.5 עד 3.0, חלקם נראים נפוחים ומעוותים. התאים הופכים לסוגרים (retracted) במתיחה חמורה של 3.5 עד 4.5 PSI.

להלן בדיקה במיקרוסקופ פלואורסצנציה של תאים תקינים לעומת תאים פגועים. התאים טופלו בצבע לבדיקת חיוניות שעתיים לאחר הפגיעה. אלה הם תאי הביקורת שלא נמתחו, התאים שנמתחו באופן מתון, והתאים שנמתחו באופן חמור.

איור זה מציג את שחרור אנזים ה-LDH לתוך ה-snat לאחר פגיעה ממתיחה. נמדד LDH ששוחרר לתוך מדיום התרבית במרווחי זמן שונים לאחר פגיעה שהושרה על ידי ממתיחה, והתוצאה בוטאה כאחוז מה-L-D-H-L-D-H הכולל שניתן לשחרור מתאים לתאים שהוכפפו לממתיחה נמוכה ובינונית. לא נמצא הבדל מובהק ביניהם לבין הביקורות שלא נמתחו ובני ביניהם.

תאים שעברו מתיחה חמורה שחררו כמות גדולה משמעותית של LDH בהשוואה לכל שאר הדגימות, למעט הדגימה שעברה מתיחה מתונה שעה אחת לאחר פיתוחה. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הנוירוביולוגיה לחקור פגיעות מוח טראומטית בתאי אנדותל של מוח ימי in vitro.