מודלים לאינטראקציה בין סביבת גנים כדי לחשוף מנגנוני רגישות במחלת פרקינסון
7 בינואר 2014
ליפוקסיג'נאז (LOX) isozymes יכול לייצר מוצרים שעשויים להגדיל או להקטין נוירואינפלמציה ו ניוון עצבי. מחקר אינטראקציה גנטית-סביבה יכול לזהות LOX השפעות ספציפיות isozyme. באמצעות 1-מתיל-4-פניל-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) מודל של נזק nigrostriatal בשני קווים מהונדסים LOX isozyme לקוי מאפשר להשוות את התרומה של איזוזימים LOX על שלמות דופאמין ודלקת.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להבין את תפקידם של אנזימי ה-ISO של ליפוקסיגנאז (lipoxygenase) בניוון ניגרוסטריאטלי הקשור למחלת פרקינסון. כדי להשיג זאת, מוכן בקפידה נוירוטוקסין הגורם לנגע ב-Nigro SAL. לאחר מכן, עכברים חסרי NOx מוזרקים בתמיסת MPTP מדי יום במשך ארבעה ימים רצופים, ושבעה ימים לאחר ההזרקה האחרונה.
דגימות נאספות ומשמשות לניתוח ביוכימי או אימונוהיסטולוגי. התוצאות מראות כי 1215 locks אינו משפיע על רעילות MPTP NIGROSTRIATAL. עם זאת, five locks תורם לנזק בתנאי רעילות.
שיטת TS יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום של מחלת הפרקינסון. היא מאפשרת להציע מהי ההשפעה של אינטראקציות בין גנים לסביבה על הפגיעות של nistri. באמצעות מודלים של גנים וסביבה, הצלחנו להבחין בתפקודים סלקטיביים של ISO ולקבל תובנות לגבי הדואליות של חמישה lipes.
צוות שהוכשר כראוי חייב להשתמש בציוד מגן אישי מתאים לאורך הפרוצדורה הבאה. התחילו בביצוע כל החישובים הדרושים להכנת תמיסת הנוירוטוקסין. לאחר מכן, ארגנו את כל הציוד, האספקה והריאגנטים הדרושים.
בנוסף, הכינו חומרים לטיפול בכל שפיכה פוטנציאלית. כסו את האזור שסביב המשקל בפדים או בנייר סופג. כצעד למניעת סיכונים משפיכות של אבקה, השאירו בקרבת מקום טישיו ותמיסת bleach 10% לחה.
כאשר הדבר מוכן, הוצא את מבחנת המקור ממקום האחסון המתאים לה. סמן את מבחנת הזכוכית של ה-MPTP עם הריכוז והתאריך. באמצעות מאזניים אנליטיים הממוקמים במנדף, שקול 50 milligrams של MPTP לתוך מבחנת זכוכית עם הכלה משנית המכילה טישיה ספוגה ב-10%bleach.
לאחר מכן, סגרו את מבחנת המקור ונגבו את החלק החיצוני באיטיות עם 10%bleach. הוסיפו למבחנה 13.763 milliliters של סליין סטרילי וסגרו אותה לפני ערבוב מלא בתוך המנדף. סננו ועקרו בזהירות את תמיסת ה-MPTP לתוך מבחנת הזרקה מסומנת בתוך מיכל משני עם טישו ספוג ב-10%bleach.
כדי להפחית את הלחץ, שחררו מעט את הפקק של הנבקת המכילה את תמיסת ה-MPTP המסוננת. נקו שפיכות באמצעות טישיה ספוגה בתמיסת הלבנה, והשליכו חומרים משומשים לתוך מכל פסולת ביולוגית מסומן כראוי. שמרו את נבקת תמיסת ה-MPTP בתוך מכל משני עם טישיה ספוגה בתמיסת הלבנה לצורך ההעברה לחדר הפרוצדורות בבעלי החיים.
הניחו את בקבוקון המקור של ה-MPTP בתוך המיכל המשני שלו והחזירו אותו למיקום האחסון המתאים. לבסוף, דה-קונטמינציה (חיטוי) של השפכית, מאזני הדיוק ומשטח המנדף למשך 10 דקות, באמצעות תמיסת הלבנה בריכוז 10%.
לפני הזרקה לבעלי החיים, הכינו כלובים חד-פעמיים עם מכסים מחוררים ומסוננים. סמנו אותם כ-MPTP. הכניסו למגירה רפודים חד-פעמיים, כדורי מזון שהורטבו מראש והידרוג'ל כמקור למים.
בשלב הבא, שקלו את כל בעלי החיים ורשמו את נפח תמיסת ה-MPTP הנדרש להזרקה של 15 milligram per kilogram. כאשר תהיו מוכנים, הפגינו זהירות רבה בעת החזקת העכבר מעל פד ספיגה חד-פעמי והזרקת תמיסת ה-MPTP. חזרו על הליך זה מדי יום במשך ארבעה ימים; ללא סגירת המחט במכסה, הניחו אותה בתוך מכל ייעודי ומסומן עבור פסולת חדה ביו-סיכונה של MPTP.
השאירו תמיסת אקונומיקה בריכוז 10% ונייר סופג בקרבת מקום. כדי לנקות טפטופים מקריים, העבירו את בעלי החיים שהוזרק להם MPTP לכלובי הפסולת שהוכנו מראש, ושכנו אותם במדפים פתוחים. בשלב הבא, לאחר הזרקת MPTP.
השתמשו בשלטים על המתקן ועל דלת חדר הגידול עד 72 שעות לאחר ההזרקה האחרונה. חטאו את משטח העבודה באמצעות אקונומיקה. לאחר כל פעולה, השלימו את סילוק תמיסת ה-MPTP שנותרה על ידי הוספה של נפח שווה של 10% אקונומיקה.
כדי להשליך זאת כפסולת נוזלית ביו-סיכונית, השליכו את כל ה-PPE המשומש לפחים ייעודיים לפסולת, תוך ריסוס ב-10% bleach לפני ההשלכה במידת הצורך. במהלך הליך זה, חשוב לבדוק את בעלי החיים באופן קבוע ולהשלים את המזון והמים שלהם מדי יום. שלושה ימים לאחר ההזרקה האחרונה, השליכו את כל החומרים והחזירו את בעלי החיים לדיור הרגיל.
בנקודות זמן ניסיוניות שנקבעו מראש, הוצאו בעלי החיים לצורך קציר ועיבוד רקמות. נעשה שימוש ב-Stri AAL homogenous למדידת רמות דופמין בעכברים מסוג wild type ובעכברי knockout של five locks שטופלו במילי (saline) או ב-MPTP. בקבוצות שטופלו במילי, נמצאה השפעה גנוטיפית יעילה על רמות ה-DA, עם רמות DA נמוכות יותר בעכברים הטרנסגניים. עם זאת, בעקבות טיפול ב-MPTP, עכברים חסרי five locks היו מוגנים מפני דלדול SAL DA.
לחמשת העכברים עם נוקאאוט של locks בקבוצת ה-MPTP היו רמות DA דומות לאלו של חמשת העכברים עם נוקאאוט של locks בקבוצת הסלין. בניגוד לכך, בעכברים עם נוקאאוט של 1215 locks, הגנוטיפ לא השפיע על רמות הדופמין ללא קשר לקבוצת הטיפול. צביעה אימונופלואורסצנטית של TH ו-GFAP ב-substantial nigra חשפה פחות גופי תאים חיוביים ל-TH, כפי שמסומן על ידי הכוכבית, ותגובתיות אימונוכימית מוגברת של GFAP בקבוצת ה-MPTP מסוג wild type. צביעת DAB למיקרוגליה חשפה גופי תאים מסועפים ותהליכים ענפיים ארוכים בעכברים שטופלו בסלין, בעוד שמיקרוגליה מופעלת עם גופי תאים מעוגלים ותהליכים קצרים ומעובים נצפו בעכברים שטופלו ב-MPTP. אימונו-בלוטינג של SAL, TH ו-GFAP סיפק ראיות נוספות לנזק ולנוירו-אינפלמציה שנבעו מחשיפה ל-MPTP.
השפעות אלו פחתו בעכברים עם חסר ב-five locks isy. מאחר שעבודה עם MPTP עלולה להיות מסוכנת ביותר, יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות בעת ביצוע פרוצדורה זו, כגון לבישת ציוד מיגון אישי והחזקת 10%bridge זמין למקרה של שפיכה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את תפקידם של איזוזימים של ליפוקסיגנאז (LOX) בניוון ניגרוסטריאטלי הקשור למחלת פרקינסון. באמצעות מודל של רעלן עצבי, מוערכות השפעותיה של חסר ב-LOX על שלמות מערכת הדופמינרגית ועל דלקת.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- נוירו-דלקת
- ניוון עצבי
רקע
- איזוזימים של ליפוקסיגנזה יכולים להשפיע על דלקת נוירונית וניוון עצבי.
- אינטראקציות בין גנים לסביבה עשויות לחשוף השפעות ספציפיות לאיזואנזימים של LOX.
- מודל ה-MPTP משמש לחקר נזק ניגרוסטריאטלי.
- הבנת תפקידו של LOX עשויה לספק תובנות לגבי המנגנונים של מחלת פרקינסון.
מטרת המחקר
- לבחון את תרומתם של איזוזymes של LOX לשמירה על השלמות הדופמינרגית.
- להעריך את ההשפעה של מחסור ב-LOX על נזק המושרה על ידי נוירוטוקסינים.
- לזהות השפעות ספציפיות של איזוזymes של LOX בדלקת נוירוגנית.
שיטות שנמצאו בשימוש
- הכנת נוירוטוקסין להשראת נגעים ניגרוסטריאטליים.
- הזרקת תמיסת MPTP לעכברים חסרי LOX.
- איסוף דגימות לניתוח ביוכימי ואימונוהיסטולוגי.
- השוואת תוצאות בין קווים שונים של עכברים החסרים איזוזימים של LOX.
תוצאות עיקריות
- 1215 LOX אינו משפיע על רעילות MPTP במסלול הניגרוסטריאטלי.
- Five LOX תורם לנזק נוירוטוקסי תחת תנאים ספציפיים.
- הממצאים מרמזים על תפקידים שונים של איזוזימות LOX בניוון עצבי.
- תוצאות אלו עשויות להנחות אסטרטגיות טיפוליות למחלת פרקינסון.
מסקנות
- לאיזוזימים של LOX השפעות שונות על דלקת נוירונית וניוון.
- הבנת תפקידים אלו עשויה להוביל להתערבויות ממוקדות.
- דרוש מחקר נוסף כדי לבחון את המנגנונים של איזוזימי LOX.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודלים של אינטראקציה בין גנים לסביבה מאפשרים הפחתת סיכונים מכניסטית של מטרות טיפוליות במחלות נוירודגנרטיביות, על ידי חשיפת תרומות ספציפיות של איזופורמים לרעילות, אשר מוסתרות במודלים גנטיים בלבד או במודלים של רעלים. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות ובביטחון חיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים, על ידי הבהרת הרלוונטיות של מסלולים הפעולה והפחתת תוצאות חיוביות שגויות בזיהוי מועמדים מובילים. השימוש במודלים מבוססי נוירוטוקסינים מקובלים, כגון MPTP, מספק רצף תרגומי להערכת נוירודגנרציה דופמינרגית ותגובות נוירו-דלקתיות במחקר של מחלת פרקינסון.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזה טיפולית על ידי קביעה האם איזוזים ספציפיים של LOX מווסתים דגנרציה ניגרוסטריאטלית בהקשר של גן-סביבה.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות באמצעות מודלים של נטרון סלקטיבי לאיזופורמים שמוצמדים לנוירוטוקסין רלוונטי.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי זיהוי האיזופורמים של LOX התורמים לנזק דופמינרגית בתנאים של סטרס חמצוני ודלקת.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנה של מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף (עכברים חסרי LOX) עבור סטנדרטיזציה של בדיקות המשך וסריקת תרכובות במסלולי ניוון עצבי.
- ערך תפעולי: מספק קריאות חצי-כמותיות של Western blot ו-HPLC (מטבוליטים של דופמין, TH, GFAP) המאפשרות הערכה כמותית הדירה של חומרת הנגע.
- ערך ניתנות להרחבה: תומך בשימוש חוזר בפלטפורמה על פני מודלים של נוירוטוקסינים ורקעים גנוטיפיים לצורך הערכה עקבית של מעורבות המטרה (target engagement) וסיגנול של מסלולים.
מחקר טרנסלציונלי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על רלוונטיות למחלה באמצעות שימוש ב-MPTP כדי לשחזר את הנזק הניגרוסטריאטלי ואת הנוירו-דלקת הנצפים במחלת פרקינסון.
- ערך תפעולי: מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים על ידי קישור פעילות איזופורמים של LOX לשלמות דופמינרגית ולהפעלה גליאלית בסובסטנטיה ניגרה ובסטריאטום.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין תיקוף מטרות בשלב הגילוי להערכה פרה-קלינית באמצעות מדדים סטנדרטיים של נוירו-דגנרציה ודלקת.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות של מטרות, דרך זיהוי מובילים ועד לתיקוף פרה-קליני, על ידי אספקת תובנות מכניסטיות לגבי אינטראקציות בין גנים לסביבה המשפיעות על הישרדות נוירונים דופמינרגיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי חשיפת התרומות הספציפיות של איזופורמי LOX לרעילות המושרה על ידי MPTP.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות אתגר נוירוטוקסי סטנדרטי ומדדים ביוכימיים כמותיים (HPLC של דופמין, Western blot של TH) המאפשרים הערכה אמינה של תרכובות.
- אנליטיקה: מייצרת פלטים מדידים (רמות דופמין, ביטוי TH, אימונוראקטיביות של GFAP/Iba-1) המאפשרים השוואה של ההשפעה הנוירוטוקסית בין גנוטיפים ותנאי טיפול שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרצף פרה-קליני באמצעות מודל MPTP מבוסס וסממנים ביולוגיים של דלקת נוירונית הרלוונטיים לפתוגנזה של מחלת פרקינסון.
- שימוש חוזר ארגוני: מכוננת יכולת לשימוש חוזר להערכת מודולציית מטרה במסלולי ניוון עצבי על פני מספר איזופורמים של LOX ופראדיגמות של נוירוטוקסינים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת הסיכון הנובע מעמימות מכניסטית לגבי מעורבותן של איזופורמות LOX בניוון עצבי.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות מינון MPTP מוגדר, בקרות גנוטיפ ומדדי קריאה ביוכימיים/היסטולוגיים רב-מודאליים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות go/no-go על ידי זיהוי המטרות (למשל, 5-LOX) המווסתות את הרעילות, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים של תוכניות למחלות ניוון עצבי.
- השפעה על הפורט폴יו: מאפשר תעדוף מותאם-סיכון על ידי הבחנה בין גורמים מניעים (5-LOX) לבין גורמים שאינם תורמים (12/15-LOX) במודלים של נגעים דופמינרגיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בנוירוטוקסינים, בגינוטיפיקציה של עכברים ובניתוח ביוכימי של מסלולים דופמינרגיים.
- תלוי במכשור אנליטי לכימות מטאבוליטים של דופמין באמצעות HPLC ולגילוי של TH, GFAP ו-Iba-1 באמצעות Western blot.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית בין צוותי הפרמקולוגיה in vivo, ההיסטולוגיה והביוכימיה לצורך כימות עקבי של הנגעים.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבה למודלים של נוירוטוקסינים אחרים או פנוטיפים נוירודגנרטיביים מעבר לנזק ניגרוסטריאטלי המושרה על ידי MPTP.
- כולל מגבלות מעשיות כגון הצורך בפרוטוקולי בטיחות מחמירים לעבודה עם נוירוטוקסינים ושונות ברגישות ל-MPTP בין זני עכברים ותנאי דיור שונים.
