חוקר מערכות קולטן ליגנד של Cellulosome עם המולקולה בודדת מבוססת AFM חיל ספקטרוסקופיה

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לחקור את התכונות המכניות ואת מצבי הקיפול של שותפים קישוריים של חלבוניהיתוך באמצעות ספקטרוסקופיית כוח של מולקולה בודדת המבוססת על AFM. מטרה זו מושגת על ידי קיבוע קוולנטי של שותפי קישור חלבונים על גבי סלייד זכוכית ועל קנטילבר AFM, כדי להשיג גיאומטריית מתיחה מוגדרת היטב כשלב שני. פני השטח של הזכוכית נלחצים על ידי הקנטילבר, מה שמאפשר ביסוס של קישור בין קולטן לליגנד.

בשלב הבא, הזרוע (cantilever) נסוגת במהירות קבועה כדי לפתוח דומיינים (domains) בודדים של חלבון ולאסוף תוצאות של קומפלקס רצפטור-ליגנד; תוצאות אלו חושפות אלמנטים מבניים שלישוניים המשמשים כמחסומי אנרגיה לאורך מסלול הפתיחה, כפי שעולה ממודלים של אלסטיות פולימרים. ניתן להפיק מידע קינטי ואנרגטי נוסף על השותפים לקשירה על ידי התאמת מודלים קינטיים לספקטרום הכוחות הדינמי. המטרה הכללית של הליך זה היא לחקור את מסלולי הפתיחה של חלבונים תחת הפעלת כוח.

שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי היציבות המכנית של חלבונים. ניתן להחילה על כל מערכת של קולטן-ליגנד חלבוני שניתן להנדס עם קבוצת קבצים נגישה. חוקרים המשתמשים בשיטה זו בפעם הראשונה עשויים לחוות קשיים, שכן התזמון הוא קריטי והטיפול בזרועות התנודה (cantilevers) עלול להיות מאתגר.

שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחום הביופיזיקה, כגון האופן שבו חלבון רב-דומיינים נפתח. לתחילת התהליך, הניחו שתי לבישויות זכוכית בקוטר 24 מילימטר ובמרחב של 0.5 מילימטר בתוך מחזיק A-P-T-F-E, ולאחר מכן בצעו סוניקציה ללבישויות בתמיסה של 50 ל-50 של אתנול ומים ultrapure למשך 15 דקות.

עם סיום הסוניקציה, שטפו את כיסורי הזכוכית (cover slips) במים אולטרה-טהורים ותשחו אותם בתמיסת פיראנה למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, הוציאו את כיסורי הזכוכית, שטפו אותם במים אולטרה-טהורים וייבשו אותם תחת זרימה עדינה של חנקן. לאחר מכן, טבלו את כיסורי הזכוכית בתערובת של 45:5:1 של אתנול, מים אולטרה-טהורים ו-3-aminopropyl dimethyl ethoxy.

הנח את הדגימות הטבולות על שייקר בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות במהירות של כ-50 סיבובים לדקה. לאחר מכן, טבול את כיסוי הזכוכית באופן סדרתי ב-100% ethanol, ולאחריו במים ultrapure, פעמיים כל אחד. ייבש שוב את כיסויי הזכוכית תחת זרימה עדינה של חנקן.

לאחר הייבוש, אפו את לבישי הזכוכית בתנור בטמפרטורה של 80 °C למשך 30 דקות. שמרו את לבישי הזכוכית שטרם נעשה בהם שימוש תחת גז ארגון למשך עד שישה שבועות לצורך ביצוע האמינואיזציה של קצות הקנטילברים מסיליקון. ראשית, הניחו ארבעה קנטילברים מסיליקון על שקופית זכוכית נקייה והחילו עליהם UV ozone למשך 15 דקות.

לאחר מכן, טבול את הקנטיליוורים למשך שלוש דקות בתמיסה של 50:50 של אתנול ו-3-aminopropyl dimethyl oxis Ilene, יחד עם 0.25% מים ultrapure. לאחר מכן, שטוף את הקנטיליוורים ברצף למשך 60 שניות בבקירי טולואן, אתנול ומים ultrapure. ייבש בזהירות את הקנטיליוורים על נייר סינון בין השטיפות לאחר השטיפה האחרונה.

הניחו את הקנטילברים על תגית זכוכית נקייה והשריו אותם בטמפרטורה של 80 °C למשך 30 דקות. הכינו שני T של חרוזי TEP diss sulfide reducing על ידי חיתוך קצה של טיפ פפיטה בנפח 200 µL להרחבת קוטרו, ולאחר מכן העבירו באמצעות פפיטה 100 µL של תמיסת חרוזי המקור לכל מיקרו-מבחנה בנפח 1.5 mL. לאחר מכן, הוסיפו 1 mL של TBS לסラリー חרוזי ה-TEP ב-OTTs, ושטפו את החרוזים על ידי ערבוב קצר במכשיר וורטקס של המיקרו-מבחנה.

לאחר מכן, שקעו את החרוזים על ידי סנטריפוגה של הדגימות ב-850 Gs למשך שלוש דקות. הסירו בזהירות והשליכו את תסמיך העל באמצעות מיקרו-פיפט, ושטפו את החרוזים פעמיים נוספות עם 1 mL של TBS. בצעו סנטריפוגה בין השטיפות; לאחר השטיפה האחרונה, הוסיפו תמיסת חלבון מרוכזת בריכוז של 3 mg/mL לחרוזי ה-TEP ביחס של 1:2, וערבבו בעדינות את התערובת בעזרת טיפ של מיקרו-פיפט כדי למנוע היווצרות בועות אוויר.

לאחר מכן, הנח את תערובת סלורי חרוזי ה-TEP עם החלבון על רוטטור למשך 2.5 שעות. השרה את קני ה-amino eyes ואת כיסויי הזכוכית (cover slips) בבופר sodium bate ב-pH של 8.5 למשך 45 דקות כדי להסיר פרוטונים מקבוצות האמין הראשוניות על פני השטח. לאחר מכן, חמם את אבקת ה-N-H-S-P-E-G למטביית החדר והכן 210 µL ממנה בריכוז של 25 µM על ידי ערבוב במערבל וורטקס בבופר sodium boy eight.

יש להשתמש בתמיסה במהירות רבה ככל האפשר בשל זמן החצי הקצר ביותר של NHS. ב-pH 8.5, טפטפו במהירות טיפות של 30 µL מתמיסת N-H-S-P-E-G על פיתרי, ו-90 µL על כל זכוכית כיסוי שנייה. הניחו בזהירות את הקנטילברים בתוך טיפות ה-30 µL.

לאחר מכן, הפכו את מכסה הזכוכית (cover slip) ללא הטיפה על גבי מכסה זכוכית עם תמיסת N-H-S-P-E-G malam כדי ליצור "סנדוויץ'" עם תמיסת N-H-S-P-E-G MALAM. הדגירו את הקנטילברים ומכסות הזכוכית עם תמיסת N-H-S-P-E-G MALAM בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. סבבו במ centri-fuge את חרוזי ה-TEP ותמיסת החלבון המרוחץ ב-100 GS למשך דקה אחת ואספו את המשקע.

לאחר מכן, דללו את תמיסת החלבון באמצעות TBS. שאפו לריכוז חלבון במהלך הצימוד לפני השטח בטווח של 0.5 עד 2 milligrams per milliliter. לאחר מכן, הניחו לתמיסות החלבון המופחתיות והמדוללות למשך מספר דקות בזמן שטיפת הקנטילברים וכיסויים של לוחות הזכוכית (cover slips).

שטפו את לבישי הכיסוי בשלוש כוסים רצופות של מים אולטרה-טהורים. הסירו שאריות נוזל מלבישי הכיסוי על ידי נגיעה זהירה של הקצוות בנייר סינון. לאחר מכן, רכבו את לבישי הכיסוי במחזיק דגימות מתאים התואם למכשיר ה-AFM, ויבשו את שאריות הנוזל תחת זרם עדין של חנקן.

טפטפו 20 µL של תמיסת החלבון המדוללת למרכז כיסויי הזכוכית. לאחר מכן, שטפו את הקנטילברים (cantilevers) בשלושה כוסות כימיות עוקבות של מים ultrapure, ולאחריהם טפטפו 30 µL של תמיסת החלבון המדוללת השנייה. הדגירו את כיסויי הזכוכית והקנטילברים הפגולאטיים (pegylated) עם תמיסות החלבון המדולל המתאימות בטמפרטורת החדר למשך שעה עד שעתיים בתא לחות.

בשלב הבא, השתמשו בפיפטה כדי לשטוף את זכוכית הכיסוי לפחות 10 פעמים עם 1 mL של TBS ולאחר מכן שמרו אותן ב-TBS עד למדידה. שטפו גם את הקנטילברים באמצעות שלושה כוסי כימיה עוקבים המכילים TBS כדי להסיר חלבונים שאינם קשורים, ושמרו גם אותם ב-TBS. התקינו את הקנטילברים והשקפיות מזכוכית הפונקציונליים בדגם AFM המתאים למדידה בנוזלים ותומך בטווח מהירויות נגיש בציר ה-Z של כ-200 עד 5,000 ננומטרים לשנייה.

בעת הרכבת הדגימה, השתדל למזער את החשיפה לאוויר והבטח שהמשטחים יישארו מכוסים בבופר לאורך כל התהליך, לאחר כיוון נכון של קרן הלייזר. המתן לפחות 30 דקות להגעה של המערכת לשיווי משקל כדי להפחית השפעות של סחף (drift), ובצע כיוון מחדש במידת הצורך. לאחר מכן, התחל בביצוע המדידות עם קשירה מוצלחת של הלכיזיה (cohesion).

בשימוש ב-Docker בזוגות, עקומות כוח-מרחק המתועדות המוצגות כאן מראות דפוס שיאים אופייני. כל שיא בעקומה מייצג פריסה (unfolding) של תת-מתחם חלבון אחד, כאשר השיא האחרון תואם להתפרקות של קומפלקס הרצפטור-ליגנד.

עקומות הכוח והמרחק שהוקלטו הומרו לאחר מכן למרחב של כוח ואורך קונטור, ונאספו להיסטוגרמה של מיקומי מחסומים. הנתונים מראים עלייה באורך הקונטור של כ-89 ננומטרים, שניתן לשייך באופן חד-משמעי לפתיחה של דומיין xin כדי לבחון את נוף האנרגיה של ה-docker הקוהזיבי והאינטראקציה. בסך הכל התקבלו 186 עקומות נתונים בארבע מהירויות מתיחה שונות.

ספקטרום הכוח הדינמי המתקבל, המוצג כעיגולים כחולים גדולים, מייצג את כוחות הקריעה הסבירים ביותר בקצב טעינה נתון. ערכים אלו הותאמו למודל Bell Evans; ההתאמה הניבה ערכים עבור Koff ו-delta X, אשר נמצאו בתאימות טובה לתוצאות שפורסמו בעבר. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע את החלק הניסויי של טכניקה זו בשמונה עד תשע שעות.

בעקבות נוהל זה, ניתן לבצע מוטגנזה ספציפית לאתר בניסוי המשך כדי לקבוע אילו חומצות אמינו הן קריטיות לקשירה לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הביופיזיקה של מולקולה בודדת לחקור נופי קיפול של חלבונים. אנו משתמשים בה כדי לבחון את התכונות המכניות של SOEs של תאית, שהן בין מערכות החלבונים היציבות ביותר מבחינה מכנית known.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן ביצוע ספקטרוסקופיה של כוח למולקולה בודדת (single molecule force spectroscopy) על זוגות של קולט חלבוני וליגנד.