בידוד של תאי מיאלואידית דנדריטים ותאי האפיתל מקורנית האדם

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבודד תאים דנדריטיים ותאים אפיתליאליים מתימוס אנושי. הדבר מושג תחילה על ידי פירוק הרקמה החתוכה באמצעות הפרעה מכנית. לאחר מכן, מקטעי הרקמה עוברים עיכול אנזימטי נוסף כדי להפיק תרחיף של תאים בודדים.

לבסוף, תרחיף התאים מועשר עבור פראקציית התאים בעלת הצפיפות הנמוכה באמצעות הפרדה ב-perca. בשלב סופי, ניתן לבודד תאים דנדריטיים ותאים אפיתליאליים מפראקציה זו באמצעות מיון מגנטי או מיון FACS, או שילוב של שניהם. השיטה המוצגת כאן מספקת הליך יעיל, הניתן לשחזור וכלכלי לבדידה מוצלחת ו למחקר המשך של אוכלוסיות תאים נדירות, כגון תאים דנדריטיים ותאים אפיתליאליים של התימוס הנמצאים בתימוס האנושי.

אי רוטה, סטודנטית לתואר מתקדמים מהמעבדה שלנו, תדגים עבורכם את הפרוצדורה. התחילו בהנחת רקמת התימוס לתוך צלחת פטרי המכילה PBS סטרילי בטמפרטורת החדר, ושטפו שאריות דם. לאחר מכן, הוסיפו PBS טרי לצלחת הפטרי והשתמשו בפינצטה ובמספריים כדי להסיר קרישי דם, רקמת חיבור ושומן, וכל חלקי רקמה שאינם נראים בריאים.

לאחר שניקיתם את רקמת התימוס, שקלו אותה לצורכי התייחסות ולאחר מכן חתכו את הרקמה לקוביות אחידות בגודל של סנטימטר מעוקב אחד. כעת כסו את החלקים ב-PBS והניחו אותם על קרח. לאחר מכן, השתמשו בגב של בוכנה של מזרק סטרילי בנפח של 10 עד 20 מיליליטר כדי להפעיל לחץ קל ומהיר על הרקמה, במטרה להסיר את עיקר התיימוציטים ולהפחית את הנפח הכולל של הרקמה המיועדת לעיכול.

התמיסה תהפוך לעכורה באופן נראה לעין. עם שחרור התיימוציטים, ערבבו את הצלחת בעדינות ולאחר מכן השתמשו בשואב זכוכית כדי להסיר את הנוזל העליון המכיל את התאים, תוך הקפדה שלא לשאוב בטעות את חלקי הרקמה. עשוי להיות מועיל להשתמש במגרדת תרביות תאים סטרילית כדי לרכז את כל חלקי הרקמה לצד אחד של הצלחת, ולאחר מכן להטות את הצלחת בזווית של 45 מעלות ולשאוב את הנוזל העליון שנותר.

שטוף את הצלחת ב-PBS טרי והמשך לאסוף את הנוזל העליון עד שה-PBS יהיה שקוף יחסית. בצע שטיפה סופית עם RPMI ולאחר מכן השתמש במספריים חדות כדי לקצוץ את חתיכות הרקמה כמה שניתן, לפחות עד לגודל שמאפשר להן להיכנס לפיפטה של חמישה מיליליטר כדי לבודד תאים דנדריטיים או dc. ראשית, הנח עד 10 גרמים של חתיכות רקמה קצוצות לתוך מבחנות של 50 מיליליטר עם 10 מיליליטר של תמיסת collagenase DNA ו-10 מיליליטר של RPMI לכל חמישה גרמים של רקמה.

לאחר מכן, דגרו את תמיסן הרקמה למשך 40 דקות תחת סיבוב איטי באינקובטור תרמי בטמפרטורה של 37 °C. תמיסת האנזימים תהפוך לעכורה ככל שתבואו התאים לתוכה. בסיום העיכול, סובבו את תמיסן התאים בצנטריפוגה למשך שתי דקות ב-110 G ובטמפרטורת החדר כדי לשקע את חלקיקי הרקמה, אספו את העילאי ולאחר מכן השקיעו את תמיסן התאים.

בשלב זה השליכו את הנוזל העליון והשעיקו מחדש את התאים ב-10 עד 50 מיליליטר של RPMI מלא. בהתאם לגודל המשקע, קבעו את מספר התאים החיוניים באמצעות שיטת הדחת tripan blue, ולאחר מכן הניחו את תרחיף התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם מכסה רפוי כדי לבודד את התאים האפיתליים של הטימוס (t. epithelial cells). לאחר מכן, השעיקו מחדש את שאריות הרקמה ב-10 מיליליטר של תמיסת collagenase DNA טרייה, בתוספת 10 מיליליטר של RPMI ו-trypsin EDTA.

המשיכו בעיכול של שברי הרקמה למשך 40 דקות בטמפרטורה של 37 °C עם סיבוב עדין. במהלך 10 עד 15 הדקות האחרונות של הדגירה, הוסיפו סרום עגל עוברי (fetal calf serum) ביחס של אחת לחמש כדי לנטרל את ה-trypsin. לאחר השקיעה של שברי הרקמה, אספו את העלייה (supernatant) וסובבו שוב את תרחיף התאים.

בשלב זה, שאבו בזהירות והשליכו את הנוזל העליון, תוך הקפדה על שימור המשקע הרפויה. לאחר ספירת מספר התאים החיוניים, הניחו גם תרחף תאים זה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. כדי להעשיר את פראקציית הדחיסות הנמוכה או תאי LDF, התחילו בריכוז של תרחפי התאים שהופרשו קודם לכן עבור העשרה של DC ו-tech, בזמן שהתאים מסתחררים למטה.

הכינו מדרג צפיפות Percoll בריכוז 1.07 גרם למילליטר. בהתאם לטבלה זו, השעו את שני המשקעים עד לריכוז של 1×10⁹ תאים בשש מיליליטר של תמיסת Percoll שהוכנה. ערבבו את תמיסת התאים מספיק כדי לקבל תמיה הומוגנית, ולאחר מכן העבירו את התמיסות למבחנות צנטריפוגה עם מכסה הברגה מCpolycarbonate של Oakridge בנפח 50 מיליליטר.

בשלב הבא, השתמשו בפיפטה כדי להוסיף באיטיות 30 milliliters של RPMI מלא לכל מבחנה, כשכבה מעל ת сусפנסיית תאי ה-perca. תוך הקפדה לא לערבב את השכבות, העבירו בזהירות את המבחנות לצנטריפוגה שקודרה מראש עם רוטור בזווית קבועה והפרידו את התאים למשך 35 דקות. לאחר מכן, השתמשו בפיפטות סטריליות כדי להעביר בזהירות את פראקציות התאים העשירות בעלות הצפיפות הנמוכה, מממשק ההפרדה שבין תאי ה-per לבין המדיום, אל תוך מבחנות של 50 milliliter המכילות RPM מלא קר.

לאחר מכן, אני ממלא את המבחנות ב-RPMI מלא נוסף כדי לדלל את השאריות לכל תא. לבסוף, שוטף את התאים המועשרים פעמיים ב-RPMI מלא, לאחר מכן תולה מחדש את המשקע במצע טרי וקובע את מספר התאים החיוניים באיור ראשון זה. נראה כאן מקטע רקמה גדול למדי של תשעה סנטימטרים שהושג מילד בן 6 שנים, כפי שהודגם זה עתה.

שלב ראשון חשוב הוא ניקוי הרקמה מחלקים לא רצויים. כפי שמוצג על ידי החצים הלבנים, התקבל תרחיף של תאים בודדים מרקמת תימוס, אשר הועשר בתאי פראקציית צפיפות נמוכה. בעוד שתרחיף תאים בודדים טיפוסי מכיל כ-3% תאים חיוביים ל-H-L-A-D-R לאחר הפרדה במדרג צפיפות, אחוז זה עולה ל-15 עד 40% בתאים הגדולים.

שבר דחיפות נמוכה בתוך שבר הדחיפות הגבוהה, המורכב בעיקר מתיםוציטים אחידים וקטנים. כמעט ואין תאים תימיים מסוג זה.

ניתן לזהות תאים דנדריטיים מיאלואידיים על ידי ביטוי של מספר סמני שטח, כולל CD 11 C. דמות זו מראה בידוד יעיל של תאים חיוביים ל-CD 11 C באמצעות פרוטוקול שונה של הפרדת תאים מגנטית לאחר הבידוד. רמת הטוהר של תאים דנדריטיים חיוביים ל-CD 11 C הייתה 93%, כפי שנקבע על ידי צביעה אימונוהיסטוכימית של התאים המבודדים. בממוצע, התשואה של תאים מיאלואידיים דנדריטיים חיוביים ל-CD 11 C המבודדים היא 5×10⁵ עד 5×10⁶ תאים לכל 10⁹ תאי תימוס סה"כ.

בטבלה זו מוצגים נתונים מייצגים שהתקבלו ממספר דגימות תימוס בודדות בגילים ובמשקלי רקמה שונים, עם טווח של תרחופים של תאים בודדים (single cell suspensions) כקלט, כמו כן מספר התאים הכולל בחלק בעל הצפיפות הנמוכה (low density fraction), והתנובה והטוהר העוקבים של תאים חיוביים ל-CD 11 C, בחלק המועשר בתאים מציגי אנטיגן בלבד. כ-0.5% מהתאים הם תאי אפיתל קורטיקליים ומידולריים שהם CD 45 low, EPCA חיוביים או CD 45 שליליים ו-EPAM חיוביים; ניתן למיין אותם מהתאים הסטרומליים המועשרים, השליליים/נמוכים ל-CD 45 שעברו עיכול בטריפסין, כ-epam low, CDR two חיוביים ו-epam high, CD two שליליים, בהתאמה. בידוד של תאים דנדריטיים ותתי-אוכלוסיות של תאי אפיתל תימסיים מתימוס אנושי.

התהליך תלוי בזמן. ככל שפרוצדורת העלולציה (ululation) מהירה יותר, כך מצב התאים יהיה טוב יותר. לאחר השליטה בפרוטוקול זה, ניתן לבודד תאי דנדריטיים תוך חמש עד שש שעות ותאי אפיתל תיימיים תוך שמונה עד 10 שעות.

לאחר צפייה בסרטון זה, תשיגו הבנה מעמיקה של אופן הטיפול ברקמת תימוס אנושית לצורך בידוד מוצלח של תאי דנדריטיים ותאי אפיתל של התימוס. התאים המבודדים יכולים לשמש לאחר מכן במגוון יישומים שונים במחקרים המשכיים, במטרה לאפיין אותם יותר ולהבין טוב יותר את הביולוגיה שלהם.