Name: שימוש Mellonella Galleria כאורגניזם מודל לחקר הלגיונלה pneumophila זיהום (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: חקור את מנגנוני ההדבקה של Legionella pneumophila באמצעות דגם הזחלים Galleria mellonella. השיטה מאפשרת ניתוח מהיר של גורמי עמידות חיידקיים ותפקוד תאי הדם בזחלים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

CR הרדינג נתמכה על ידי מלגת לימודי WT086724 Wellcome Trust.

יש המחברים אין לחשוף.

מודל זחל mellonella הגלריה לזיהום הלגיונלה pneumophila הוא כלי שימושי עבור במחקרי vivo של פתוגנזה. כאן הוא הראה כי מספר ההיבטים של זיהום מקרופאג יכול להיות סכם בג מודל mellonella, כולל התפקיד של T4BSS דוט / ICM בארסיות ושכפול חיידקים והלוקליזציה של דוט / ICM-מפעיל SidC. בנוסף, אנו מדגימים כי מעכבי כימיים של פילמור אקטין מפחית באופן משמעותי את תמותת זחל, מחקה תוצאות שהתקבלו בmacophages 47 וראיות תומכות שהפנמה של החיידקים נדרשה לגרום לתמותת זחל. בעבר, זה כבר הוכיח כי הווריאציות בארסיות בין L. זני pneumophila ראו במודלים של זיהום אחרים ניתן לאמת בג mellonella ואינדוקציה של גורמים ארסי בשלב צמיחת פוסט מעריכי נדרשים לארסי חיידקים <sup&gt; 36, המאשר כי ג mellonella הוא מודל מתאים לL. זיהום pneumophila. קביעת CFU של L. pneumophila מזחלים נגוע גם ביחידים או בזיהומים מעורבים מגדיל מאוד את התועלת של המודל. בעבר, מספר גורמים כבר גילו שיש להם השפעות עדינות על שכפול חיידקים במודלים של אחד או יותר של זיהום 29,48-51. למרות שהזחלים אינם בעלי מערכת חיסונית אדפטיבית, הנוכחות של התגובה החיסונית המולדת מספקת מבחר חזק יותר בהשוואה למקרופאגים לבד, אשר עשוי לשמש כדי להגביר פנוטיפים עדינים. לכן, לא מן הנמנע כי, בעוד זנים אלה כנראה לא משפיעים על תמותת זחל באופן משמעותי, הם עשויים להפגין ירידת שכפול או כושר חיידקים בג מודל mellonella. כמו גם שכפול של L. pneumophila בזחלים, הראינו דלדול hemocyte משמעותי בשלב מאוחר בזיהום. כL.pneumophila צפוי lyse תאי מארח בסוף מחזור השכפול שלו, מדידת דלדול hemocyte גם יכול לשמש כמדידה עקיפה של שכפול בקטריאלי. דלדול Hemocyte כבר בעבר בקורלציה עם תמותת חרקים בזיהום 3,52, למרות התוצאות האחרונות מצביעות על כך שהתמונה הזאת היא יותר מורכבת מbelived 37 ראשון. לאחרונה, זה כבר הראה כי רעב של זחלים גורם לרגישות מוגברת לזיהום דרך דיכוי תגובות חיסוניים 53. במבחנים שתוארו כאן, זחלים לא האכילו במשך תקופת המחקר ולא ידוע כמה טוב זחלי הפד יגיבו לL. זיהום pneumophila. אחד היתרונות של ג mellonella כאורגניזם מודל הוא הקלות של מיצוי וכימות של hemocytes מזחלים נגועים. קטעי וידאו קודמים הראו שיטות שונות לhemocytes חילוץ מחרקים 54,55 לעומת זאת, פגשוהוד שהוצג כאן הוא פשוט ומתאים לעיבוד מיידי. חולצו ברגע, hemocytes ניתן לכמת בקלות, המשמש לimmunofluorescence, מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים 36 או cytometry זרימה 56 או מתורבת ונגוע לשעבר vivo 3 המאפשר את התגובה של התאים לזיהום להיחקר בפירוט. זה מגדיל באופן משמעותי את הגמישות של המודל. אזהרה אחת לImmunofluorescence בג mellonella הוא ההיצע המוגבל של נוגדנים תוקף נגד G. חלבוני mellonella. עם זאת, מחקרים הוכיחו את יצירת נוגדנים נגד חלבוני זחל 57 ונוגדנים כנגד חלבונים חיסוניים הקשורים אדם נמצאו להכיר G. חלבוני mellonella 11 מדגימים את הפוטנציאל לimmunofluorescence על G. hemocytes mellonella. קלות G. זיהום mellonella מאפשר למסכים מהירים, בינוניים תפוקה שיכוליםלהשתמש בהם כדי להשוות את הארסיות של מיני הלגיונלה שונים וזנים ויכולים לשמש כדי לנתח עוד גורמים ארסי זוהו בעבר כגון מולקולות הדבקות 58 או מערכת מהסוג 2 ההפרשה 59 אשר נדרשות לארסיות בדגמים אחרים. בנוסף, שימוש במודל זה יאפשר זיהוי ואפיון נוסף של גורמים ארסי רומן כוללים חלבונים מופרשים מפעיל וtranslocated. לאחרונה, זה כבר הראה כי פעילות C פוספוליפאז של L. יש pneumophila תפקיד בג ארסיות mellonella 60 וכי חלבון מפעיל דוט / ICM SdhA נדרש לארסיות 37. בנוסף, יש לנו הוכיחו לאחרונה כי קיים מתאם בין פנוטיפים נצפו בג mellonella ובזן העכבר / J 37. זה מדגיש את הערך של כלי זה כדי להשלים protozoan סביבתית ומארח וmuri חד תאייםמודלים זיהום ne. ג מודל mellonella יהיה עוד יותר יקר בעתיד, לאחר שהרצף הגנומי הזחל יהיה זמין וכלים גנטיים יותר מבוססים. צעדים בכיוון זה כוללים את הפרסום האחרון המפרט את transcriptome הקשורות לחיסון 61 וההיווצרות של יוזמה לקידום להשתקת גנים בspp הפרפרים 62. באמצעות ג זחלי mellonella, יש לנו מספר הקריאות פשוטות, מהירה של ארסי חיידקים שיכולים לשמש כדי לחקור פתוגנזה של L. pneumophila. הקמתה של מבחני אלה והקרנה רחבה יותר של L. זני pneumophila וserogroups יגדילו את התועלת של הכלי החדש הזה ויתרמו להבנה שלנו ל &#39; פתוגנזה pneumophila.

מודלים של בעלי החיים של זיהום הוכיחו לא יסולא בפז בקביעת גורמים ארסי חיידקים. עם זאת, מודלים של חסרי חוליות שזכו לתשומת לב מוגברת כחלופה למודלים מסורתיים של יונקים של זיהום. הזחלים של עש השעווה, הוא יותר ויותר משמשים mellonella Galleria ללמוד מספר פתוגנים אנושיים חשובים, ובם חיידקים גראם חיוביים 1 וגראם שליליים 2,3 וכמה פטריות פתוגניים 4,5. באמצעות מודל חרקים יש מספר היתרונות על פני דגמים של יונקים מסורתיים, כחוליות, ג mellonella אינו כפוף למגבלות האתיות של מודלים של יונקים. בנוסף, ניתן לשמור את הזחלים בקלות, נגועים בהזרקה ללא הרדמה, לעבור טיפול מקדים עם מעכבים כימיים 6 ולקיים דגירה על 37 C ° 7. מעניין לציין, כי קשר טוב בין פתוגניות של כמה מיקרואורגניזמים בג מלlonella ומודלים של יונקים של זיהום כבר נקבעו 2,8. ההבנה המוגברת של המערכת החיסונית של ג mellonella גם סייע באפיון של אורגניזם מודל זה. למרות שאין לי חרקים מערכת חיסונית אדפטיבית כפי שנמצאו ביונקים, יש לי ההגנות סלולריות וההומרוס מתוחכמים הכוללים הייצור של פפטידים מיקרוביאלית 9 שהם. Hemocytes הוא המתווך העיקרי של ההגנות סלולריות והוא סוג התא רב ביותר נמצא בhemolymph (או בדם) של ג mellonella 10, תאים אלה הם phagocytes המקצועי ולבצע פעולות דומות למקרופאגים ונויטרופילים אדם על ידי שני תופסים ומשפילים חיידקים בתא phago-lysosomal 10,11 ויוצרים גושים סביב חיידקים פולשים, המגבילים את שכפול חיידקי 12 פיזי. הלגיונלה pneumophila הוא הפתוגן בדרכי הנשימה שגורם pneumoni החמור(מחלת הליגיונרים) באוכלוסיות רגישות כגון קשישים או מדוכאי חיסון 13. הלגיונלה נמצאת כל מקום בגוף במקורות מים הן סביבתיים ומעשה ידי אדם, שבו הוא הפתוגן של מינים שונים של אמבות מים מתוקים 14,15. הלגיונלה שורדת ו משכפל בתוך phagocytes המקצועי אלה על ידי שימוש בקומפלקס רב חלבון המכונה Dot / ICM (פגום בסחר אברון כפל תאיים /) הקלד מערכת 4 הפרשה (T4SS) לtranslocate מעל 275 חלבוני מפעיל לתא המארח 16-20. חלבונים אלו משמשים לערער את מסלולי phagocytic התא מארח הרגילים, מה שמוביל ליצירתו של הלגיונלה המכיל vacuole (LCV). LCV מונע התמזגות עם lysosomes ובמקום מגייס reticulum endoplasmic (ER) שמקורם בשלפוחית, וכתוצאה מתא מיוחד שדומה ER מחוספס 21,22. L. pneumophila נחשב נתיב אדם בשוגגעוגן; את אותן אסטרטגיות שתאפשרנה לה לשכפל בתוך אמבות, גם לאפשר שכפול במקרופאגים מכתשיים אדם 23. מארחים של יונקים היו מאופיינים כמודלים לזיהום הלגיונלה אדם כוללים עכברים וחזירי ים 24,25. עם זאת, הרוב המכריע של זני עכבר עמיד לזיהום הלגיונלה 26 למעט העכבר המולד בקן / J, מפתחת זיהום 24 מתון, מעצמם. למרות שמודל שפן הניסיונות דומה יותר למחלות בבני אדם 25, חוסר מוטנטים והתייקרות מרתיעה את השימוש בם 27. בנוסף, מספר דגמים חסרי חוליות פותחו עבור זיהום הלגיונלה pneumophila כולל Caenorhabditis elegans 28, דרוזופילה melanogaster 29 וכמה מינים של אמבות 30-32. עם זאת, יש מודלים אלה חולשות, ארסיות בג elegans </em&gt; המערכת אינה דוט / ICM תלוי 28, להגביל את השירות של מודל זה. מודל דרוזופילה הוכיח עצם כיעיל בחקירה ארסית חיידקי גורמי 29 ונראה מבטיח עם זאת, מודל זה לא מאופיין במלואו. אמבות חד תאיות הם המארחים הסביבתיים של L. pneumophila והם אידיאליים לחקירת הפעולה של גורמים ארסי ברמה מולקולרית 33 עם זאת חסרים כמה מתווכים חשובים של תגובת התא המארח של יונקים לזיהום כגון caspases 34. החולשות של המודלים קיימים, יחד עם העלות הגבוהה ודאגות אתיות הקשורות לניסויים יונקים, הובילו לחיפוש אחר אורגניזמים מודל מתאימים אחרים 29,35. אנחנו הוכיחו לאחרונה כי ג mellonella הוא מודל מתאים לL. pneumophila פתוגנזה 36,37. פרוטוקול זה מפרט את ניסיוני בטכניקות המשמשות ללהדביקing G. זחלי mellonella, ניתוח מוסר זחל, חילוץ hemocytes לספירה וimmunofluorescence וקביעת שכפול על ידי CFU קיימא סופרים מזחלים נגועים.

<table><tr><tbody><td colspan="4" ><חזק>חומר/ציוד</חזק>ACES</td></tr> <tr><td>תמצית שמרים (AYE) מרק</td><td></td><td></td><td>4 גרם ACES, 4 גרם תמצית שמרים, 0.4 גרם &#945;-קטוגלוטראט, pH 6.9, 400 מ"ל H2O, אוטוקלאב, 4 מ"ל תמיסת ברזל*, 4 מ"ל תמיסת ציסטאין* *הוסף מרכיבים סטריליים לאחר חיטוי</td></tr><tr><td>צלחות</td><td></td><td></td> <td>תמצית שמרים בופר פחם (CYE)כאמור לעיל, בתוספת של 0.6 גרם פחם פעיל ו-6 גרם אגר</td></tr><tr><td>תמיסת ברזל סטרילית (ברזל פירופוספט)</td><td>Sigma</td><td>P6526</td><td>תמיסת 0.6 מ"מ,</td></tr><tr><td>תמיסת ציסטאין סטרילית</td> מסוננת <td>סיגמא</td><td>C7880</td><td>3.3 מ"מ, תמיסת מלונלה סטרילית מסוננת</td></tr><tr><td>G. מלונלה (תולעי שעווה)</td><td>Livefood UK</td><td>W250</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-HA-טטרמתיל רודמין איזותיוציאנט ( TRITC)</td><td>Sigma</td><td>H9037</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Legionella LPS</td><td>Cambridge Biosciences</td><td>PA1-7227</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG Alexa488</td><td>Jackson Immunoreach</td><td>711-485-152</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופיל &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Sigma</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos phosphate buffered salt (D-PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Agar Scientific</td><td>R1026</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום כלוריד (NH4Cl)</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת טריפן כחולה</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin D</td><td>Biomol International</td><td>BML-T109-0001</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>חומר</חזק></td></tr><tr><td>מיקרוטיטר מזרק</td><td>Sigma</td><td>24544</td><td></td></tr><tr><td>מונה תאים, כפול, משופר Neubauer </td><td>VWR</td><td>631-0926</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td></td><td></td><td>ללוחות צנטריפוגה </td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td></td><td></td><td>כל מיקרוסקופ עם מסננים מתאימים לפלואורופורים</td></tr> <tr>הנדרשים<td>מיקרוסקופ</td><td></td><td></td> הפוך <td>לספירת תאים בת קיימא </td></tr><tr><td>כפפה חסינת ניקוב</td><td>עור</td><td></td><td></td> צב</tr></tbody></table>

שימוש<em&gt; mellonella galleria</em&gt; כאורגניזם מודל לחקר<em&gt; הלגיונלה pneumophila</em&gt; זיהום

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

הלגיונלה pneumophila, הסוכן סיבתי של דלקת ריאות חמורות בשם מחלת הליגיונרים, הוא הפתוגן אנושי חשוב שמדביק ומשכפל בתוך מקרופאגים מכתשיים. הארסיות שלה תלויה במערכת דוט / ICM הפרשת הסוג IV (T4SS), שהוא חיוני להקמת vacuole מתירנית שכפול המכונה הלגיונלה המכיל vacuole (LCV). L. זיהום pneumophila יכול להיות מודל בעכברי אולם רוב זני עכבר אינם מתירנית, מה שמוביל לחיפוש אחר מודלים זיהום רומן. הראינו לאחרונה כי הזחלים של mellonella Galleria עש השעווה מתאימים לחקירתו של ל &#39; זיהום pneumophila. ג mellonella משמש יותר ויותר כמודל זיהום לפתוגנים אנושיים ומתאם טוב בין הארסיות של כמה מיני חיידקים בחרקים ובמודלים של יונקים. מרכיב מרכזי של ההגנה החיסונית של הזחלים הוא hemocytes, מקצועphagocytes אל, אשר תופס ולהשמיד פולשים. L. pneumophila הוא מסוגל להדביק, בצורת LCV ולשכפל בתוך תאים אלה. כאן אנו מדגימים פרוטוקולים לניתוח ל &#39; ארסיות pneumophila בג מודל mellonella, כולל איך לגדל L. זיהומיות pneumophila, pretreat הזחלים עם מעכבים, להדביק את הזחלים וכיצד לחלץ תאים נגועים לכימות ומיקרוסקופיה immunofluorescence. אנו גם מתארים כיצד לכמת שכפול וכושר חיידקים במבחני תחרות. גישות אלו מאפשרות הסינון המהיר של מוטציות כדי לקבוע גורמים חשובים בL. ארסיות pneumophila, המתארת ​​את כלי חדש כדי לסייע להבנה של הפתוגן המורכב זו שלנו.

הנה הוא הוכיח כי ג mellonella הוא מודל מתאים, קל לשימוש ללימודי L. זיהום pneumophila. בעבר זה כבר הראה כי L. ארסיות pneumophila במקרופאגים, אמבות ומודלים של יונקים תלויה בנוכחות של מערכת הפרשת דוט / ICM 41-43. ג זחלי mellonella נדבקו כפי שתוארו לעיל והארסיות של הסוג בר (WT) ומתח דוט / ICM לקוי בהשוואה. זיהום עם 10 7 CFU של L. 130b מתח pneumophila הביא לתמותת 100% בתוך 24 הודעה hr זיהום (PI). עם זאת, ל &#39; זן pneumophila Δ Dota, שאין לה מערכת הפרשת דוט / ICM T4SS פונקציונלית, היה לא אלים בassay זה (איור 1). זה מוכיח כי ל &#39; ארסיות pneumophila בג mellonella תלויה בטרנסלוקציה של effectors דוט / ICM, מה שהופך את המודל הזה מתאים לאפיון שלתפקודם של החלבונים האלה. לאחרונה, זה היה הראה כי עיכוב של phagocytosis על ידי טיפול cytochalasin מוגבר susceptibly של הזחלים לזיהום על ידי קנדידה אלביקנס שמרים 6. כL. pneumophila הוא פתוגן תאיים, הוחלט לקבוע אם ספיגה של החיידקים היא מכרעת בפתוגנזה שלה במודל זה. הזחלים טופלו קודם לכן ב10 μl של 100 מיקרומטר Cytochalasin D (סיד) במשך 4 שעות על 37 מעלות צלזיוס, אז נדבק ב10 7 CFU של WT ל 130b pneumophila והתמותה במעקב ב24 טיפול pi שעה עם המעכב לבד לא השפיעו על הישרדות זחל. עם זאת, זחלי pretreated, נגועים מוצג הישרדות גבוהה יותר באופן משמעותי (P = 0.0066, מבחן t מזווג) בהשוואה ל, חרקים נגועים טופלו DMSO (איור 2). ההשפעה של טיפול סיד בוטלה על ידי pi 48 שעה (תוצאות לא מוצגות), זה יכול להיות בגלל זמן מחצית החיים של התרופה בגmellonella. זה מוכיח שספיגתו של ל &#39; pneumophila לג hemocytes mellonella הוא היבט חיוני של ארסיות בקטריאלי. על מנת לאמת את הביטוי ולקבוע את לוקליזציה subcellular של חלבון מפעיל בג mellonella, hemocytes הופק ועובד למיקרוסקופיה immunofluorescence. זחלים היו נגועים בWT וΔ Dota ל 130b pneumophila לבטא שבר של מפעיל המוגדר היטב T4SS, SidC 41-918, התמזגו 4 תגי HA N-מסוף. מפעיל זה הודגם להיקשר LCV באמצעות תחום phosphoinositide-4-מחייב פוספט 44. שימוש באנטי HA (אדום) ואנטי הלגיונלה נוגדנים (ירוקים), 4HA-SidC 41-918 מקומי לLCV בhemocytes הנגוע (איור 3). לוקליזציה זו יש בעבר הוכח בdiscoideum האמבות Dictyostelium ובמקרופאגים יונקים 44,45 מאשרים את גomparability של מודל זה. החשיבות של חלבונים לארסיות נקבעה בדרך כלל על ידי השוואת קינטיקה הצמיחה של סוג בר וחיידקים שעברו מוטציה. על מנת לעקוב קינטיקה שכפול החיידקים במהלך הזיהום, שלושה זחלים הוקרבו בכל נקודת זמן (0, 5, 18, ו24 pi hr), hemolymph שנאסף ונקווה וCFU/0.1g של hemolymph חולץ נקבע. לאחר טבילה ראשונית ב5 pi שעה, CFU של חיידקי WT מגדילה עד 24 pi שעה לעומת זאת, מתח Δ Dota עובר שום שכפול ומנוקה ב18 pi שעה (איור 4). היכולת של L. pneumophila לגרום תמוגה של מקרופאגים באופן T4SS תלוי תועד ארוך 46, עם זאת אין מחקרים דומים בוצעו in vivo. הריכוז של hemocytes במחזור נקבע בבית 5, 18, ו24 pi שעה זחלים היו נגועים בWT או Δ <eמ &#39;&gt; 130b pneumophila Dota ל&#39;, hemocytes מופק חרקים נגועים ותאי קיימא נספרים בשיטת הרחקת trypan הכחולה. בשעת 5 pi שעה אין הבדל בספירת hemocyte בין הזנים ניתן היה לראות (איור 5). עם זאת, ב18 pi שעה חלה ירידה משמעותית בריכוז hemocyte ב WT, אבל לא Δ Dota, זחלים נגועים. הבדל זה נמשך ב24 pi שעה הירידה במספר hemocyte, בשילוב עם הנוכחות של חיידקים תאיים כפי שניתן לראות על ידי immunofluorescence, עולה כי ל &#39; pneumophila משכפל בתוך hemocytes אז lyses, ומאפשר לחיידקים לעבור כמה סיבובים של שכפול. <img alt="איור 1" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig1.jpg" /> איור 1. זיהום עם L. pneumophila גורם דוט / ICM תלוי תמותת זחל. 10 זחלים היו נגועים עם PBS לבד או 10 <sעד&gt; 7 CFU של סוג בר (WT) או 130b pneumophila Δ Dota ל &#39;, טופח על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 72 וזמן מוות של הזחלים שנרשמו. כל הזחלים נגועים בWT נכנעו לזיהום תוך 24 הודעה hr זיהום (PI), עם זאת אין תמותה הייתה לראות בזחלים מחוסן עם PBS לבד או זן Δ Dota. תוצאות הן הממוצעים של שלושה ניסויים נפרדים, ± סטיית תקן. <img alt="איור 2" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig2.jpg" /> איור 2. תמותה היא תלויה בהפנמת חיידקים. 10 L. pneumophila זחלים טופלו קודם לכן ב10 μl של 100 מיקרומטר Cytochalasin D (סיד) במשך 4 שעות על 37 מעלות צלזיוס ואז נדבקו ב10 7 WT ותמותה במעקב בזחלי pretreated 24 pi שעה הפגינו באופן משמעותי (P = 0.0066, מבחן t מזווג) מופחת תמותה. תוצאות מייצגות את מאהn של בארבעה ניסויים עצמאיים ± סטיות תקן עם 10 זחלים לכל מצב. <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig3.jpg" /> איור 3. ההדמיה Immunofluorescence של חלבוני מפעיל בhemocytes חילוץ. hemocytes הוצאו מזחלים נגועים בL. pneumophila 130b WT או Δ Dota להביע 4HA-SidC 41-918 ב5 תאי pi שעה הוכתמו באמצעות אנטי HA (אדום) ואנטי הלגיונלה נוגדנים (ירוקים) וכתם DAPI ה-DNA (כחול) כדי להמחיש את הגרעינים. 4HA-SidC 41-918 נצפו WT שמסביב, אך לא Δ Dota, חיידקים. בר סולם 5 מיקרומטר. <img alt="איור 4" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig4.jpg" /> איור 4. L. pneumophila משכפל בתוך ג מלונלה באופן דוט / ICM תלוי. זחלים היו נגוע בpneumophila WT או Δ Dota ל &#39;ו ב 0, 5, 18, ​​ו24 pi שעה hemolymph משלושה חרקים נגועים יקוו, מצופות על צלחות CYE ו CFU נחוש ו מנורמל לבידוד ולמשקל של hemolymph חילוץ. WT L. pneumophila המשוכפל במהלך הניסוי ואילו זן Δ Dota נוקה בתוך 18 תוצאות pi hr הם הממוצע של שלושה ניסויים נפרדים ± סטיית תקן. <img alt="איור 5" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig5.jpg" /> איור 5. זיהום עם WT L. תוצאות pneumophila בהרס hemocyte משמעותי. hemocytes חולצו בשעה 5, 18, ​​ו24 pi שעות מזחלים נגוע בpneumophila WT או Δ Dota ל &#39;ותאי קיימא נספרים באמצעות hemocytometer. לא נמצא הבדל במספר התאים נתפס בשעה 5 pi שעה בין הזנים עם זאת ב18 pi שעה רק כ 15% מhemocytes להישאר בזחלים נגועים בזן WT בהשוואה לזן Δ Dota. תוצאות הן הממוצעים של שלושה ניסויים נפרדים, ± סטיית תקן.

הזחל של עש mellonella Galleria שעווה הוקם לאחרונה כמודל vivo בללמוד זיהום pneumophila הלגיונלה. הנה, אנחנו מדגימים טכניקות בסיסיות לאפיין את הפתוגנזה של הלגיונלה בזחלים, כוללים חיסון, מדידה של אלימות ושכפול חיידקים, כמו גם הפקה וניתוח של hemocytes הנגוע.

שימוש<em&gt; Mellonella Galleria</em&gt; כאורגניזם מודל לחקר<em&gt; הלגיונלה pneumophila</em&gt; זיהום

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בזחלי עש השעווה Galleria melanoma כדי לנתח את הפתוגנזה של הפתוגן החיידקי Legionella pneumophila. לשלב הפתיחה, הדבר משיג על ידי הדבקת זחלים במאבקי L. pneumophila באמצעות הזרקה במהלך 72 השעות הבאות.השראת תמותה של הזחלים באה לידי ביטוי באובדן ניידות ובהופעת פיגמנטציה שחורה; הזחלים מוקרבים לצורך הפקת ההמולימפה שלהם בנקודות זמן שונות. לאחר מכן, ההמולימפה נזרעה בצלחות כדי לספור את החיידקים ולהדגים את תאי החרק. בסופו של דבר, ניתוח הצמיחה החיידקית והשימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית עקיפה (immunofluorescence) מספקים תובנה לגבי הנישה התוך-תאית ש-legionella ביססה במהלך זיהום in vivo והבדלים בארירות (virulence) בין זנים.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני מודלים של Legionella בעכברים ובתרביות תאים הוא שהיא מקובלת יותר מבחינה אתית, והיא מאפשרת ניתוח מהיר וחסכוני של מספר רב של זני Legionella באורגניזם רב-תאי, דבר שיהפוך את הדגמת הפרוצדורה לברורה. Harding, סטודנט לדוקטורט מהמעבדה שלי, עובד תמיד עם L Pneumophila ברמת בטיחות ביולוגית 2 (biosafety Containment level two) בתוך קבינות בטיחות מיקרוביולוגיות בהתאם לכללים המקומיים; ראשית, דגרו את צלחות הבקטריות למשך ארבעה ימים. לאחר מכן, יום אחד לפני הדבקת הזחלים, השביו לופ מלא בבקטריות המכיל מספר מושבות ב-1 mL של ציר A YE שחומם מראש, ומדדו את הבליעה (absorbance) של התרחיף ב-600 nanometers.בשלב הבא, חדיש תרבית YE טרייה בנפח של 3 ml עד לערך OD 600 של 0.1. דגרו את התרביות בטמפרטורה של 37 °C במנער במהירות של 200 RPM למשך 21 שעות עד לשלב הפוסט-אקספוננציאלי, כדי שניתן יהיה להשתמש בהן להדבקה. מדדו את הבליעה של התרחיף באורך גל של 600 nm.לאחר מכן, דללו את התרבית כדי להגיע למיליארד CFU למליליטר. ב-DPBS, הכינו מכל עבור הלרוות של G melanoma על ידי הנחת נייר סינון עגול בקוטר 10 סנטימטר בתחתית של צלחת פטרי בקוטר 10 סנטימטר באמצעות פינצטה בעלת קצה קהה. הניחו 10 לרוות בריאות בגודל דומה בערך על נייר הסינון, והסירו חרקים שאינם בריאים, בעלי גוון חום או בעלי מראה מוכתם.זחלים בריאים הם בעלי גוון קרמי אחיד ללא אזורים של התכהות, והם מסוגלים להניע את עצמם במהירות. אם הם התהפכו, הכינו את פלטפורמת ההזרקה על ידי הדבקת נייר סינון למגירה של מabilis זרימה (safety cabinet). לאחר מכן, הדביקו טיפ של P 1000 על נייר הסינון.כעת יש לעקר מזרק מיקרוטיטר של 20 µL על ידי שאיבת 70% ethanol והשראת המזרק ב-70% ethanol למשך 10 דקות לפחות. הסר כל שארית ethanol מהמזרק על ידי שאיבה ודחיפה של מים סטריליים מספר פעמים. לאחר מכן, שאב 10 µL מתלי ה-L pneumophila בריכוז של 1 billion CFU per mL.קחו זחל אחד ובעדינות אך בנחישות, הפכו אותו כך שגבו יכופף מעל קצה ה-P 1000.מקם את קצה המזרק מעל הרגל הקדמית הימנית של הזחל. לאחר מכן, הכנס בעדינות את קצה המחט אל תוך הרגל הקדמית. ודא שהמחט נמצאת בתוך הזחל ונכנסה בצורה חלקה.הזריקו את כל בולוס ה-10 µL. אם המזרק הוכנס כראוי, ניתן יהיה לאסוף את הזחלים באמצעות המזרק בלבד ולהעבירם אל התא. הזריקו סך הכל 10 זחלים לכל תנאי, והזריקו ל-10 זחלים נוספים DPBS בלבד כביקורות.תהליך ההזרקה הוא השלב המאתגר ביותר מבחינה טכנית בפרוצדורה וידרוש תרגול. לבסוף, הצמידו את המכסים של הצלחות בעזרת סרט דביק והניחו אותן במיכל אחסון משני. אחסנו אותן בטמפרטורה של 37 °C למשך משך הניסוי.יש לנתח את שיעור התמותה במספר נקודות זמן לאחר ההדבקה. כדי לבחון את תמותת הזחלים המודבקים, השתמשו בפינצטה בעלת קצה קהה כדי להפוך את הזחלים וחפשו תנועה של הרגליים. זחלים בריאים אמורים להתהפך במהירות.פיגמנטציה מעידה על תגובה חיסונית חזקה לזיהום. אם קיימת תנועה כלשהי, ספרו את הלרוות כחיות בנקודות זמן שונות. בחרו אקראית שלוש לרוות והעבירו אותן לשפופרת של 14 milliliter.הניחו את המבחנה על קרח למשך חמש עד 10 דקות, עד שלא נצפה תנועה של הרגליים. לאחר מכן, העבירו את הזחלים לצחנת פטרי. כעת, השתמשו בסקלפל כדי לבצע חתך בין שני פלגים סמוך לזנב, על מנת לאסוף את ההמולימפה מכל זחל.הרחיקו את החתכים מהמעי כדי למנוע זיהום על ידי חיידקי מעי. סחטו את ההמולימפה מהזחלים לתוך מבחנת צנטריפוגה סטרילית של 1.5 milliliter. זחל בודד מספק בין 15 ל-50 microliters של המולימפה.כעת יש להשתמש בהמולימפה תוך 10 דקות כדי לקבוע את חיוניות החרק, אחרת היא תקריש. מערבבים 20 µl של המולימפה עם 20 µl של תמיסת tripan blue בבאר אחת של פלטת 96 בארות; טוענים שלוש בארות באופן זה. מדגירים את התגובות למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, עבור כל תגובה, השתמש ב-10 µL כדי לספור את התאים החיוניים שאינם כחולים באמצעות המוסייטומטר (hemo cytometer). לעיבוד התאי הדם לצורך מיקרוסקופיה, העבר בפיפטה את דגימת ההמולימפה שנספחה על זכוכית כיסוי של 10 עד 15 מילימטרים בתוך פלטת 24 בארות.לאחר מכן, יש להוסיף 0.5 milliliters של DPBS ולערבב היטב את ההמולימפה באמצעות ניעור עדין. באמצעות מחזיק פלטות לצנטריפוגה אטום לאיירוסול, יש לצנטריפוג את הפלטה למשך 10 דקות ב-500 G בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יש לבחון כל באר באמצעות מיקרוסקופ הפוך כדי לוודא שההמוציטים נצמדו.בשלב הבא, הסירו את העלייה ושטפו בזהירות את התאים שלוש פעמים על ידי הוספת 0.5 milliliters של DPBS לדופן הבאר. נערנו את הפלטה מספר פעמים ושאבו את ה-DPBS. פרטים על קיבוע וצביעה מופיעים בפרוטוקול הכתוב.כדי לכמת את ה-CFU הבקטריאליים, הכין דילולות סדרתיות של פי עשרה להמולימפה בתווך YE סטרילי. לאחר מכן, חלק את בסיסו של פלטת CYE המכילה SPECTmycin לשישה מגזרים שווים. פזר שלוש טיפות של 25 µL מכל דילול, החל מהדילול המדולל ביותר, בכל מגזר של הפלטה.דגרו את הצלחות אלו וספרו את המושבות בשלב מאוחר יותר. זחלי G melan הוחדרו עם זן בר ועם זן חסר ICM של L pneumophila. הדבקה עם 10 million CFU של זן one 30 B הובילה ל-100% תמותה בתוך 24 שעות.עם זאת, כדי לקבוע האם בליעת החיידקים היא קריטית עבור הפתוגנזה שלו, נעשה שימוש בזן delta A, שאין לו מערכת הפרשה תפקודית מסוג ICM T four SS, אשר אינו וירולנטי. במודל זה, זחליים טופלו מראש ב-cyto D ולאחר מכן הודבקו; טיפול במעכב לבדו לא השפיע על ההישרדות לאחר 24 שעות, אולם זחליים שהודבקו לאחר טיפול מקדימה הפגינו שיעור הישרדות גבוה משמעותית בהשוואה לקבוצות הביקורת. על מנת לתקף את הביטוי ולקבוע את הלוקליזציה התת-תאית של חלבון אפקטור ב-g Melan Legionella המבטאת פרגמנט של אפקטור הממוקם ב-LCV המוגדר היטב.השתמשו ב-SID C המחוברת לארבעה תגי HA טרמינליים כדי להדביק את הזחלים, והם נותחו במיקרוסקופיה כדי לעקוב אחר קינטיקת השכפול הבקטריאלי. הזחלים נשחטו בנקודות זמן שונות לאחר ההדבקה, ונמדד ה-CFU לגרם של המולימפה שהופקה. לאחר ירידה ראשונית בחמש שעות, ה-CFUs של חיידקי הטיפוס הפראי עולים. עם זאת, זן ה-delta a אינו עובר שכפול ומנוקה עד לשעה 18. הוצאו המוציתים מהחרקים המודבקים, ותאים חיוניים נספרו באמצעות שיטת ההדרה של tripan blue. בחמש שעות לאחר ההדבקה, לא נראה הבדל.ספירות תאי Hemocyte בין הזנים. עם זאת, עד לשעה ה-18 חלה ירידה משמעותית בריכוז ההמוlymph בזקיקי לרוות מסוג wild type, אך לא באלו שנדבקו ב-delta A. תוצאה זו in vivo מרמזת כי L pneumophila משכפל בתוך ה-hemocytes ואז גורם לליזים שלהם.לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן ההדבקה של פגית, מיצוי ההמולימפה, ועיבוד ההמוציטים לצורך ניתוח היבטים שונים של הפתוגנזה של legionella.

use-galleria-mellonella-as-model-organism-to-study-legionella

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

זיהום haemocolic אוראלי ותוך של זחלים של עש השעווה הגדולה...

החרקים<em&gt; גלרית mellonella</em&gt; כדגם זיהום רב עצמה כדי לחקור פתוגנזה קטריאלי

טכניקה זו מספקת שיטה לקצור, לנרמל ולכמת צמיחה תאית של חיידקים פתוגנים כי הם מראש מעובדים בתאי פונדקאי protozoan טבעיים לפני הזיהומים של תאי יונקים. שיטה זו יכולה להיות שונה כדי להתאים מגוון רחב של תאי מארח לבמה יחול כמו גם סוגי תאי היעד.

זיהומים של תאי יונקים צייתנים עם חיידקי protozoan דרוך-

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור מודל הניהול אוראלי בעזרת הזחלים mellonella גלריה (galleria) , כיצד לאפיין המושרה תגובות מערכת החיסון המולדת. באמצעות פרוטוקול זה, חוקרים ללא ניסיון מעשי תהיה אפשרות להשתמש mellonella ג שיטת פיטום.

גלרייה mellonella מודל הניהול אוראלי את תגובות מערכת החיסון מולדים Study Commensal-Induced

גלריה מלאבלה הוקמה לאחרונה כמודל מבחינה מוסרית, זולה, ומקובלת מבחינה אתית עבור קומפלקס השחפת של החיידק . כאן אנו מתארים ולהדגים את הצעדים שננקטו כדי ליצור זיהום מוצלח של G. מלובלה עם biלומילאוקטריה בואוויס bcg lux.

השימוש חסרי חוליות גלריה מלאבלה כמודל זיהום לחקור את מתחם שחפת של פטרת

הדמיה של תאים חיידקיים היא גישה ביולוגיה מערכות מתפתחים התמקדו הגדרת תהליכים סטטיים ודינאמיים המכתיבים את הפונקציה של מכונות macromolecular גדולות. כאן, שילוב של הדמיה תא כמותי לחיות וטומוגרפיה מסוג ההקפאה משמשת לחקר הלגיונרים האלה הפרשת מערכת הפרשה ופונקציות.

החלת הדמיית תאים בשידור חי וטומוגרפיה ממוחשבת כדי לפתור את התכונות הספאטימיות של הלגיונרים האלה מערכת הפרשות

מחקר זה מציג מסגרת מתוקננת לאופטימיזציה של מודלים של זיהום G. mellonella לשימוש בהערכה אנטי-מיקרוביאלית פרה-קלינית. יישום מודל G. mellonella כחלק מצנרת פיתוח אנטי-מיקרוביאלית פרה-קלינית עשוי להפחית את מספר התרכובות הלא יעילות המתקדמות לניסויים קליניים.

Galleria mellonella כמודל סינון אנטי-מיקרוביאלי

בתהליך ההדבקה, צעד מפתח הוא הדבקה של פתוגנים עם תאים המארח. ברוב המקרים שלב זה הידבקות מתרחשת בנוכחות הלחץ המכני שנוצר על ידי זרימת נוזל. אנו מתארים טכניקה מציגה הלחץ גזירה כפרמטר חשוב במחקר של הידבקות חיידקים.

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

שיטה זו מאפשרת אפיון של חיידקי המורחבת שיתוף תרבות עם EpiAirways, רקמות אפיתל הנשימה העיקרי האדם גדל ב ממשק אוויר הנוזל, רלוונטית מבחינה...

שימוש במודל EpiAirway לאפיון לטווח ארוך מארח הפתוגן אינטראקציות

בדיקות אבחון רגישות מיקרוביאלית הנוכחי מסתמך על צמיחה של planktonic מבודד ב מזין, עשיר תנאים אירוביים. כאן, אנו מעסיקים בינוני חלופה כיח מלאכותית ללמוד הרגישות מיקרוביאלית של Pseudomonas aeruginosa biofilms תחת שני תנאים אירוביים ו microaerophilic נציג נוסף של הריאה סיסטיק פיברוזיס.

שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; בתנאי רלוונטיים יותר ריאות סיסטיק פיברוזיס

מקרופאגים הנגזרות מונוציטים הם תאים חשובים של מערכת החיסון המולדת. כאן, אנו מתארים קלים...

<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל ללמוד ההטרוגניות של בידול Macrophage אדם וקיטוב

חקור את מנגנוני ההדבקה של Legionella pneumophila באמצעות דגם הזחלים Galleria mellonella. השיטה מאפשרת ניתוח מהיר של גורמי עמידות חיידקיים ותפקוד תאי הדם בזחלים.

שימוש

גלה סרטונים נוספים