Assay המבוסס תא זרימת cytometry תפוקה גבוהה לזיהוי נוגדנים לN-מתיל-D-aspartate קולטן דופמין או-2 קולטן בסרום אדם

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לזהות נוגדנים עצביים נגד D two R או N-M-D-A-R בדגימות של חולים באמצעות בדיקה מבוססת תאים בשיטת ציטומטריית זרימה בעלת תפוקה גבוהה. דבר זה מושג על ידי שיבוט רצף ה-CDNA המלא של D two R או N-M-D-A-R אנושי בתוך פלסמיד. כשלב שני, מתבצעת טרנספקציה של שורת תאים אנושית, המובילה לביטוי של אנטיגנים עצביים על פני שטח התא.

בשלב הבא, מדגרירים את התאים שעברו טרנספקציה עם סרום של מטופל ועם נוגדן שני מתאים לפני רכישת הנתונים בציטומטריית זרימה. על מנת לזהות קישור של נוגדנים לאנטיגנים על פני השטח של התא, מתקבלות תוצאות המבוססות על ניתוח בציטומטריית זרימה. בדיקה זו המבוססת על תאים באמצעות ציטומטריית זרימה בעלת שלושה פורטים היא מהירה, כמותית ויעילה עבור קוהורטות גדולות של דגימות מטופלים.

זהו יתרון משמעותי לעומת שימוש במערך מבוסס תאים עם אימונוכימיה ואנליזה קונפוקלית. בדרך כלל, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו עם אובדן תאים במהלך הניסוי לצורך השגת מספר התאים המתאים בציטומטר הזרימה. יש להיזהר לא לשאוב תאים בין השטיפות.

בחרו וקטור ביטוי המתאים לביטוי של חלבונים טרנס-ממברנליים ומאפשר ביטוי תאי משותף (co-expression) של האנטיגנים ושל החלבון הפלואורסצנטי הירוק באופן נפרד. לדוגמה, וקטור זה כולל רפורטר GFP משופר תחת בקרה של אתר כניסה פנימי של ריבLוזום (IRES). בצעו סוב-קלון של ה-CD NA האנושי באורכו המלא אל תוך הווקטור באמצעות אנזימי הגבלה מתאימים; לאחר אימות הקלונים על ידי ריצוף, הכינו מאגרי פלסמיד המתאימים לשימוש בתרביות טרנספקציה של תאי HEK 293 במצע DMEM מלא עם 10% fetal bovine serum.

קצרו את התאים באמצעות טריפסין; לאחר שטיפה אחת, סובבו את התאים בצנטריפוגה ושעלקו מחדש את משקע התאים ב-dmm מלא וטרי. ספרו את התאים, ולאחר מכן זרעו תרביות של שני מיליליטר בלוחות שש בארות בצפיפות של כ-70%. הקצו את בארות תאי ה-HEK 2 93 לטרנספקציה עם קונסטרוקטי ההבעה וכן עם וקטור הביקורת. שמרו חלק מתאי ה-HEK 2 93 שלא עברו טרנספקציה לצורך פיצוי מאוחר יותר.

הכינו את תערובות הטרנספקציה הכוללות 200 µL של 0.9% sodium chloride,‏ 2.5 µg של DNA ו-4 µg/mL של polyethaline. ערבבו מיד ב-Vortex למשך 10 שניות והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לפני הוספת תערובת הטרנספקציה לכל באר המכילה 2 mL של dmm מלא וטרי. כסו את הפלטה, עטפו את הדפנות ב-perfil וסובבו בצנטריפוגה ב-280 ×g למשך חמש דקות כדי לסייע לטרנספקציית התאים.

לאחר מכן, הסירו את ה-para film והניחו את הצלחת בתנאי תרבית למשך 18 שעות. החליפו את מצע התרבית ב-complete DMEM טרי והמשיכו בגידול למשך 72 שעות נוספות. כדי להפריד את התאים, הוסיפו 500 µL של trypsin לכל באר והדגירו למשך כחמש דקות ב-37 °C.

לאחר מכן, השביה מחדש את התאים מכל באר בשני מיליליטר של 2%FBS ב-PBS והעבר את התאים למבחנה קונית לאחר שלושה שטיפות. השביה מחדש את משקעי התאים בריכוז של 1 מיליון תאים למיליליטר בתמיסת 2%FBS. כעת, תכנן את תבנית 96 הבארה עבור רכישת flow cytometry כך שקווי התאים השונים יטופלו בכל דגימת חולה או בנוגדן ראשוני.

לאחר מכן, זרעו 50,000 תאים למבב בלוח 96 מבבבים בעל תחתית V, ורסבו את התאים על ידי סבוב בצנטריפוגה ב-450 Gs למשך חמש דקות. הטו את הלוח בזווית והסירו בעדינות את הנוזל העליון, תוך הקפדה לא לשאוב את משקע התאים. לאחר מכן, הוסיפו דילול סדרתי של נוגדן ראשוני כדי להעריך את הביטוי של האנטיגן על פני השטח.

לאחר מכן, לצורך זיהוי נוגדנים בדגימות חולים, דגרו את התאים למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בחשיכה; לאחר שלושה שטיפות, הוסיפו 170 microliters של תמיסת 2%FBS הכוללת את הנוגדן המשני המתאים המסומן ב-AF 6 47: נוגדן anti-human IgG עבור דגימות החולים ונוגדן anti-US. IgG עבור נוגדנים ראשוניים. בצעו היברידיזציה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בחשיכה, ולאחר מכן בצעו שלושה שטיפות.

יש להשעות מחדש את התאים ב-35 µL של תמיסת 2%FBS לצורך רכישת תאים בציטומטריה של זרימה במכשיר הציטומטר. ראשית, הגדירו את מדגם העוצמה הגבוהה (high throughput sampler). רכשו 10,000 אירועים לבאר בהתאם לתבנית הרכישה של הציטומטריה של זרימה.

ייצאו ואחריนั้น נתחו את הנתונים באמצעות חבילת תוכנה לציטומטריית זרימה; בצעו gating לתאי HEK 2 93 חיים על בסיס פיזור קדמי (forward scatter). כמו כן, בצעו gating לעוצמת GFP גבוהה על מנת לנתח רק את התאים שעברו טרנספקציה. קבעו את עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת בערוץ AF 6 47 בקרב התאים החיים החיוביים ל-GFP.

לאחר מכן, ייצא את הנתונים ל-Excel או ל-prism לצורך ניתוח. שרטט את ריכוזי הנוגדן הראשוני לעומת ה-MFI שהתקבל מהדגימות המתאימות עבור כל מטופל ודגימת ביקורת. קבע את ה-delta MFI וחשב את סף החיוביות של הנוגדן על ידי הוספת שלוש סטיות תקן מעל ה-mean delta MFI של קבוצת הביקורת.

לאחר מכן, שרטט את הדגימות הבודדות בגרף, מקובצות לפי קבוצת המטופלים. ייצג את סף הגבולה כקו בגרף זה. תאים המבטאים את קולטן ה-n methyl de aspartate או את קולטן dopamine two נאספו בציטומטר זרימה באמצעות דוגם בעל תפוקה גבוהה.

במהלך הניתוח, התאים סוננו (gated) על בסיס פיזור קדמי (forward scatter) למדידת הגודל ופיזור צדי (side scatter) למדידת הגרנולריות. תאי HK 2 9 3 שעברו טרנספקציה ביטאו את מולקולת הדחף GFP בציטופלזמה, ותאים שלא עברו טרנספקציה הוצאו מהניתוח בתוך השער (gate) החיובי ל-GFP. ה-MFI הקשור לקשירה של נוגדן משני אנטי-IgG אנושי המשולב עם AF 6 47 נמדד במטרה לבטל את הפלואורסצנציית הרקע בעת ניתוח סרומים אנושיים.

ערך ה-delta MFI חושב על ידי הפחתת ה-MFI של הרקע מתאי הבקרה. בדיקה מבוססת תאים זו בציטומטריית זרימה מתבססת על זיהוי נוגדני של האנטיגן המבוקש על פני השטח של התא. לדוגמה, תאי GK 2 93 שעברו טרנספקציה עם פלסמיד הביטוי עבור N-M-D-A-R הראו ביטוי גבוה של הרצפטור על פני השטח.

באופן דומה, התאים שעברו טרנספקציה של D two R ביטאו את קולטן הדופמין 2, בעוד שהתאי ביקורת לא ביטאו אף אחד מהאנטיגנים הללו. מחקר קליני זה העריך קוהורט של חולים עם encephalitis של N-M-D-A-R, קוהורט של חולים עם encephalitis הקשורה לנוגדנים ל-D two R וקוהורט ביקורת עם מחלות נוירולוגיות לא-דלקתיות אחרות. יש לציין כי אף אחד מהחולים החיוביים לא היה חיובי כפול לנוגדנים.

סימון N-M-D-A-R ו-D2R כפי שצפוי. הנוגדנים ל-N-M-D-A-R ול-D2R לא זוהו באף אחת מהביקרות שנותחו. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו כראוי בחמישה שעות, כולל שעה אחת של רכישת זרימה עבור כ-80 דגימות לאחר פיתוחה.

טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הנוירואימונולוגיה לגלות מטרות חדשות לנוגדנים בהפרעות ממודולות מערכת חיסונית.