תפוקה גבוהה fluorometric מדידה של קרקע פוטנציאלית פעילויות אנזים תאיות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת את שיעורי הפוטנציאל המקסימליים שבהם אנזימים חוץ-תאיים בקרקעות מפרקים את התסריטים (substrates) שלהם. דבר זה מושג תחילה על ידי ערבוב קרקע לחה מהשדה ובופר בבלנדר, ולאחר מכן העברה בפיפטה של הדגימות המעורבבות ללוחית דגימות בעלת בארות עמוקות וללוחית סטנדרטים בעלת בארות עמוקות. לוחות הבארות העמוקות מדגגרים ועוברים סנטריפוגה לפני ש-250 µL מועברים מכל באר של לוחות הבארות העמוקות לבארות התואמות בלוחית שחורה בעלת תחתית שטוחה.

פלטות של 96 בארות. לאחר מכן קוראים את שלוש הפלטות בפלורימטר ומנתחים את הנתונים שהתקבלו. בסופו של דבר, פעילויות פוטנציאליות של אנזימים חוץ-תאיים בקרקע נקבעות לפי הקצב שבו משתחרר צבע פלואורסצנטי מהסובסטרט בתגובה המזורזת על ידי אנזים, כאשר פלואורסצנציה גבוהה יותר מעידה על פירוק רב יותר של הסובסטרט.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא היכולת למדוד פעילויות אנזימטיות במספר רב של דגימות, תוך ניצול פורמט של מיקרופלטה עמוקה בעלת 96 בארות. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר זיהינו את ההזדמנות להגדיל את נפח הדגימה בהשוואה למיקרופלטה סטנדרטית, על ידי התאמת פרוטוקולים אחרים לפורמט של פלטה בעלת בארות עמוקות. ההשלכות של טכניקה זו מאפשרות לנו לקשר בצורה טובה יותר בין פיזיולוגיה מיקרוביאלית לתהליכים בקנה מידה של מערכת אקולוגית.

הדגמה חזותית היא קריטית עבור טכניקה זו, מכיוון שישנם ניואנסים רבים ודרכי טיפול בדגימות שאינם קלים למעקב בתוך פרוצדורה כתובה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי האקולוגיה המיקרוביאלית והביוגאוכימיה של קרקע, כגון כיצד מיקרובים בקרקע מגיבים לשינויים בסביבתם וכיצד תגובותיהם הפיזיולוגיות משפיעות על תהליכי מערכת אקולוגית קריטיים, כגון פירוק ומחזורי חומרים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי פירוק של חומר אורגני בקרקע ומחזורי חומרים במערכות אקולוגיות יבשתיות, ניתן להחיל אותה גם על מערכות ימיות ומערכות של מים מתוקים.

בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים שיטה זו יתקשו במיומנויות הפיפוט ובסוגיות של רגישות לזמנים הקשורות לפרוטוקול זה. יתרה מכך, כמות הנתונים הגדולה הנוצרת בהליך זה עשויה להיות לעיתים מכבידה עבור משתמשים בפעם הראשונה. כדי להתחיל בהכנת הבדיקה, סמנו שלוש פלטות עם בארות עמוקות (deep well plates) כ-sample MUB standard עבור four methyl and beone ו-MUC standard עבור seven amino four methyl coumarin.

מזגו כל תמיסת סטנדרט ותסבס טרט לתוך מיכלים נקיים ומסומנים מראש, המסודרים בשורות. לאחר מכן, העבירו בפיפט את סטנדרט ה-MUB המתאים לבארות התואמות בלוח סטנדרטי ה-MUB, כפי שמופיע בפרוטוקול הכתוב. חזרו על תהליך זה עבור סטנדרטי ה-MUC לבארות התואמות בלוח סטנדרטי ה-MUC כדי להכין את תמיסות הקרקע.

עבור כל דגימת קרקע, שקלו 2.75 גרם של קרקע בלחות שדה לפני ההוספה לבלנדר. הוסיפו 91 מיליליטר של באפר 50 millimolar, וערבלו במהירות גבוהה למשך דקה אחת. שפכו את תוכן הבלנדר לקערת זכוכית נקייה, שרוחבה לפחות כרוחבה של פיפט שמונה-ערוצית, עם מוט ערבול.

ניתן לסנן את תמיסת הקרקע דרך נפה בעלת רשת של כמילימטר אחד לפני המזיגה לקערה. הנח את הקערה על פלטת ערבול וערבב את תמיסת הקרקע. לאחר מכן, העבר בפיפט 800 µL מתמיסת הקרקע לעמודה הראשונה של פלטת הדגימות.

בצעו את אותה הפעולה עבור העמודה הראשונה של לוחות התקן MUB ושל לוחות התקן MUC. שטפו את הבלנדר, את לוח השקילה ואת מוט הבחישה במים דה-יוניים או בתמיסת בופר בין דגימות קרקע. חזרו על תהליך זה עבור כל דגימת קרקע.

עברו לעמודה הבאה עם כל דגימה עוקבת. לאחר מכן, העבירו בפיפט את התסבסב המתאים לבארים המקבילות בלוחית הדגימות. כפי שמפורט בפרוטוקול הכתוב, הכינו לוחית דגימות עבור כל טמפרטורת אינקובציה שתיבדק.

אטמו את פלטות הבארות העמוקות באמצעות מחצצויות (plate mats). הפכו כל פלטה אטומה ביד עד שהתמיסה תהיה מעורבבת היטב. הניחו את הפלטות באינקובטור המתאים למשך זמן הדגירה הנדרש כפי שמופיע בפרוטוקול הטקסט; רשמו את הזמן ההתחלתי כזמן אפס, וכן את זמני הדגירה המתאימים בסוף כל תקופת דגירה.

סובב במערכת צנטריפוגה את הפלטות האטומות למשך שלוש דקות בערך ב-2,900 G. לאחר הצנטריפוגה, העבר 250 µL מכל באר של פלטות הבארים העמוקות שעברו אינקובציה לבארים המתאימות בפלטות 96 באר שחורות בעלות תחתית שטוחה. פלטה שחורה אחת תשמש עבור כל פלטת בארים עמוקים שעברה אינקובציה.

חשוב להעביר את הדגימות מלוחות הבארות העמוקות שדגרו לבארות המתאימות בלוחות 96 בארות שחורים בעלי תחתית שטוחה, בהתאם להוראות היצרן עבור קורא הלוחות הפלואורימטרי שבו נעשה שימוש. הגדירו את אורך גל העירור ל-365 nanometers ואת אורך גל הפליטה ל-450 nanometers.

טענו אחת מהלוחיות הסטנדרטיות, הגדירו את הפלואורימטר להגבר אוטומטי (automatic gain) וקראו את הלוחית. לאחר מכן, הגדירו את ההגבר לידני והפחיתו את הערך מהאופטימלי למספר הנמוך הבא, מעוגל למכפלה הקרובה של חמש. עבור כל לוחית סטנדרטית, חזרו על המדידה פעמיים לכל לוחית.

בשלב הבא, טען את פלטת הדגימות. הגדר את ההגבר (gain) למצב אוטומטי והפעל את פלטת הדגימות. הרץ שוב את פלטת הדגימות באופן ידני כדי להתאים את ההגבר הגבוה ביותר עבור כל אחת מפלטות הסטנדרט.

יש להתחיל את ניתוח הנתונים על ידי הזנת נתוני הפלואורסצנציה של עקומת הכיול לגיליון אלקטרוני עבור התקנים MUB ו-MUC. המירו את הריכוזים המיקרומולריים למיקרומולים עבור כל דגימה. על סמך נתוני הפלואורסצנציה של עקומת הכיול, חשבו את השיפוע, נקודת החיתוך עם ציר ה-y וערכי ה-R squared עבור ריכוזי התקנים MUB ו-MUC.

ערכי r squared קבילים צריכים לעלות על 0.98 עבור כל דגימה. ניתן להציג את עקומות הכיול בתרשים פיזור, שבו קריאות הפלואורסצנציה מוצגות כמשתנה התלוי וריכוז התקן מוצג כמשתנה הבלתי תלוי. הזן את נתוני הפלואורסצנציה הגולמיים של הדגימה בתוספת התסבסב לגיליון אלקטרוני חדש.

יש לכלול גם את זמן האינקובציה ואת משקל האדמה היבשה עבור כל דגימה, להפחית את ערכי נקודת החיתוך של עקומת הסטנדרט מערכי הפלואורסצנציה של הדגימות המתאימות, ולאחר מכן לחלק בשיפוע של עקומת הסטנדרט המתאימה. באמצעות משוואת קו הסטנדרט, הכפילו את המיקרו-מול של הדגימה ב-91 milliliters, שהוא נפח הבאפר ששימש בתגלי הדגימה. חלקו את הערך שהתקבל בזמן האינקובציה הספציפי של הדגימה ובמסת האדמה היבשה.

לבסוף, הכפילו את הערך שהתקבל ב-1000 כדי לקבל את היחידות הרצויות. התוצאות מוצגות מתוך מחקר אקלימי ניסויי המשווה בין קרקעות שנחשפו לתנאי אקלים סביבתיים לבין קרקעות שנחשפו לטיפולי חימום וריכוז פחמן דו-חמצני מוגבר; המוצגים כאן הם פעילויות פוטנציאליות של אנזימים חוץ-תאיים (EEAs) באתר העשרה של פחמן דו-חמצני מוגבר וחימום בערבה, בחלקות ביקורת ובחלקות טיפול. בדוגמה זו, בדיקות של פעילויות רכישת אנזימי פחמן, חנקן וזרחן בעומק קרקע של 0 עד 5 סנטימטר לא הראו הבדלים בין הטיפולים הניסוייים.

עם זאת, בעומקי קרקע של 5 עד 15 סנטימטרים, מספר EEAs פוטנציאליים הראו הבדלים משמעותיים. לדוגמה, רמותיהם של אנזימי פירוק הפחמן beta one four glucoside ו-beta D cello biolace היו נמוכות יותר בחלקות הניסוי שבהן הוגברו רמות הפחמן הדו-חמצני והחימום, בהשוואה לחלקות שבהן שררו תנאי אקלים סביבתיים. כמו כן, רמותיהם של אנזימי מינרליזציית החנקן והזרחן היו נמוכות יותר בחלקות הניסוי בהשוואה לתנאי אקלים סביבתיים בעומקי קרקע של 5 עד 15 סנטימטרים.

חישוב ושרטוט הסכום של כלל פעילויות האנזימים החיצוניים (EEAs) הפוטנציאליים במחזורי הפחמן, החנקן או הזרחן יכול להיות גישה מועילה לצפייה בדפוסים רחבים יותר הנוגעים למחזורי פחמן, חנקן ו/או זרחן פוטנציאליים בקרקע. בדוגמה זו, חושב הסכום של פעילויות ה-EEAs הפוטנציאליים של beta one four glucco, beta D cello, bio hydrolase, beta xlo ו-alpha one four glucco כדי לייצג פעילויות פוטנציאליות של מחזור פחמן. הסכום של beta one four N acetyl glucose amid dase ו-L leucine amino peptidase חושב כדי לייצג פעילויות פוטנציאליות של מחזור חנקן.

פעילות פוספטאז שימשה לייצוג פעילויות פוטנציאליות של מחזור זרחן. ה-EEAs הפוטנציאליים למחזור פחמן, חנקן וזרחן כולל נטו בירידה בחלקות הניסוי של ריכוז פחמן דו-חמצני מוגבר וחימום בהשוואה לחלקות בתנאי אקלים סביבתיים, בעומקי קרקע של 5 עד 15 סנטימטרים. עם זאת, מגמה זו הייתה מובהקת רק עבור פעילויות מחזור חנקן וזרחן כולל, וערכי ה-EEAs בקרקע לא נבדלו באופן מובהק בין חלקות הניסוי.

בעומקי קרקע של 0 עד 5 סנטימטרים. התוצאות מצביעות על מגמות מנוגדות בפעילות האנזימטית ובקבוצות הפונקציונליות בין חלקות הניסוי בתגובה לעומק הקרקע; היחס של EEAs פוטנציאליים הוא דרך אחת להערכת דרישות התזונה המיקרוביאליות. כאן, פעילויות של אנזימי קרקע, גאומטריה של tochi, יחסי פחמן לחנקן, פחמן לזרחן או חנקן לזרחן נבדלים באופן מובהק בין חלקות הניסוי בעומקי קרקע של 0 עד 5 סנטימטרים.

עם זאת, יחסי הפחמן-לזרחן והחנקן-לזרחן הפוטנציאליים של האנזימים היו גבוהים יותר בחלקות הניסוי שבהן רמת הפחמן הדו-חמצני והחימום הועלו. בהשוואה לתנאי אקלים סביבתיים בעומקי קרקע של 5 עד 15 סנטימטרים, הטמפרטורה יכולה להשפיע משמעותית על EEAs בקרקע. למרות זאת, בבדיקות מעבדה טיפוסיות, אנזימי קרקע נמדדים בטמפרטורה אחת שייתכן שאינה תואמת לתנאי הטמפרטורה של in C two.

תרשימי ארן (Aran plots) משמשים להצגת אנרגיית ההפעלה ויזואלית, והם נבנים באמצעות לוגריתם של פעילות האנזים כפונקציה של ההופכי של הטמפרטורה המומרת למעלות קלווין בציר ה-x. אנרגיית הפעלה מוגדרת בדרך כלל כאנרגיה המינימלית הנדרשת כדי לזרז תגובה כימית, ובמקרה זה היא משמשת כמדד לרגישות הטמפרטורלית של תגובות המזורזות על ידי אנזימים. אנרגיית הפעלה גבוהה יותר מעידה על רגישות טמפרטורלית גבוהה יותר של האנזים.

באופן דומה, אנרגיות הפעלה תואמות ישירות ל-Q 10. ערכי מקדם הטמפרטורה של הקינטיקה האנזימטית הפוטנציאלית עבור EEAs של פחמן, חנקן וזרחן נבחנו בשתי חלקות הניסוי בשני עומקי הקרקע, והממצאים הראו כי הרגישות לטמפרטורה של ה-EEAs לא הייתה שונה באופן מובהק בין חלקות הניסוי באף אחד מעומקי הקרקע. לאחר השליטה בשיטה, ניתן להחדיר 12 דגימות לתוך פלטות מיקרוטיטר של 96 בארות ב-30 דקות או פחות.

בנוסף, לאחר זמני האינקובציה שנקבעו, ניתן בדרך כלל לסובב, להעביר ולקרוא שוב את הפלטות ביורומטר (urometer) בתוך חצי שעה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להפיפט באופן עקבי. כל בועה של אוויר במהלך הפיפטור תשפיע לרעה על התוצאות בעקבות ביצוע הליך זה.

ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מיצוי DNA וריצוף, כדי לענות על שאלות נוספות הקשורות לתפקידה של הרכבת קהילת המיקרובים בקרקע בתפקוד הקרקע לאחר התפתחותה. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום האקולוגיה המיקרובית לחקור מחזורי חומרים ותהליכים ביו-גיאו-כימיים במערכות אקולוגיות יבשתיות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה מאוד לגבי האופן שבו ניתן לכמת פעילויות אנזימטיות פוטנציאליות.

יתרה מכך, עליך להיות מסוגל לפרש את הנתונים כך שישקפו תגובות מיקרוביאליות פוטנציאליות לגורמים כגון אקלים וסוגי קרקע שונים בתוך מערכות אקולוגיות שונות. זכור כי בעבודה עם חומרים פלואורסצנטיים, יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כדי למזער את החשיפה לאור, בשל הרגישות של קבוצת הפלואורופור לאור.