התקן תזרים הלשכה תלת ממדי רומן ללמוד chemokine ביים-extravasation של תאים במחזור בתנאי זרימה פיסיולוגיים

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא למדוד באופן כמותי את נדירתן של תאים במחזור הדם לעבר מדרג של כימואטראקטנטים. בתנאים של מאמץ גזירה פיזיולוגי, הדבר מושג תחילה על ידי גידול של שכבה אחת של תאי אנדותל על גבי רכיבים רב-נקביים (microporous inserts) מצופים בקולגן, ולאחר מכן הרכבתם בתוך תא זרימה שבו הם מכסים מדור סטטי נפרד המכיל כימואטראקטנטים. לאחר מכן, מאמץ גזירה מופעל על התאים כדי לדמות את התנאים הפיזיולוגיים בכלי הדם.

כשלב שני, תאי בדיקה רלוונטיים, כגון תאי גזע לוקוציטים או תאי גידול, מופנים להזרמה במערכת התלת-ממדית במהלך הסירקולציה. התכנים במדור הסטטי משפיעים על יעילות האינטראקציות בין התאים המסתובבים לתאי האנדותל, ובעקבות זאת על קצב התמעבר (transmigration) של תאי הבדיקה דרך שכבת האנדותל. לאחר מכן, המערכת התלת-ממדית מפורקת ותאי הבדיקה שהעברו תמעבר נאספים מהמדור הסטטי התחתון כדי למדוד כמותית את התהליך באמצעות שיטות מתקדמות שונות. התוצאות המתקבלות מראות את יכולתם של תאי הבדיקה במחזור הדם לקיים אינטראקציה עם תאי אנדותל בתנאי זרימה פיזיולוגית ולצאת מהסירקולציה בהתבסס על ריכוז הכימוקינים במדור הסטטי.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שימוש בתאי זרימה למינרית מקבילית ומבדקי העברה סטטיים, הוא שהיא משלבת הן מאמץ גזירה במדור העליון והן כימואטרקציה במדור הסטטי התחתון. דבר זה מאפשר לחוקרים למדוד באופן כמותי את היציאה החוצה (externalization) של תאים במחזור הדם לעבר מדרג הכימואטרקציה ובתנאים של זרימה פיזיולוגית. ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לחקור את השפעת התקשורת (crosstalk) בין תאי המיקרו-סביבה המקומית לתאי אנדותל על נשירה (extravasation) של תאים מהמחזור הדם.

על ידי סיוע בשכבה נוספת של תאים במאט (insert) נפרד מתחת לתאי האנדותל, התהליך יודגם על ידי ולנטינה אגנסט רובה, טכנאית מהמעבדה שלי. לתחילת הדברים, חשבו את מספר המאטים הדרושים לניסוי והניחו כל מאט בצלחת פטרי סטרילית נפרדת. סטריליזציה תבוצע באמצעות הקרנת גמא עד שהמינון הכולל יגיע ל-11 gray, בהתאם להגדרות האישיות.

לאחר מכן, דללו את תמיסת המאגר של קולגן מסוג 1 (collagen type one) לריכוז של 50 µg/mL באמצעות חומצה כלורית (hydrochloric acid) בריכוז 0.01 M המאוחסנת בטמפרטורה של 4 °C, והכינו אליקוויטות של 154 µL מהתמיסה הסופית עבור כל אינסרט (insert). לאחר מכן, טפטפו מספר טיפות מהתמיסה על פני השטח של האינסרט בתבנית מעגלית.

לאחר מכן, הוסיפו את שאר המנה כדי ליצור טיפה אחת גדולה על פני השטח של המבנה (insert). ודאו שקצה הפ pipette אינו נוגע במבנה בשום שלב ושהקולגן מכסה את כל פני השטח של המבנה, אך אינו נשפך החוצה. ברגע שהמבנה מכוסה, הניחו את המכסה על פטרי dish והניחו אותה בזהירות על משטח שטוח.

דגרו את ההכנסות למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר; לאחר הדגירה, שאבו את תמיסת הקולגן ושטפו את הממברנה עם 160 microliters של PBS. לאחר מכן, שאבו את ה-PBS. החזירו את המכסה ועטפו את הצלחת ב-paraform.

אם התבניות ישמשו באותו היום, יש להניח את פטריאת הפטרי במיקום יבש בטמפרטורת החדר. אחרת, יש להניח את הפטריאה בטמפרטורה של 4 °C ולהשתמש בתבנית בתוך שבעה ימים. יש לקצור תאי אנדותל של וריד טבילית אנושי (human umbilical vein endothelial cells) ממש לפני השימוש ולהשעות אותם מחדש במצע התרבית הרצוי בריכוז של 2.5 מיליון תאים למילליליטר.

בעת ספירת התאים, ודאו כי חיוניות התאים גבוהה מ-98% באמצעות תזריק trypan blue, ולאחר מכן הוסיפו 160 µL מתליםיית התאים לכל אינסרט. יש להניח תחילה מספר טיפות קטנות במעגל על פני השטח של האינסרט המצופה בקולגן, ולאחר מכן להוסיף בזהירות את שאר תליסיית התאים ליצירת טיפה אחת גדולה. בסיום, החזירו את המכסים והניחו בזהירות את הצלחות בתוך אינקובטור עם 5% carbon dioxide בטמפרטורה של 37 °C, והדגרימו למשך 30 דקות כדי לאפשר לתאים להיצמד לממברנה.

לאחר 30 דקות, הוציאו את הפלטות מהאינקובטור והוסיפו בעדינות חמישה מיליליטרים של מצע תרבית שחומם מראש מעל כל תבנית (insert). יש להקפיד שהתבנית תישאר בתחתית הצלחת ותהיה מכוסה לחלוטין במצע. לאחר מכן, החזירו את המכסים והחזירו בזהירות את הצלחות לאינקובטור התרבית.

הדגרירו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה. להרכבת תא הזרימה, הבריגו תחילה את הפלטות העליונה והתחתונה זו לזו. לאחר מכן, חברו את הפלטות ליחידת חילוף הגזים באמצעות צינור PVC בעל קוטר פנימי של 1.42 mm ועובי דופן של 0.8 mm.

בשלב הבא, הניחו את המכשיר המורכב בתוך שקית פלסטיק נקייה ועקרו אותו באמצעות הקרנת גמא עד שהמינון הכולל יגיע ל-11 gray. השלב הבא הוא להוציא מגש מדגרה, להניחו בתוך מנדף סטרילי לתרביות רקמה ולעקרו באמצעות 70% ethanol. לאחר מכן, כסו את המגש במפית סטרילית גדולה.

בשלב הבא, הוצאו את המכשיר מהשקית מפלסטיק והניחו אותו על מגש אינקובטור סטרילי. לאחר מכן, חברו את המכשיר למשאבה הפריסטלטית ותכנתו את המשאבה לפעול במהירות של 0.2 milliliters per minute. העבירו באמצעות פיפטה חמישה עד שבעה milliliters של מצע הגידול הרצוי לתוך מבחנה סטרילית של 15 milliliter שתשמש כפתח הכניסה.

לאחר מכן, נתק את צינור הכניסה מהיציאה על ידי משיכת המחט המתכתית מתוך הצינור באמצעות מפיות סטריליות קטנות כדי לשמור על סטריליות הצינור; הכנס את מחט הכניסה המתכתית לתוך מבחנה של 15 מיליליטר המכילה את המצע, והכנס את צינור היציאה לתוך מבחנה ריקה של 15 מיליליטר. לאחר מכן, הפעל את המשאבה כך שהזרימה תהיה נגדית לשעון. אפשר ללחץ השלילי לשאוב את המצע ממבחנת הכניסה של 15 מיליליטר אל תוך הצינור, ועצור את המשאבה כאשר המצע מגיע לקצה הצינור, רגע לפני כניסתו למכשיר.

לאחר מכן פתחו את המכשיר על ידי הברגת פלטות התעלות והסירו בזהירות את הפלטה העליונה. השתמשו בפיפטה כדי להעביר 1,550 µL של מדיום לבארים התחתונות, תוך הבטחה כי הבארים מכילות מספיק מדיום כדי ליצור חצי כדור המגיע לגובה של one to two mm מעל הפלטה התחתונה. לאחר מכן, העבירו את התוואים (inserts) שהוכנו מהצלחות הפטרי לבארים של הפלטה התחתונה. בעזרת פינצטה סטרילית, ודאו שאין בועות כלואות מתחת לתוואים ושאבו כל מדיום המופיע על פני השטח של הפלטה התחתונה.

לאחר מכן, החזירו את הפלטה העליונה על הפלטה התחתונה וחברו אותן מחדש. בעזרת הברגים, הפעילו מיד את משאבת הפריסטלטיקה ואפשרו למדיום לזרום דרך המכשיר התלת-ממדי. הגביהו את קצה היציאה של המכשיר ושמרו על התא במצב זה כדי למנוע היווצרות בועות ברווח שבין הפלטות.

המשיכו למלא במדיום את הפיתול המחבר בין התא ליחידת חילוף הגזים, עד שהמדיום יגיע ליחידת חילוף הגזים. לאחר מכן, העבירו שלושה מיליליטרים של מדיום אל יחידת חילוף הגזים. הפעילו את המשאבה ואפשרו לבועות האוויר לצאת דרכה.

הגביהו את היחידה כדי לאפשר למצע למלא את הפיתול שיוצא ממנה, ועצרו את המשאבה כאשר המצע נמצא במרחק של שני עד שלושה סנטימטרים מהסוף. לאחר השלמת ההכנה (priming), חברו את מחט הכניסה לפיתול היציאה באמצעות מגבונים סטריליים קטנים. לאחר מכן, הפכו את כיוון פעולת המשאבה כך שהמצע יזרום עם כיוון השעון לעבר יחידת חילוף הגזים, וודאו שכל בועות האוויר שנותרו הוסרו.

כאשר המשאבה שוב זורמת נגד כיוון השעון, הוסיפו 100 µL של תרחיף תאי הבדיקה ליחידת חילופי הגזים. לאחר מכן, סגרו את מכסה הרספיטור.

החזירו את המגש לאינקובטור ואפשרו לתאי הבדיקה להזרים בתוך המכשיר בטמפרטורה של 37 °C. לאחר שהזמן הרצוי חלף, הוציאו את המגש עם המערכת הפעילה מהאינקובטור והניחו אותו במנדף. עצרו את המשאבה, נתקו את פתחי הכניסה והיציאה והניחו את הקצוות לתוך מבחנות סטריליות ריקות של 15 mL.

לאחר מכן הפעילו את המשאבה ואספו את תרחיף התאים מהמערכת. הניחו את תרחיף התאים על קרח עד לשימוש. לאחר מכן, פרקו את התא על ידי הסרת הברגים והנפת הפלטה העליונה.

הוציאו את המבני המוספים (inserts) מהפלטה התחתונה והעבירו אותם לצלוחיות פטרי לצורך צביעה או איסוף תאים. לבסוף, הוציאו את תרחיף התאים מהבארים התחתונות והעבירו אותו למבחנות של 15 milliliter. שטפו כל באר פעמיים עם 1.5 milliliters של מצע והוסיפו אותו למבחנה המתאימה.

לאחר מכן, סבבו את המבחנות בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-200 Gs ועבדו את התאים בהתאם למטרות ניסיוניות ספציפיות, כגון אלה המפורטות בפרוטוקול הטקסט המצורף. להלן דוגמה לאחד הבדיקות הרבות שניתן לבצע באמצעות מערכת זו. ההגדרה כוללת תאי אנדותליות ממקור של מחוליל גרם המגודלים על גבי רכיבי הכנסה (inserts) בעלי נקבים בגודל חמישה מיקרון; מתחת לרכיבי ההכנסה הוסף stromal cell derived factor one או SDF-1 בריכוזים של 0, 5 או 50 ng/mL.

תאי מחית עצם הושארו להזרים במערכת התלת-ממדית. תאים שנדדו דרך הרכיב המוחדר (insert) נאספו ולאחר מכן תורגלו על פלטות עם מצע Methylcellulose. בנוכחות גורמי גדילה המטופויטיים הגורמים לתאי פרוגניטור להקים מושבות, נספר מספר המושבות לאחר 14 ימים כדי לקבוע את מספר תאי הפרוגניטור בכל באר ולה aו להדגים את יכולתם לנדוד לעבר sdf.

אחד תחת תנאים של זרימה פיזיולוגית. עם הוספת פיברובלסטים סטרומליים שגדלו על המאסף התחתון בתא הסטטי, תאי המטופואזה רבים יותר נדדו מהמחזור אל התא עם הוספת sdf, אחד ב-50 nanograms per milliliter, מאשר עם SDF אחד בלבד לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחומים שונים של מדעי הרפואה והביולוגיה למדל מיטות כלי דם ספציפיות לרקמה in vitro ולחקור מנגנונים תאיים ומולקולריים המתווכים נדידה של תאים מהמחזור לעבר רקמות תקינות לעומת חולות.