Name: התקן תזרים הלשכה תלת ממדי רומן ללמוד chemokine ביים-extravasation של תאים במחזור בתנאי זרימה פיסיולוגיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: למדו להשתמש במכשיר תזרים תלת-ממדי לחקר נדידת תאים ויציאתם מהכלי הדם תחת מתח גזירה פיזיולוגי. שיטה זו מאפשרת מדידה כמותית של אינטראקציות בין תאי אנדותל לתאים מחוללים במחקרי סרטן וחסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לצ&#39;אק סקוט מק &#39;נייט מויקטור והלשכה מרכזית לסטטיסטיקה המדעית החברה Inc <a href="http://www.cbsscientific.com/" target="_blank">(www.cbsscientific.com)</a> לקבלת סיוע, הנדסה וייצור של חדר 3D, יחידת חילוף גזים, ומוסיף. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומי לבריאות (מענקי R21DK067084 וR43CA141782 לSKK).

1. הכן את הוספת העליונה ותחתונה לצמיחה תאי ציפוי על ידי קולגן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מספר מוסיף דרושים לניסוי. הנח להכניס כל אחד בצלחת פטרי סטרילית נפרדת (35 x 10 מ&quot;מ) ולעקר על ידי הקרנה (11 Gy). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון קולגן לציפוי של ממברנות: 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל, 154 μl לכל כנס (להוסיף שטח פנים 1.54 ס&quot;מ 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כמה טיפות (~ 20 μl לכל טיפה) של פתרון קולגן במעגל על ​​פני השטח של הקרום להוסיף (אל תיתן לקצה פיפטה לגעת במשטח) ולאחר מכן להוסיף את שאר aliquot בקפידה כדי ליצור טיפה אחת גדולה על משטח הממברנה. ודא שפתרון קולגן נשאר חצי כדור ולא ניקוז מהמשטח הממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את צלחת פטרי עם מכסה והדגירה במשך שעת 1 בטמפרטורת חדר על משטח שטוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון קולגן ולשטוף את הממברנה פעם אחת על ידי כיסוי עם 160 PBS μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ASPIRAte PBS ולהחליף את המכסה. אם אתה משתמש באותו היום, הנח את צלחת פטרי במקום יבש בטמפרטורת חדר. אחרת, מניח את הצלחת על 4 מעלות צלזיוס ולהשתמש להכניס בתוך 7 ימים. </li></ol> 2. תאי האנדותל תרבות על הוספת העליונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן השעיה EC במדיום התרבות רצויה. להבטיח כי כדאיות התא היא&gt; 98% ולהשתמש באופן מיידי. </li></ol> הערה: אדם טבור וריד EC (HUVEC), 4 משמש x 10 5 תאים ב160 μl לכל כנס. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את צלחות פטרי עם מוסיף קולגן מצופים שהוכן בסעיף 1; לא להסיר את מוסיף מהכלים. מניחים כמה טיפות קטנות של ההשעיה התא (כ -20 μl לטיפה) במעגל על ​​פני השטח של קרום קולגן המצופה (לא נותן מגע קצה פיפטה פני השטח) ולאחר מכן להוסיף את שאר ההשעיה התא כדי ליצור זהירות טיפה אחת גדולה. להבטיח כי ההשעיה התא נשארת Hemis<html> pherical ולא ניקוז מהמשטח הממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את המכסים ומניחים בזהירות את הכלים ב5% CO 2 תא תרבות חממת דגירה (בלי ללחוץ) על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות על מנת לאפשר לתאים לצרף את הקרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוסיף 5 מ&quot;ל של מדיום תרבות לכל צלחת פטרי להבטיח שההוספה נשארה בתחתית הצלחת ומכוסית לחלוטין על ידי המדיום. החלף את המכסים ובזהירות הניח את הכלים בחזרה בחממה. תרבות התאים ב 37 ° C במשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באותה גישה כדי להכין את הכנס השני (אופציונלי) נמוך יותר עם תאים המייצגים את microenvironment המקומי, אשר יהיה ממוקם מתחת להוספה המכילה שכבת EC. </li></ol> הערה: אם את מוסיף הנמוך נכללים בניסויים, מוסיף העליון ותחתון ראשונה הם מחוברים זה לזה לפני הצבת מחדירה לתוך מכשיר 3D (איור 4). דואר &quot;&gt; 3. להרכיב את מכשיר תזרים לשכת 3D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדפוק ביחד את הצלחות העליונות ותחתונות, לחבר את הצלחות ליחידת חילופי הגז באמצעות צינורות, הצב את המכשיר התאסף לתוך שקית פלסטיק נקי, ולעקר את התיק ותכולתו על ידי ההקרנה (11 Gy). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מגש מדף מתא תרבות החממה, המקום לברדס רקמת סטרילית תרבות, תרסיס עם 70% אתנול, נגב את, ואז לכסות את המגש עם מפית סטרילי גדולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את שקית הניילון המוקרנת למכסת המנוע, הסר את ההתקן מהשקית ומניח על מגש החממה סטרילית. לחבר את המכשיר למשאבת peristaltic עם צינורות שסופקו. תכנית המשאבה למהירות אופטימלית של 0.2 מ&quot;ל / דקה. </li></ol> הערה: כדי להתחבר עם שקע חשמל המשאבה, extrude חוט החשמל דרך החור בישבן של החממה. השתמש בתוסף שודד סביב החוט כדי להבטיח כי החור הוא אטום. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; מקום 7 - 5 מ&quot;ל של מדיום התרבות רצויה לתוך צינור סטרילי 15 מ&quot;ל (עבור &quot;הכניסה&quot;). </li></ol> 4. ראש התקני תזרים לשכת 3D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתק את צינורות היניקה מהשקע על ידי משיכת מחט המתכת מהצינורות (השתמש מפיות סטריליות קטנות כדי לשמור על סטריליות של הצינור). השתמש במחט המתכת המחוברת לצינורות כמו &quot;כניסה&quot; וסופו של דבר נותק מצינורות כמו &quot;שקע&quot;. הנח את כניסת מחט המתכת לתוך שפופרת 15 מ&quot;ל עם התקשורת; למקם את השקע לתוך שפופרת 15 מ&quot;ל הריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה כך הזרימה נגד כיוון השעון ולהגדיר את קצב הזרימה ב0.2 מ&quot;ל / דקה. אפשר ללחץ השלילי לצייר בינוני מצינור הכניסה 15 מ&quot;ל לתוך צינורות ולהפסיק את המשאבה כאשר בינונית מגיע לסוף הצינור באופן מיידי לפני שהוא מתחבר למכשיר (איור 2, עצירת # 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הברג החוצה את הצלחות העליונות ותחתונות של המכשיר. להסיר את הצלחת העליונה ומקום 1,500 זהירות - 1,550 μl של Mediאום (או מדיום לבד או בתוספת כמוקינים הניסיוניים) לתוך הבארות הנמוכות יותר. ודא גם מכיל בינונית מספיק כדי ליצור חצי כדור שמגיע לכ 1 - 2 מ&quot;מ מעל הצלחת נמוכה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התותב שהוכן מצלחת פטרי לבארות של הצלחת התחתונה באמצעות מלקחיים סטריליות, ולוודא כי אין בועות לכודות מתחת למוסיף. לשאוב כל מדיום שמופיע על פני השטח של הצלחת התחתונה על מנת להבטיח את הצלחת שנשארה יבשה. מניחים את צלחת גב העליונה לצלחת התחתונה ולהתחבר מחדש את הצלחות באמצעות הברגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להפעיל את משאבת peristaltic ולאפשר מדיום לזרום דרך מכשיר 3D. לרומם את סוף היציאה של המכשיר ולשמור את החדר במצב זה כדי למנוע היווצרות של בועות בתוך החלל בין הלוחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר את המדיום כדי למלא את החדר ואת צינורות המחבר את התא ליחידת חילוף הגזים. להפסיק את המשאבה מייד לפני בינוני מגיע לדואר הגזיחידת Xchange (איור 2; תפסיק # 2). מקום 3 מ&quot;ל של מדיום ליחידת חילוף הגזים, להפעיל את המשאבה, ולאפשר לבועות האוויר כדי לברוח באמצעות יחידת חילוף הגזים. לרומם את יחידת חילוף הגזים כדי לאפשר את המדיום כדי למלא את צינור יציאה מיחידת חילוף הגזים ולעצור את המשאבה כאשר מגיע בינונית 2 - 3 ס&quot;מ לפני סוף הצינור מוצא (איור 2, עצירת # 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את מחט מתכת הכניסה לפורקן באמצעות מפיות סטריליות קטנות. לתכנת מחדש את המשאבה, כך שהתזרים הבינוני בכיוון ההפוך (בכיוון השעון) לעבר יחידת חילוף הגזים ולוודא שכל בועות אוויר יוסרו ברגע שהם מגיעים ליחידת חילוף הגזים. בדוק שלא יישארו בועות אוויר במערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתכנת מחדש את המשאבה כל כך בינוני תזרימי נגד כיוון השעון. הוסף 100 μl של ההשעיה תא הבדיקה ליחידת חילוף הגזים. סגור את המכסה של יחידת חילוף הגזים, הנח את המגש עם החלק האחורי עובד המערכת לתוך החממה, ולאפשר לתאים לבדיקת circulatדואר במכשיר 3D על 37 מעלות צלזיוס למשך הזמן הרצוי. </li></ol> שים לב: יש לנקות את חוט החשמל של המשאבה של 70% אתנול ולמקם אותו בתוך החממה. 5. לסיים את המבחן ולאסוף דגימות עבור assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המגש עם מערכת העבודה מהחממה והמקום במכסת המנוע. להפסיק את המשאבה, נתק את הכניסה ויציאה, ומקם את הקצוות לתוך צינורות 15 מ&quot;ל סטרילי ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה ולאסוף את ההשעיה התא מהמערכת; מקום ההשעיה התא על קרח, במקרים מתאימים, עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרק את התא על ידי הסרת הברגים ומרים את הצלחת העליונה. הסר את מוסיף מהצלחת התחתונה ולהעביר אותם לצלחות פטרי. </li></ol> הערה: יכול להיות מוכתם מחדיר לדמיין ולספור תאים באתרו (סגול גביש 0.05% ב DH 2 O) או trypsinized לאסוף EC לעוד יותרבדיקות. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום ותאים מהבארות הנמוכות לתוך צינורות וצנטריפוגות במשך 5 דקות ב 210 x גרם. הסר את supernatant, לשטוף וresuspend התאים המועדפים, ולעבד את התאים בהתאם למטרות הניסוי הספציפיות (נדון בהמשך). </li></ol>

<ol><li>Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+and+perils+of+stem+cell+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The promise and perils of stem cell therapeutics.</a> Cell Stem Cell. 10, 740-749 (2012).</li>
<li>Khaldoyanidi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+stem+cell+homing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directing stem cell homing.</a> Cell Stem Cell. 2, 198-200 (2008).</li>
<li>Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+trafficking+in+tissue+development%2C+growth%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease.</a> Cell. 132, 612-630 (2008).</li>
<li>Lapidot, T., Kollet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain-bone-blood+triad%3A+traffic+lights+for+stem-cell+homing+and+mobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology+Am.+Soc.+Hematol.+Educ.+Program%22%5BJournal%5D)">The brain-bone-blood triad: traffic lights for stem-cell homing and mobilization.</a> Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2010, 1-6 (2010).</li>
<li>Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoengineering+of+HCELL%2C+the+human+bone+marrow+homing+receptor%3A+sweetly+programming+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Glycoengineering of HCELL, the human bone marrow homing receptor: sweetly programming cell migration.</a> Ann. Biomed. Eng. 40, 766-776 (2012).</li>
<li>Smart, N., Riley, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stem+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">The stem cell movement.</a> Circ. Res. 102, 1155-1168 (2008).</li>
<li>Khaldoyanidi, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDA-MB-435+human+breast+carcinoma+cell+homo-+and+heterotypic+adhesion+under+flow+conditions+is+mediated+in+part+by+Thomsen-Friedenreich+antigen-galectin-3+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">MDA-MB-435 human breast carcinoma cell homo- and heterotypic adhesion under flow conditions is mediated in part by Thomsen-Friedenreich antigen-galectin-3 interactions.</a> J. Biol. Chem. 278, 4127-4134 (2003).</li>
<li>Le Devedec, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Photon+Intravital+Multicolour+Imaging+to+Study+Metastatic+Behaviour+of+Cancer+Cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-Photon Intravital Multicolour Imaging to Study Metastatic Behaviour of Cancer Cells in vivo.</a> Methods Mol. Biol. 769, 331-349 (2011).</li>
<li>Barakat, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsiveness+of+vascular+endothelium+to+shear+stress%3A+potential+role+of+ion+channels+and+cellular+cytoskeleton+%28review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Responsiveness of vascular endothelium to shear stress: potential role of ion channels and cellular cytoskeleton (review).</a> Int. J. Mol. Med. 4, 323-332 (1999).</li>
<li>Fisher, A. B., Chien, S., Barakat, A. I., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cellular+response+to+altered+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial cellular response to altered shear stress.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, L529-L533 (2001).</li>
<li>Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+force+and+its+effect+on+cell+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22ASGSB+Bull%22%5BJournal%5D)">Shear force and its effect on cell structure and function.</a> ASGSB Bull. 4, 87-94 (1991).</li>
<li>Topper, J. N., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+flow+and+vascular+gene+expression%3A+fluid+shear+stress+as+a+modulator+of+endothelial+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Med.+Today%22%5BJournal%5D)">Blood flow and vascular gene expression: fluid shear stress as a modulator of endothelial phenotype.</a> Mol. Med. Today. 5, 40-46 (1999).</li>
<li>Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rolling+and+adhesion+of+human+tumor+cells+on+vascular+endothelium+under+physiological+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions.</a> J. Clin. Invest. 92, 3038-3044 (1993).</li>
<li>Cinamon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+chemokine+functions+in+lymphocyte+migration+through+vascular+endothelium+under+shear+flow%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel chemokine functions in lymphocyte migration through vascular endothelium under shear flow.</a> J. Leukoc. Biol. 69, 860-866 (2001).</li>
<li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+progenitor+cell+rolling+in+bone+marrow+microvessels%3A+parallel+contributions+by+endothelial+selectins+and+vascular+cell+adhesion+molecule+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1.</a> J. Exp. Med. 188, 465-474 (1998).</li>
<li>Arber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graft+source+determines+human+hematopoietic+progenitor+distribution+pattern+within+the+CD34%28%2B%29+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Graft source determines human hematopoietic progenitor distribution pattern within the CD34(+) compartment.</a> Bone Marrow Transplant. 46, 650-658 (2012).</li>
<li>Fuji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+as+a+preferable+source+of+stem+cells+for+salvage+transplantation+in+patients+with+graft+failure+after+cord+blood+transplantation%3A+a+retrospective+analysis+of+the+registry+data+of+the+Japanese+Society+for+Hematopoietic+Cell+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood as a preferable source of stem cells for salvage transplantation in patients with graft failure after cord blood transplantation: a retrospective analysis of the registry data of the Japanese Society for Hematopoietic Cell Transplantation.</a> Biol. Blood Marrow Transplant. 18, 1407-1414 (2012).</li>
<li>Haspel, R. L., Miller, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells%3A+source+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Stem+Cell+Res.+Ther%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells: source matters.</a> Curr. Stem Cell Res. Ther. 3, 229-236 (2008).</li>
<li>Schraufstatter, I. U., Discipio, R. G., Zhao, M., Khaldoyanidi, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C3a+and+C5a+are+chemotactic+factors+for+human+mesenchymal+stem+cells%2C+which+cause+prolonged+ERK1%2F2+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">C3a and C5a are chemotactic factors for human mesenchymal stem cells, which cause prolonged ERK1/2 phosphorylation.</a> J. Immunol. 182, 3827-3836 (2009).</li>
</ol>

אשד LifeSciences בע&quot;מ בעל זכויות בלעדיות בארה&quot;ב פטנט מס &#39;7,927,867 B2 &quot;מכשיר להערכה בנדידת תאים במבחנה בתנאי זרימה ושיטות לשימושים ממנו&quot;. SKK הוא ממציא של טכנולוגית מכשיר תא זרימת 3D והמייסד מדעי ובעל מניות של אשד LifeSciences בע&quot;מ

extravasation התא הוא תהליך שבו תאים במחזור הדם ולצאת מהוא רכיב קריטי של תגובות פיסיולוגיות רבות בגוף. התהליך חשוב גם להתחדשות רקמות, כמו למשל, כאשר תאים טיפוליים גויסו מרקמות לתוך כלי הדם (או הזרקה תוך ורידית) נודדים דרך כלי הדם ולצאת ממחזור הדם לאתרים של פציעה או ניוון. Extravasation הוא גם מרכיב קריטי של פתוגנזה של מחלות רבות, כולל דלקת, דחייה של מערכת חיסון, אוטואימוניות, וגרורות גידול. Extravasation הוא תהליך רב שלבים מורכבים שכרוכים באינטראקציה של מחזורי תאים עם תאי האנדותל (EC) בתנאים של זרימה פיזיולוגית. התהליך מורכב (א) מתגלגל תא, (ב) הידבקות חברה אל פני השטח luminal של EC, ו (ג) על פני גלגול EC. חשוב מכך, כל צעד של מפל extravasation מוסדר על ידי קבוצת משנה של גell מולקולות מינים ספציפי סוג ספציפי ו. עם זאת, המנגנונים המולקולריים המפורטים המסדירים extravasation של תת תא ספציפי אינם מובנה היטב, בעיקר בשל הקושי הטכני של משחזר את התנאים בדם. מכשיר 3D הרומן מתואר כאן נועד להתגבר על האתגרים טכניים אלה ולאפשר ניסויים שיש לבצע שישפרו את ההבנה של הביולוגיה של נדידת תאים שלנו. המולקולות שמתווכות נדידת תאים הן מטרות טיפוליות חשובות. הבנה מפורטת של האירועים המולקולריים השולטים בהגירה של תאים מסוגים ספציפיים תסייע בזיהוי מטרות חדשות לקידום הטיפולי או העיכוב של extravasation. לדוגמה, התערבויות המשפרות את הנדידה של תאי גזע טיפוליים (בין אם נובעים מרקמות עובר למבוגרים, ילוד או אפילו מ) לכיוון אתרים של פציעה או ניוון תהיה תועלת רבה בהתחדשות רקמות.יש עניין גובר והולך בדור במבחנה של תאי גזע טיפוליים, כוללים תאים שמקורם ממקורות, וpluripotent בתאים לשעבר vivo מניפולציות גזע בוגרים (הרחיב, מניפולציות גנטית, וpretreated עם אנזימים שונים) 1. לפיכך, יש צורך בטכנולוגיות חדישות כדי להעריך את איכותם של תאי גזע לפני שהם משמשים למטרות טיפוליות. בין פרמטרים אחרים, התאים חייבים להיות מסוגלים לצאת ממחזור הדם בצורה יעילה, מפני שטיפולים בהפרעות multifocal עשויים לדרוש עירוי לוריד של תאי הגזע 2. ואכן, אחד האתגרים הנוכחיים בביולוגיה של תאי גזע הוא להתגבר על היעילות הנמוכה ביותר שבה תאי גזע לאתרי הבית של נזק לרקמות 3-6, המדגיש את הצורך להתייחס לפער הזה בהבנה של נדידת תאי גזע שלנו. בניגוד לכך, אסטרטגיות שנדידת תאי בלוק על ידי מיקוד מולקולות ביות ספציפית תהיה שימושית לטיפול במחלות אוטואימוניות וflammatory כמו גם סרטן גרורתי. לפיכך, הבנת המנגנונים המולקולריים המתווכים את יחסי הגומלין בין תאים במחזור ו-EC במהלך נדידת תאים וextravasation היא רלוונטית לרפואת translational וגילוי תרופות, כמו גם למדע בסיסי. כרגע יש מספר השיטות זמינות כדי ללמוד היבטים של נדידת תאים שונים. עם זאת, יש שיטות אלה ליקויים שניתן להתגבר עם מכשיר 3D החדש. מודלים של בעלי חיים: מודלים של בעלי חיים כמו עכברי מדוכאי חיסון ועכברים מניפולציות גנטית, היו כלים שימושיים ללימודי ההגירה של תאים אנושיים in vivo. עם זאת, חסרון משמעותי אחד למודלים אלו הוא שתאים אנושיים אינטראקציה גרועה עם מולקולות הדבקה בהווה על העכבר EC, בין השאר בשל הבדלי רצף מינים ספציפיים במולקולות רבות משטח סלולרי. לפיכך, השימוש במכרסמים ללמודנדידת תאים אנושית היא לא סבירה כדי לשקף אותנטי לאירועים במיטות כלי דם איבר ספציפי לאדם. בנוסף, במודלי vivo אינם מתאימים להקרנת תפוקה גבוהה של מועמדים לסמים. הקונבנציונלי במודלי vivo באמצעות ללמוד תא ביות אינו מבחין בין מדרגות מפל extravasation השונות, ולכן קשה לזהות ולמקד את פרודות ביות רומן. גישת מיקרוסקופיה intravital פותחה כדי לתת מענה לצורך זה וכבר הסביר, עם זאת, טכניקה זו היא בזמן ומאוד עתיר עבודת 7,8. מבחני גלגול סטטי: Transwell או הגירת וידן קאמרית מבחני מדד תא על פני קרום ונקבובי נמצאים בשימוש נרחב בלימודי הגירה. יש assay יתרון שניתן להשתמש בו כדי ללמוד לא רק תנועתיות תא ותא במטריצה ​​תאית (ECM) אינטראקציות, אלא גם הגירת chemokine בתיווך של תאיםפני monolayer EC גדלה על הקרומים נקבוביים. למרבה הצער, את הפנוטיפ והתפקוד של EC בתנאים סטטיים שונים באופן משמעותי מאלה שתחת זרימה פיזיולוגית 9,10. לפיכך, באירועים המתרחשים בchemotactic מבחני Transwell לא נאמנה לחקות את יחסי הגומלין בין תאים וEC נודדים תחת מאמץ גזירה. בנוסף, הצעד &quot;מתגלגל&quot; של מפל הביות, מה שמוסיף ממד נוסף של הסלקטיביות לתהליך הכולל, אינו מתרחש במבחני Transwell סטטיים. וכך, בעוד טכנולוגיה זו אינה מאפשרת הערכה כמותית של chemokine נדידת תאים בתיווך מול monolayer EC, הוא מוגבל על ידי חוסר היכולת שלו לספק את מאמץ הגזירה המחקה את זרימת דם בגוף חי. מבחני תחת לחץ גזירה: לחץ גזירת ול ידוע לשחק תפקיד חשוב בויסות תפקוד EC 9,10. כוחות גזירה לגרום להפעלה מהירה של מפלי איתות, transcגורמי ription, ועל ביטוי גנים בהפרש EC 11,12. מידע זה הוביל לפיתוח של הדור הבא של מבחני הדבקה - תאי זרימה למינרית מקבילים ונימים - ללמוד מתגלגל והדבקה של תאים לEC בתנאים של מאמץ גזירת 7,13. הגורם המגביל עבור מבחני אלה הוא שהם יכולים למדוד רק מתגלגלים והידבקות, אך אינו מבחין בין תא חסיד שילכו על מנת מתגלגל ותא חסיד כי הוא &quot;נעצר&quot; על monolayer EC ולא מתגלגל. יתר על כן, מבחני הללו אינם יכולים למדוד את ההגירה של תאים כלפי שיפוע chemokine. מספר דיווחים תארו את יכולתם של תאים חסיד לזחול מתחת monolayer EC גדל על שקופיות זכוכית בתנאים של זרימה 14. המגבלות לטכניקת זחילה זו כוללות: הוא מנתח רק מספר מוגבל של תאים, הוא שאינן כמותי, הוא מנתח את התא זוחל על המטריצה ​​וcelמשטח L אבל לא הגירה לכיוון שיפוע chemotactic, והיא אינו מאפשר לתאי transmigrated להיות מבודדים. וכך, למרות שassay זה יש את היתרון של יישום מאמץ גזירה לmonolayer EC, זה לא יכול לכמת הגירה של תאים כלפי שיפוע chemokine. טכנולוגיית 3D הרומן המתוארת כאן מתגברת על רבים מהחסרונות הללו על ידי שילוב של כוח גזירה (תא העליון) עם שיפוע chemokine סטטי (בתא תחתון) ומאפשרת הערכה כמותית של כל שלב ושלב של מפל extravasation (איור 1). יכול לשמש גם מכשיר לחקור כיצד crosstalk בין EC וmicroenvironment משפיע על יכולתו של האיחוד האירופי לתמוך extravasation של תאים במחזור. הפרוטוקול הבא מתאר את המתודולוגיה צעד האחרת צעד לשימוש במכשיר תא זרימת 3D.

<table><tbody><tr><td colspan="4" ><חזק>מגיב / חומר< / חזק></td></tr><tr><td>צינורות PVC (קדח 1.42, קיר 0.8)</td> <td>Watson-Marlow Limitid</td><td>981.0142.000</td><td></td></tr><tr><td>תא תלת מימד</td><td>C.B.S.Scientific</td><td>FC-1000</td><td></td></tr><tr><td>יחידת חילופי גז</td><td>C.B.S.Scientific</td><td>FCR-1000</td> מוסיף C.B.S.Scientific FCI-1005U <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>קולגן בקר, סוג I</td><td>BD Biosciences</td><td>354231</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית 0.1M</td><td>VWR</td><td>BDH3200-1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Lonza</td><td>CC- 2517</td><td></td></tr><tr><td>EGM ערכת כדורים (סמ"ק - 3121 & סמ"ק - 4133)</td> <td>Lonza</td><td>CC - 3124</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת נטרול טריפסין</td><td>Lonza</td><td>CC-5002</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Lonza</td><td>CC-5024</td><td></td></tr><tr><td>SDF-1</td><td>R7D System</td><td>460-SD</td><td></td></tr><tr><td>Extracel Trial 2.5 Kit</td><td>Glycosam Byosystems</td><td>GS211</td><td></td></tr><tr><td>פיברונקטין, אנושי , טבע</td><td>BD Biosciences</td><td>356008</td><td></td></tr><tr><td>פולי-D-ליזין</td><td>Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח האנושי</td><td>ScienCell</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td>Endotelial Cell Medium (ECM) לתאי מוח</td><td>ScienCell</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>StemCells Tecnologies</td><td>7050</td><td></td></tr><tr><td>TNF-alfa, 10 &mu; g</td><td>Invitrogen</td><td>PHC3015</td><td></td></tr><tr><td>VCAM-1, עכבר אנטי אנושי, CD106-FITC</td><td>Southern Bioteck</td><td>9519-02</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide Staining Solutuion</td><td>BD Pharmingen</td> <td># 556463</td><td></td></tr><tr><td>תאי דם טבורי קפוא CD34+ תאי</td><td>גזע</td><td>CB007F</td><td></td></tr><tr><td>תאי דם טבורי אנושי קפוא CD34+ תאי</td><td>Zenbio</td><td>SER - CD34-F</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434</td><td>StemCells Tecnologies</td><td>GFM3434</td><td></td></tr><tr><td>עכבר מתיל צלולוז מדיה מלאה</td><td>מו"פ & D</td><td>HSC007</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד פון ויליברנד פקטור</td><td>abcam</td><td>C# ab11713</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי (35 x 10 מ"מ)</td> <td>VWR</td><td>CA25373-041</td><td></td></tr><tr><td>צינורות 15 מ"ל</td><td>VWR Fisher</td><td>21008 - 918</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות תרבית רקמות 75 ס"מ2</td><td>VWR</td><td>BD353136</td><td></td></tr><tr><td>קריסטל סגול</td><td>סיגמא</td><td>C-3886-25G</td><td></td></tr><tr><td>ניתוח מלקחיים, VWR מעוקל</td><td></td><td>82027-384</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &mu; l טיפים לפיפטה</td><td>VWR</td><td>83007-380</td><td></td></tr><tr><td>1 - 200 &mu; l קצות פיפטה</td><td>VWR</td><td>37001-530</td><td></td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>ציוד</חזק></td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית</td><td>ווטסון-מרלו Limitid</td><td>403U/VM3</td><td></td></tr></tbody></table>

התקן תזרים הלשכה תלת ממדי רומן ללמוד chemokine ביים-extravasation של תאים במחזור בתנאי זרימה פיסיולוגיים

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation של מחזורי תאים מהדם ממלא תפקיד מרכזי בתהליכים פיסיולוגיים וpathophysiological רבים, לרבות גרורות ביות וגידול בתאי גזע. מכשיר תא הזרימה תלת ממדים (להלן מכשיר 3D) הוא רומן בטכנולוגית מבחנה המשחזר מאמץ גזירה פיסיולוגי ומאפשר לכל צעד של מפל extravasation התא לכימות. מכשיר 3D מורכב מתא עליון שבו התאים של עניין לזרום תחת מאמץ גזירה, ותא תחתון של בארות סטטי המכילות את chemoattractants של עניין. שני התאים מופרדים באמצעות מוסיף נקבובי מצופים monolayer של תאי האנדותל (EC). ניתן להציב הוספה שנייה אופציונלית עם תאי microenvironmental עניין מייד מתחת לשכבת EC. יחידה מאפשרת חילוף גזי המתח האופטימלי CO 2 להישמר ומספקת נקודת גישה להוסיף או למשוך תאים או תרכובות במהלךניסוי. תאי הבדיקה לזרום בתא עליון בלחץ הגזירה הרצויה (קצב זרימה) הנשלט על ידי משאבת peristaltic. בסופו של הניסוי, התאים במחזור והגרו נאספים לניתוח נוסף. ניתן להשתמש במכשיר 3D לבחון תא ומתגלגל על ​​הידבקות לEC תחת לחץ גזירה, גלגול בתגובה לchemokine הדרגתיים, התנגדות ללחץ גזירה, היווצרות אשכול והישרדות תא. בנוסף, הוספה השנייה אופציונלית מאפשרת את ההשפעות של crosstalk בין האיחוד האירופי ובתאי microenvironmental כדי להיבחן. יישומי translational של מכשיר 3D כוללים בדיקה של תרופות מועמדות שנדידת תאי היעד וחיזוי בהתנהגות vivo של תאים לאחר הזרקה תוך ורידית. לכן, מכשיר 3D הרומן הוא כלי תכליתי וזול כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המתווכים extravasation הסלולרי.

עצם Murine מח נגזר קו EC STR-12 שגדל במוסיף עם 5 מיקרומטר נקבוביות. קצב צמיחת EC היה פיקוח תחת מיקרוסקופ וכאשר EC היו 100% ומחוברות, מוסיף הועברו לבארות בתא התחתון של מכשיר 3D. מייד לפני הצבת מוסיפה, הבארות של התא התחתון היו מלאות במדיום התרבות לבד (בקרה שלילית) או עם מדיום השלים עם תאים שמקורם גורם-1 סטרומה (SDF-1; 5 ng / ml ו50 ng / ml). לאחר מכן, הורכב מכשיר 3D וחדר היה מלא במדיום כפי שתואר בפרוטוקול. תאי הבדיקה להיות שהופץ בתא העליון של מכשיר שזה עתה נקצרו תאי מח עצם Murine (3.5 x 10 6 תאים לכל תא). לחץ גזירה מוגדרת של 0.8 dyn / 2 ס&quot;מ יושם על ידי קביעת מהירות משאבת peristaltic ב0.2 מ&quot;ל / דקה. המערכת עובד כולה הייתה ממוקמת אז ב5% CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס וcells הורשו להסתובב ולתקשר עם monolayer EC ל4 שעות. בתום הזמן הזה, את התאים במחזור נאספו, האולם היה מפורק, ומוסיפה הוסרו כפי שתואר בפרוטוקול. תאי transmigrated נקצרו מהבארות הנמוכות יותר, שטף, resuspended במדיום טרי, והועברו לתרבויות methylcellulose השלימו עם גורמי גדילת hematopoietic לתא (CFC) assay מושבה יוצרים (איור 3). כצפוי, מצאנו מספר גבוה יותר באופן משמעותי של CFC נדד על פני monolayer EC לבארות המכילות 50 ng / ml SDF-1 מאשר לבארות המכילות 5 ng / ml SDF-1 או בינונית בלבד. כפי שתוארנו קודם לכן, אף אחד מהנוכחי בטכניקות מבחנה זמינות ללמוד נדידת תאים מסוגל בודק את ההשפעה של microenvironment המקומי ביכולת של האיחוד האירופי לתמוך extravasation של תאים נודדים. כדי להמחיש איך זה יכול להיות מושג באמצעות מכשיר 3D, אנובדק extravasation של מחזורי תאי hematopoietic פני שכבה של האיחוד האירופי ובשכבה של תאי סטרומה מח עצם. לשם כך, הוספה (נמוכה יותר) שנייה המכילה שכבה של תאי סטרומה הייתה בצמוד להוספה העליונה המכילה את monolayer EC בצלחת נמוכה יותר (איור 4). הניסוי נערך לאחר מכן בוצע כפי שתואר לעיל ואת תאי transmigrated נקצרו מהבארות והספר. התוצאות הראו כי החדרה של שכבה נוספת של תאי סטרומה מתחת monolayer EC גדלה הגירה של תאי hematopoietic כלפי SDF-1 (איור 4) באופן משמעותי. ממצא זה עולה בקנה אחד עם הרעיון שmicroenvironment המקומי תורם לגיוס של מחזורי תאים לרקמה. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig1.jpg" /> <strong&gt; איור 1. מכשיר תא הזרימה 3D. : מכשיר 3D ההרמטי מורכב משני תאים מופרדים על ידי קרום נקבובי להחלפה (PM). EC גדלים על הקרום, אשר לאחר מכן יוצר מחסום בין התאים העליונים ותחתונים. לחצי גזירה מוגדרים מוחלים תא העליון של מכשיר 3D על ידי תקשורת המרוססת באמצעות משאבת peristaltic עירוי קבועה. תאים במחזור הם גם ללא אינטראקציה (NIC), מתקשרים עם EC transiently (&#39;רול&#39;; RC), או לדבוק בEC (AC). Subpopulation של תאים חסיד transmigrates פני שכבת EC לתא סטטי התחתון של המכשיר (TM) של B:. ציור מבט מלמעלה (פנל העליון) של מכשיר 3D. להציג החתך האופקי (פנל תחתון) מדגים את מיקומו של הקרום העליון (אדום), קרום התחתון (ירוק), ותחתית הבאר (כחול) C:. Isometriג תצוגה ממחישה את החלקים אינטגרליים של המכשיר: ארבעה ברגים, לחסום אקריליק עליון, חותם חדר עליון, עליון וקרומים נמוכים יותר, תחתון O-טבעת, ובלוק תחתון אקריליק 3-D: כן. תצלום של זרימת 3D תא מחובר למשאבת peristaltic ויחידת חילוף גזים. המערכת מורכבת בשכונת סטרילי ולאחר מכן הועברה לתא תרבות חממה. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig2.jpg" /> איור 2. ייצוג סכמטי של מערכת מכשיר 3D. הציור מציג את שלוש תחנות הנדרשות להרכיב את המערכת. מדיום התרבות נמשך מהכניסה על ידי לחץ השלילי שנוצר על ידי משאבת peristaltic. הזרימה של מדיום היא כבה בעצירת # 1 כדי לאפשר את מוסיף להיות מושם לתוך המכשיר. לאחר התא סגור, המשאבה היא switCHED שוב וחדר מתמלא באופן מיידי עם מדיום כדי למנוע התייבשות של התאים הגדלים במוסיף. תפסיקו # 2 מאפשר מדיום כדי להיות ממוקם ביחידת חילוף הגזים. תפסיק # 3 מאפשר הזרימה שעצרה לחיבור של הכניסה והיציאה. הזרימה יכולה להיות מופנה בכיוון השעון או נגד כיוון השעון כדי להסיר בועות אוויר באמצעות יחידת חילוף הגזים באמצעות מתג על המשאבה. <img alt="איור 3" fo:content-width="5.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig3.jpg" /> איור 3. המכשיר תומך 3D גלגול SDF-1 בתיווך של אבות היווצרות דם בתנאים של לחץ גזירה פיסיולוגי. : שלושה מכשירים (המכילות כל 3 בארות בתא התחתון) נאספו ולרוץ במקביל. בינוני לבד או בינונית המכיל SDF-1 בשעה 5 או 50 ng / ml נוסף לבארות התא התחתונות. Murine בותאי מח ne הורשו להסתובב בהתקנים עבור 4 שעות. לאחר מכן, היה מפורק כל מכשיר ואת התאים שtransmigrated כלפי SDF-1 (צהוב) נאספו מהבארות הנמוכות יותר, נספרו, ותרבית methylcellulose השלים עם גורמי גדילת hematopoietic (GF). ארבע עשרה ימים מאוחר יותר, במושבות היו קלע מתחת למיקרוסקופ B:. מספר אבות (תאי מושבה יוצרי, CFC) התאושש מהתאים התחתונים מוצגת כממוצע ± SD של שלוש בארות במצב. * P &lt;0.05. <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig4.jpg" /> איור 4. ההשפעה של microenvironment על ​​יחסי גומלין בין תאי hematopoietic ותאי האנדותל. : האיור מציג את עמדתו של קרום נקבובי שני עם ST תרבותיfibroblasts רומאל (SF) מתחת הקרום העליון עם הנציבות האירופית. קיצורים אחרים כפי שתוארו עבור איור 1 א &#39;ב&#39;:.. קרום הנוסף (הוספה נמוכה יותר) במדע הבדיוני בתרבית הוכנס מתחת הקרום העליון C: שלושה מכשירים (המכילות כל אחד מהם 3 בארות) היו לרוץ במקביל. בינוני לבד או בינונית המכיל SDF-1 ב 50 ng / ml SDF-1 נוספה לבארות התא התחתונות. תאי הבקרה השליליים הושמטו SC, SDF-1, או שניהם. תאי מח עצם הורשו להסתובב במשך 4 שעות ב 37 ° C. לאחר מכן, היה מפורק כל מכשיר ואת תאי transmigrated נאספו מהבארות התא התחתונות ונספרו. מספר תאי transmigrated התאוששו מוצג כממוצע ± סטיית התקן של שלוש בארות במצב. * P &lt;0.05.

מכשיר תא הזרימה תלת ממדים הוא רומן<em&gt; במבחנה</em&gt; טכנולוגיה להערכה כמותית וצעד חכם של מפל extravasation של תאים במחזור בתנאים של לחץ גזירה פיסיולוגי. המכשיר לכן ממלא את צורך קריטי במחקרים בסיסיים, פרה, וקליניים של נדידת תאים.

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא למדוד באופן כמותי את נדירתן של תאים במחזור הדם לעבר מדרג של כימואטראקטנטים. בתנאים של מאמץ גזירה פיזיולוגי, הדבר מושג תחילה על ידי גידול של שכבה אחת של תאי אנדותל על גבי רכיבים רב-נקביים (microporous inserts) מצופים בקולגן, ולאחר מכן הרכבתם בתוך תא זרימה שבו הם מכסים מדור סטטי נפרד המכיל כימואטראקטנטים. לאחר מכן, מאמץ גזירה מופעל על התאים כדי לדמות את התנאים הפיזיולוגיים בכלי הדם.כשלב שני, תאי בדיקה רלוונטיים, כגון תאי גזע לוקוציטים או תאי גידול, מופנים להזרמה במערכת התלת-ממדית במהלך הסירקולציה. התכנים במדור הסטטי משפיעים על יעילות האינטראקציות בין התאים המסתובבים לתאי האנדותל, ובעקבות זאת על קצב התמעבר (transmigration) של תאי הבדיקה דרך שכבת האנדותל. לאחר מכן, המערכת התלת-ממדית מפורקת ותאי הבדיקה שהעברו תמעבר נאספים מהמדור הסטטי התחתון כדי למדוד כמותית את התהליך באמצעות שיטות מתקדמות שונות. התוצאות המתקבלות מראות את יכולתם של תאי הבדיקה במחזור הדם לקיים אינטראקציה עם תאי אנדותל בתנאי זרימה פיזיולוגית ולצאת מהסירקולציה בהתבסס על ריכוז הכימוקינים במדור הסטטי.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שימוש בתאי זרימה למינרית מקבילית ומבדקי העברה סטטיים, הוא שהיא משלבת הן מאמץ גזירה במדור העליון והן כימואטרקציה במדור הסטטי התחתון. דבר זה מאפשר לחוקרים למדוד באופן כמותי את היציאה החוצה (externalization) של תאים במחזור הדם לעבר מדרג הכימואטרקציה ובתנאים של זרימה פיזיולוגית. ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לחקור את השפעת התקשורת (crosstalk) בין תאי המיקרו-סביבה המקומית לתאי אנדותל על נשירה (extravasation) של תאים מהמחזור הדם.על ידי סיוע בשכבה נוספת של תאים במאט (insert) נפרד מתחת לתאי האנדותל, התהליך יודגם על ידי ולנטינה אגנסט רובה, טכנאית מהמעבדה שלי. לתחילת הדברים, חשבו את מספר המאטים הדרושים לניסוי והניחו כל מאט בצלחת פטרי סטרילית נפרדת. סטריליזציה תבוצע באמצעות הקרנת גמא עד שהמינון הכולל יגיע ל-11 gray, בהתאם להגדרות האישיות.לאחר מכן, דללו את תמיסת המאגר של קולגן מסוג 1 (collagen type one) לריכוז של 50 µg/mL באמצעות חומצה כלורית (hydrochloric acid) בריכוז 0.01 M המאוחסנת בטמפרטורה של 4 °C, והכינו אליקוויטות של 154 µL מהתמיסה הסופית עבור כל אינסרט (insert). לאחר מכן, טפטפו מספר טיפות מהתמיסה על פני השטח של האינסרט בתבנית מעגלית.לאחר מכן, הוסיפו את שאר המנה כדי ליצור טיפה אחת גדולה על פני השטח של המבנה (insert). ודאו שקצה הפ pipette אינו נוגע במבנה בשום שלב ושהקולגן מכסה את כל פני השטח של המבנה, אך אינו נשפך החוצה. ברגע שהמבנה מכוסה, הניחו את המכסה על פטרי dish והניחו אותה בזהירות על משטח שטוח.דגרו את ההכנסות למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר; לאחר הדגירה, שאבו את תמיסת הקולגן ושטפו את הממברנה עם 160 microliters של PBS. לאחר מכן, שאבו את ה-PBS. החזירו את המכסה ועטפו את הצלחת ב-paraform.אם התבניות ישמשו באותו היום, יש להניח את פטריאת הפטרי במיקום יבש בטמפרטורת החדר. אחרת, יש להניח את הפטריאה בטמפרטורה של 4 °C ולהשתמש בתבנית בתוך שבעה ימים. יש לקצור תאי אנדותל של וריד טבילית אנושי (human umbilical vein endothelial cells) ממש לפני השימוש ולהשעות אותם מחדש במצע התרבית הרצוי בריכוז של 2.5 מיליון תאים למילליליטר.בעת ספירת התאים, ודאו כי חיוניות התאים גבוהה מ-98% באמצעות תזריק trypan blue, ולאחר מכן הוסיפו 160 µL מתליםיית התאים לכל אינסרט. יש להניח תחילה מספר טיפות קטנות במעגל על פני השטח של האינסרט המצופה בקולגן, ולאחר מכן להוסיף בזהירות את שאר תליסיית התאים ליצירת טיפה אחת גדולה. בסיום, החזירו את המכסים והניחו בזהירות את הצלחות בתוך אינקובטור עם 5% carbon dioxide בטמפרטורה של 37 °C, והדגרימו למשך 30 דקות כדי לאפשר לתאים להיצמד לממברנה.לאחר 30 דקות, הוציאו את הפלטות מהאינקובטור והוסיפו בעדינות חמישה מיליליטרים של מצע תרבית שחומם מראש מעל כל תבנית (insert). יש להקפיד שהתבנית תישאר בתחתית הצלחת ותהיה מכוסה לחלוטין במצע. לאחר מכן, החזירו את המכסים והחזירו בזהירות את הצלחות לאינקובטור התרבית.הדגרירו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה. להרכבת תא הזרימה, הבריגו תחילה את הפלטות העליונה והתחתונה זו לזו. לאחר מכן, חברו את הפלטות ליחידת חילוף הגזים באמצעות צינור PVC בעל קוטר פנימי של 1.42 mm ועובי דופן של 0.8 mm.בשלב הבא, הניחו את המכשיר המורכב בתוך שקית פלסטיק נקייה ועקרו אותו באמצעות הקרנת גמא עד שהמינון הכולל יגיע ל-11 gray. השלב הבא הוא להוציא מגש מדגרה, להניחו בתוך מנדף סטרילי לתרביות רקמה ולעקרו באמצעות 70% ethanol. לאחר מכן, כסו את המגש במפית סטרילית גדולה.בשלב הבא, הוצאו את המכשיר מהשקית מפלסטיק והניחו אותו על מגש אינקובטור סטרילי. לאחר מכן, חברו את המכשיר למשאבה הפריסטלטית ותכנתו את המשאבה לפעול במהירות של 0.2 milliliters per minute. העבירו באמצעות פיפטה חמישה עד שבעה milliliters של מצע הגידול הרצוי לתוך מבחנה סטרילית של 15 milliliter שתשמש כפתח הכניסה.לאחר מכן, נתק את צינור הכניסה מהיציאה על ידי משיכת המחט המתכתית מתוך הצינור באמצעות מפיות סטריליות קטנות כדי לשמור על סטריליות הצינור; הכנס את מחט הכניסה המתכתית לתוך מבחנה של 15 מיליליטר המכילה את המצע, והכנס את צינור היציאה לתוך מבחנה ריקה של 15 מיליליטר. לאחר מכן, הפעל את המשאבה כך שהזרימה תהיה נגדית לשעון. אפשר ללחץ השלילי לשאוב את המצע ממבחנת הכניסה של 15 מיליליטר אל תוך הצינור, ועצור את המשאבה כאשר המצע מגיע לקצה הצינור, רגע לפני כניסתו למכשיר.לאחר מכן פתחו את המכשיר על ידי הברגת פלטות התעלות והסירו בזהירות את הפלטה העליונה. השתמשו בפיפטה כדי להעביר 1,550 µL של מדיום לבארים התחתונות, תוך הבטחה כי הבארים מכילות מספיק מדיום כדי ליצור חצי כדור המגיע לגובה של one to two mm מעל הפלטה התחתונה. לאחר מכן, העבירו את התוואים (inserts) שהוכנו מהצלחות הפטרי לבארים של הפלטה התחתונה. בעזרת פינצטה סטרילית, ודאו שאין בועות כלואות מתחת לתוואים ושאבו כל מדיום המופיע על פני השטח של הפלטה התחתונה.לאחר מכן, החזירו את הפלטה העליונה על הפלטה התחתונה וחברו אותן מחדש. בעזרת הברגים, הפעילו מיד את משאבת הפריסטלטיקה ואפשרו למדיום לזרום דרך המכשיר התלת-ממדי. הגביהו את קצה היציאה של המכשיר ושמרו על התא במצב זה כדי למנוע היווצרות בועות ברווח שבין הפלטות.המשיכו למלא במדיום את הפיתול המחבר בין התא ליחידת חילוף הגזים, עד שהמדיום יגיע ליחידת חילוף הגזים. לאחר מכן, העבירו שלושה מיליליטרים של מדיום אל יחידת חילוף הגזים. הפעילו את המשאבה ואפשרו לבועות האוויר לצאת דרכה.הגביהו את היחידה כדי לאפשר למצע למלא את הפיתול שיוצא ממנה, ועצרו את המשאבה כאשר המצע נמצא במרחק של שני עד שלושה סנטימטרים מהסוף. לאחר השלמת ההכנה (priming), חברו את מחט הכניסה לפיתול היציאה באמצעות מגבונים סטריליים קטנים. לאחר מכן, הפכו את כיוון פעולת המשאבה כך שהמצע יזרום עם כיוון השעון לעבר יחידת חילוף הגזים, וודאו שכל בועות האוויר שנותרו הוסרו.כאשר המשאבה שוב זורמת נגד כיוון השעון, הוסיפו 100 µL של תרחיף תאי הבדיקה ליחידת חילופי הגזים. לאחר מכן, סגרו את מכסה הרספיטור.החזירו את המגש לאינקובטור ואפשרו לתאי הבדיקה להזרים בתוך המכשיר בטמפרטורה של 37 °C. לאחר שהזמן הרצוי חלף, הוציאו את המגש עם המערכת הפעילה מהאינקובטור והניחו אותו במנדף. עצרו את המשאבה, נתקו את פתחי הכניסה והיציאה והניחו את הקצוות לתוך מבחנות סטריליות ריקות של 15 mL.לאחר מכן הפעילו את המשאבה ואספו את תרחיף התאים מהמערכת. הניחו את תרחיף התאים על קרח עד לשימוש. לאחר מכן, פרקו את התא על ידי הסרת הברגים והנפת הפלטה העליונה.הוציאו את המבני המוספים (inserts) מהפלטה התחתונה והעבירו אותם לצלוחיות פטרי לצורך צביעה או איסוף תאים. לבסוף, הוציאו את תרחיף התאים מהבארים התחתונות והעבירו אותו למבחנות של 15 milliliter. שטפו כל באר פעמיים עם 1.5 milliliters של מצע והוסיפו אותו למבחנה המתאימה.לאחר מכן, סבבו את המבחנות בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-200 Gs ועבדו את התאים בהתאם למטרות ניסיוניות ספציפיות, כגון אלה המפורטות בפרוטוקול הטקסט המצורף. להלן דוגמה לאחד הבדיקות הרבות שניתן לבצע באמצעות מערכת זו. ההגדרה כוללת תאי אנדותליות ממקור של מחוליל גרם המגודלים על גבי רכיבי הכנסה (inserts) בעלי נקבים בגודל חמישה מיקרון; מתחת לרכיבי ההכנסה הוסף stromal cell derived factor one או SDF-1 בריכוזים של 0, 5 או 50 ng/mL.תאי מחית עצם הושארו להזרים במערכת התלת-ממדית. תאים שנדדו דרך הרכיב המוחדר (insert) נאספו ולאחר מכן תורגלו על פלטות עם מצע Methylcellulose. בנוכחות גורמי גדילה המטופויטיים הגורמים לתאי פרוגניטור להקים מושבות, נספר מספר המושבות לאחר 14 ימים כדי לקבוע את מספר תאי הפרוגניטור בכל באר ולה aו להדגים את יכולתם לנדוד לעבר sdf.אחד תחת תנאים של זרימה פיזיולוגית. עם הוספת פיברובלסטים סטרומליים שגדלו על המאסף התחתון בתא הסטטי, תאי המטופואזה רבים יותר נדדו מהמחזור אל התא עם הוספת sdf, אחד ב-50 nanograms per milliliter, מאשר עם SDF אחד בלבד לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחומים שונים של מדעי הרפואה והביולוגיה למדל מיטות כלי דם ספציפיות לרקמה in vitro ולחקור מנגנונים תאיים ומולקולריים המתווכים נדידה של תאים מהמחזור לעבר רקמות תקינות לעומת חולות.

a-novel-three-dimensional-flow-chamber-device-to-study-chemokine

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנחנו המתאר שיטה תאים חסיד נתונים ללחץ הזרימה למינרית גזירה במעגל תזרים סטרילי מתמשך. הדבקה של התאים, מורפולוגיה ניתן ללמוד דרך תא שקוף, דגימות שהתקבלו במעגל לניתוח המטבוליט ותאי שנקטפו לאחר חשיפה גזירה לניסויים עתידיים או תרבות.

במקביל, צלחת תזרים לשכת ואת מעגל זרימה רציפה להערכת ובתאים אנדותל תחת מתח זרימה למינרית שאר

זרימת הנוזל ביניים הוא גבוה בגידולים מוצקים והוא יכול לווסת את הפלישה תאים סרטניים. כאן נתאר את הטכניקה ליישם זרימת הנוזל ביניים לתאים משוקע בתוך ולאחר מכן למדוד את השפעותיו על הפלישה התא. טכניקה זו ניתן להתאים בקלות ללמוד מערכות אחרות.

תלת מימדי תרבית תאים מודל למדידת השפעת זרימת הנוזל ביניים על הפלישה תאים סרטניים

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

הסרטון מדגים שיטה לחקר ההשפעה של תאי סטרומה על גיוס לויקוציטים. במודל מקביל של תא זרימת לוחות, ציטוקינים מעודדי דלקת גורמים לביטוי קולטני הידבקות על ידי תאי אנדותל, מה שמקל על גיוס נויטרופילים ונדידה. ההצלבה בין תאי סטרומה לתאי אנדותל מפחיתה את גיוס הנויטרופילים לתאי האנדותל.

מחקר זרימה חוץ גופית של השפעת תאי סטרומה על גיוס לויקוציטים

פרוטוקול זה מפרט assay נועד למדוד chemotaxis נויטרופילים אדם מטיפה אחת של דם מלא עם שחזור חזק. גישה זו עוקפת את הצורך בהפרדת נויטרופילים ודורשת זמן הכנת assay רק כמה דקות. שבב microfluidic מאפשר למדוד החוזרים ונשנים של chemotaxis נויטרופילים לאורך זמן בתינוקות או יונקים קטנים, שבו נפח דגימה מוגבל.

פלטפורמת microfluidic למדידת נויטרופילים Chemotaxis מדם מלא לא מעובד

כדוריות דם לבנות לחצות את monolayer אנדותל באמצעות paracellular או מסלול transcellular. פיתחנו assay פשוט כדי לעקוב אחר חלוקת junctional אנדוגני VE-cadherin וPECAM-1 במהלך נדידת transendothelial יקוציט תחת זרימה פיזיולוגית להפלות בין שני מסלולי הגלגול.

הדמיה בזמן אמת של תאי תאי צומת האנדותל במהלך נויטרופילים גלגול תחת פיזיולוגית זרימה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר לחוקר להעריך דינמיקת גיוס לויקוציטים לשעבר vivo על ידי חיבור קאמרי מצופים במולקולות דבקות-נגזר האנדותל למערכת הדם של עכבר. שיטה זו מציעה יתרונות משמעותיים שכן הוא מאפשר להערכה לויקוציטים בתנאים ביולוגיים יחסי.

הערכת אינטראקציות יקוציט-האנדותל תחת תנאי זרימה ב Ex Vivo Assay Autoperfused Microflow הקאמרי

נדידת תאים היא חלק חשוב בהתפתחות ובחיים האנושיים. על מנת להבין את המנגנונים שיכולים לשנות את נדידת התאים, אנו מציגים מערכת דיפוזיה של שיפוע מישורי כדי לחקור כימוטקסיס במטריצת קולגן תלת מימדית, המאפשרת להתגבר על מגבלות תא הדיפוזיה המודרניות של מבחנים קיימים.

מישורי צבע מערכת דיפוזיה לחקירת Chemotaxis בקולגן מטריקס 3D

פרוטוקול זה מפרט שיטה להתאמה אישית למדוד נדידת תאים בתגובת chemoattractants שעשוי לשמש גם כדי לקבוע את קצב הדיפוזיה של תרופה מתוך פולימר מטריקס.

תא להתאמה אישי עבור נדידת תאים מדידות

לויקוציטים בלהיטות אינטראקציה עם טסיות הדם והתאים כלי הדם לאחר פציעה קיר הספינה או בעת דלקת. כאן, אנו מתארים assay מבוסס זרימה שכבתית פשוטה כדי לאפיין את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס האינטראקציות בין לויקוציטים ושותפים הסלולר שלהם.

מבחני מבוסס זרימה שכבתית לחקור ליקוציט גיוס על תאים בתרבית וסקולרית, טסיות חסיד

בפרוטוקול זה, בדיקת מיקרופלואידים ביומימטיים, שיכולה לשכפל סביבה מיקרו-וסקולרית רלוונטית מבחינה פיזיולוגית ולשכפל את כל מפל ההידבקות/הגירה של לויקוציטים, מועסקת כדי לחקור אינטראקציות של תאי לויקוציטים-אנדותל במחלות דלקתיות.

מערכת מיקרופיזיולוגית לחקר אינטראקציה תאי לויקוציטים-אנדותל במהלך דלקת

למדו להשתמש במכשיר תזרים תלת-ממדי לחקר נדידת תאים ויציאתם מהכלי הדם תחת מתח גזירה פיזיולוגי. שיטה זו מאפשרת מדידה כמותית של אינטראקציות בין תאי אנדותל לתאים מחוללים במחקרי סרטן וחסון.

התקן תזרים הלשכה תלת ממדי רומן ללמוד chemokine ביים-extravasation של תאים במחזור בתנאי זרימה פיסיולוגיים

גלה סרטונים נוספים