Assay המבוסס תא זרימת cytometry תפוקה גבוהה לזיהוי נוגדנים לN-מתיל-D-aspartate קולטן דופמין או-2 קולטן בסרום אדם

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לזהות נוגדנים עצביים נגד D שני R או N-M-D-A-R בדגימות חולים באמצעות בדיקה מבוססת תאים ציטומטרית זרימה בתפוקה גבוהה. זה מושג על ידי תת-היצמדות, רצף ה-CDNA המלא של D אנושי שני R או N-M-D-A-R בתוך פלסמיד. כשלב שני, קו תאים אנושי עובר טרנספטציה, מה שמוביל לביטוי פני התא של אנטיגנים עצביים.

לאחר מכן, תאים שעברו טרנספטציה מודגרים עם סרום המטופל ונוגדנים משניים מתאימים לפני רכישת ציטומטריית זרימה. על מנת לזהות קשירת נוגדנים לאנטיגנים על פני התא, מתקבלות תוצאות על סמך ניתוח זרימה ציטומטרית. הבדיקה המבוססת על תאים של ציטומטריית שלוש יציאות זו מהירה, כמותית ויעילה עבור קבוצות גדולות של דגימות חולים.

זהו יתרון משמעותי על פני שימוש בבדיקה מבוססת תאים עם אימונוכימיה ואנליזה קונפוקלית. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתמודדו עם אובדן תאים במהלך הניסוי על מנת לרכוש את המספר המתאים של תאים בציטומטר הזרימה. הקפד לא לשאוב תאים בין כביסות.

בחר וקטור ביטוי המתאים לביטוי חלבונים טרנסממברניים ומאפשר ביטוי משותף תאי של האנטיגנים והחלבון הפלואורסצנטי הירוק בנפרד. לדוגמה, לווקטור זה יש מדווח GFP משופר בשליטה של אתר כניסת ריבוזום פנימי לשיבוט תת-שיבוט של CD NA אנושי באורך מלא לתוך הווקטור באמצעות אנזימי ההגבלה המתאימים לאחר אימות השיבוטים על ידי ריצוף, ליצור מלאי פלסמיד המתאים לשימוש בתרבית טרנספקט. תאי HEK 2 93 ב-DMEM מלא עם סרום בקר עוברי של 10%.

קצור את התאים על ידי טריפסין לאחר צנטריפוגה שטיפה אחת של התאים והחזר להשעות את כדור התא ב-dmm שלם טרי. ספור את התאים, ואז זרע שתי תרביות מיליליטר בשש צלחות באר בסביבות 70% שטף Co הקצה את הבארות של תאי HEK 2 93 לטרנספקציה עם מבני הביטוי כמו גם את וקטור הבקרה. שמור חלק על תאי HEK 2 93 שעברו טרנספטציה לפיצוי מאוחר יותר.

הכן את תערובות הטרנספקציה המורכבות מ-200 מיקרוליטר של 0.9% נתרן כלורי, 2.5 מיקרוגרם DNA וארבעה מיקרוגרם למיליליטר פוליאתלין. מערבולת מיד למשך 10 שניות ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לפני הוספת תערובת הטרנספקציה לכל באר של שני מיליליטר dmm שלם טרי. מכסים את הצלחת, עוטפים את הדפנות בפרפיל וצנטריפוגה בחום של 280 GS למשך חמש דקות כדי לסייע בהעברת התאים.

לאחר מכן הסר את סרט הפרה ואז הניח את הצלחת בתנאי תרבות למשך 18 שעות. החלף את אמצעי התרבות ב-DM EM שלם טרי ושמור בתרבית למשך 72 שעות נוספות. כדי לנתק את התאים, הוסיפו 500 מיקרוליטר וריס לכל באר ודגרו כחמש דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן השעו מחדש את התאים של כל באר בשני מיליליטר של 2% FBS ב- PBS והעבירו את התאים לצינור חרוטי לאחר שלוש כביסות. השעו מחדש את משטחי התאים במיליון תאים למיליליטר בתמיסת FBS של 2%. כעת תכנן את תבנית 96 הבארות לרכישת ציטומטריית זרימה כך שקווי התאים השונים יטופלו בכל דגימת מטופל או נוגדן ראשוני.

לאחר מכן זרע 50,000 תאים לבאר בצלחת V תחתונה 96 באר גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב -450 G למשך חמש דקות. הטה צלחת בזווית והסר בעדינות את הסופרה נאטין תוך הקפדה לא לשאוף את כדור התא. לאחר מכן, הוסף דילול סדרתי של נוגדן ראשוני על מנת להעריך את ביטוי פני השטח של האנטיגן.

ואז דגימות מטופלים על מנת לזהות נוגדנים, דגירה על התאים למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך לאחר שלוש שטיפות ב-170 מיקרוליטר של תמיסת FBS 2%, להוסיף את הנוגדן המשני המצומד המתאים AF 6 47 נוגדן אנטי אנושי IgG לחולה ואנטי US. IgG לנוגדנים ראשוניים. הכלאה במשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך לאחר שלוש כביסות.

Resus משהה את התאים ב-35 מיקרוליטר של תמיסת 2% FBS לרכישת תאי ציטומטריית הזרימה בציטומטר הזרימה. תחילה הגדר את הדגימה בתפוקה גבוהה. רכוש 10,000 אירועים לבאר על פי תבנית רכישת ציטומטריית הזרימה.

ייצא ולאחר מכן נתח את הנתונים באמצעות חבילת תוכנה של זרימה ציטומטרית שער את תאי HEK 2 93 החיים על סמך פיזור פנימי קדימה. כמו כן, שער על חיוביות GFP גבוהה כדי לנתח רק את התאים שעברו טרנספטציה. קבע את עוצמת הקרינה הממוצעת של ערוץ AF 6 47 בתוך התאים החיוביים של GFP החיים.

לאחר מכן ייצא את הנתונים לאקסל או פריזמה לניתוח. שרטט את ריכוזי הנוגדנים הראשוניים לעומת ה-MFI המתקבל מהדגימות המתאימות עבור כל מטופל ודגימת ביקורת. קבע את הדלתא MFI חשב את סף הנוגדנים החיוביים על ידי הוספת שלוש סטיות תקן מעל ממוצע הדלתא MFI של קבוצת הביקורת.

לאחר מכן שרטט את הדגימות הבודדות מקובצות לפי קבוצת המטופלים בגרף. ייצג את הסף כקו כאן. תאים המבטאים את קולטן n מתיל דה אספרטט או קולטן דופמין שני נרכשו בציטומטר הזרימה באמצעות דגימת תפוקה גבוהה.

במהלך הניתוח התאים היו מגודרים על סמך פיזור קדימה לגודל ופיזור צדדי לגרגיריות. תאי TRANSFECTED HK 2 9 3 ביטאו את מולקולת מדווח ה-GFP בציטופלזמה ותאי UNT שהועברו לא נכללו בניתוח בתוך ההליכה החיובית של GFP. ה-MFI הקשור לקשירת נוגדנים משניים אנטי-אנושיים מצומדים AF 6 47 נמדד על מנת לבטל את הקרינה ברקע בעת ניתוח סרה אנושית.

הדלתא MFI חושב על ידי הפחתת MFI הרקע של תאי הבקרה. בדיקה זו המבוססת על תא זרימה ציטומטרית מבוססת על זיהוי נוגדנים של אנטיגן פני התא המעניין. לדוגמה, תאי ה-GK 2 93 שהועברו עם פלסמיד הביטוי עבור N-M-D-A-R הראו ביטוי גבוה של פני השטח וקולטן המתיל דה.

באופן דומה, התאים שעברו טרנספטציה D שני R ביטאו את קולטן הדופמין השני, בעוד שהתאים המבוקרים לא ביטאו אף אחד מהאנטיגנים הללו. מחקר קליני זה העריך עוקבת חולים עם דלקת מוח N-M-D-A-R, קבוצת חולים עם דלקת מוח הקשורה לנוגדנים D שני R וקבוצת ביקורת עם מחלות נוירולוגיות אחרות שאינן דלקתיות. שימו לב שאף אחד מהחולים החיוביים לא היה חיובי כפול לנוגדנים.

מכוון ל-N-M-D-A-R-M-D שני R כצפוי. הנוגדנים N-M-D-A-R ו-D two R לא זוהו באף אחד מהבקרות שנותחו. לאחר השליטה, ניתן לבצע טכניקה זו כראוי תוך חמש שעות עם שעה אחת של רכישת זרימה לכ-80 דגימות לאחר פיתוחה.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הנוירו-אימונולוגיה לגלות מטרות נוגדנים חדשות בהפרעות המתווכות על ידי מערכת החיסון.