Name: שינויי קונפורמציה Submillisecond בחלבונים נפתר על ידי photothermal Beam הסטה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: חקור שינויי קונפורמציה תת-מילישניות בחלבוני קלציום עצביים באמצעות טכניקת היסט הקרן הפוטותרמית עם תרכובת DM-nitrophen. שיטה זו מאפשרת מדידה סימולטנית של שינויי נפח ואנטרופיה בקנה מידה זמן מהיר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (MCB 1,021,831, JM) וי &amp; E. ביו רפואית תכנית המחקר (פלורידה מחלקת בריאות, JM).

1. הכנות לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את הכנת מדגם וכל מניפולציות המדגם בחדר חשוך כדי למנוע משחררות רפרוף לא רצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Solubilize DM-nitrophen ((1 - (2-ניטרו-4 ,5-dimethoxyphenyl) - N, N, N &#39;, N&#39;-tetrakis [מתיל (Oxy-קרבוניל)] -1,2-ethanediamine) ב50 HEPES מ&quot;מ חיץ, 100 מ&quot;מ KCl, pH 7.0 לריכוז סופי של 400 מיקרומטר (ε 350nm = 4330 M -1 cm -1 9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף CaCl 2 מפתרון מניות 0.1 M כדי להשיג יחס רצוי של [Ca 2 +]: [DM-nitrophen]. לחלבונים עם ד K עבור Ca 2 + עמותה גדולה מ10 מיקרומטר, היחס של [Ca 2 +]: [DM-nitrophen] של 1:1 עדיף למנוע מחייב של 2 + Ca-שוחרר תמונה לDM-nitrophen שברחה מכלוב . ואכן, שוקל את ערך ד K עבור DM-nitrophen להיות 10 ננומטר והריכוז הכולל של DM-nitrophen וCa 2 + להיות 400 מ&quot;מ, ~ 90% סידן חלבון מחייביםעם ד K = 10 מיקרומטר יהיה בapoform. מצד השני, למחקר של Ca 2 + מחייב את חלבונים עם ד K &lt;10 מיקרומטר, עדיף להקטין את [Ca 2 +]: היחס [DM-nitrophen] ל0.95 למנוע Ca 2 + complexation עם APO- חלבון לפני צילום דיסוציאציה הכלוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Solubilize מתחם ההתייחסות, K 3 [Fe (III) (CN) 6] או Na 2 4 CRO, באותו חיץ כלמדגם. </li></ol> 2. הגדרת הניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התצורה הניסיונית הבסיסית מוצגת באיור 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש חור סיכה (P 2) כדי להתאים את הקוטר של קרן הבדיקה (פלט 632 ננומטר של לייזר הוא Ne-, כוח לייזר 5 mW ~) 1 מ&quot;מ ולהפיץ את קרן הבדיקה דרך מרכז תא יוצב בטמפרטורה בשליטת בעל תא באמצעות מראה M 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש במראה (ז 2) מאחורי המדגם כדי למרכז את קרן הבדיקהבמרכזו של גלאי רגיש עמדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תתמקד קרן הבדיקה במרכז של הגלאי בצורה כזאת, כי ההבדל במתח בין שתי דיודות העליונה ושתי דיודות תחתונה, כמו גם ההבדל במתח בין שתי דיודות בצד השמאל וימין של הגלאי הוא אפס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהמשך לכך, לעצב את קוטר של קרן המשאבה, פלט 355 ננומטר של ממותג Q Nd: YAG לייזר, FWHM 5 NSEC) באמצעות חריר 3 מ&quot;מ (P 1) ממוקם בין שתי מראות לייזר 355 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Copropagate קרן המשאבה דרך מרכז קובט כפי שמודגם באיור 2. חשוב ששני קרני הלייזר מופצות דרך מרכז התא האופטי באופן כמעט colinear להשיג זווית סטיה מדידה ובכך גבוהה המשרעת של אות PBD. תחת תנאי ניסוי, את הזווית של צומת האלומות ובדיקת המשאבה היא פחות מ 15 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במתחם התייחסות ליישר את החללית ומשאבהקרן להשגת אות PBD משביעה רצון, כלומר יחס טוב S / N ומשרעת PBD יציב על סקלות זמן ארוכים יותר (~ 100 אלפיות שנייה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את המיקום של קרן המשאבה ביחס לקרן הבדיקה על ידי התאמה הדרגתית של 355 מראות לייזר ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את המשרעת של אות ייחוס PBD כהבדל בין שתי דיודות העליונה והתחתונה על הגלאי רגיש העמדה. אות PBD צריכה להפגין גידול מהיר במשרעת בזמן בקנה מידה מהירה (&lt;10 μsec) ולהישאר יציבה ב100 זמנים אלפיות שניים כפי שמודגמת באיור 3. הזריקה לשונות נורו של משרעת PDB היא בתוך 5% של משרעת האות ושחזור האות מושפע בעיקר מתנודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הליניאריות במשרעת אות PBD ביחס לאנרגיית החום המשתחררת על ידי מדידת התלות ליניארית של אות PBD על כוח לייזר עירור ועל מספר אינשטיין נספגה, E= (1-10-), שבו תואם את ספיגת ההתייחסות בגל העירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את כוח הלייזר מתחת כ -1,000 μJ וספיגה של מתחם מדגם / התייחסות בגל העירור פחות מ 0.5 כדי למנוע ספיגת multiphoton וירידה של כוח קרן משאבה, בהתאמה, ולהבטיח ליניאריות של אות PBD. </li></ol> 3. מדידות PBD <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל עם המדידה של עקבות PBD להתייחסות. מניחים את הפתרון של מתחם ההתייחסות בתא קוורץ x 0.5 סנטימטר 1.0 סנטימטר x 1.0 סנטימטר או 1.0 סנטימטר ולמקם את התא בבעל הטמפרטורה מבוקרת. שני אורכי הנתיב לספק משרעת PBD דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות את אות PBD ההתייחסות כפונקציה של טמפרטורה בטווח הטמפרטורות 16-35 ° C עם תוספת הטמפרטורה של 3 מעלות צלזיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על כל שינוי בטמפרטורה, לבדוק את המיקום של קרן הבדיקה בגלאי רגיש העמדה מחדשלהתאים את המיקום למרכז של הגלאי במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הליניאריות של אות PBD כפונקציה של טווח [(dn / dt) ρ P / C] לפי משוואה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את פתרון המדגם באותו התא אופטי כמו למתחם התייחסות שמירה על אותו הכיוון של התא האופטי כמו למדידת ההתייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי מדגם עקבות PBD באותו טווח הטמפרטורות כמו להתייחסות ולבדוק את הליניאריות של משרעת PBD המדגם ביחס ל[ (dn / dt) ρ P / C] הטווח. </li></ol> 4. ניתוח נתונים סדר הגודל של הסטייה הוא ביחס ישר לשינוי הנפח עקב חימום המדגם (ΔV ה) ושינוי nonthermal נפח (nonth ΔV) לפי משוואת 1: <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq1.jpg" alt="משוואת 1" /> המשרעת של המדגם (S) והתייחסות (r) אות PBD ניתן לתאר באמצעות משוואות 2 ו -3, בהתאמה. <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq2.jpg" alt="משוואה 2" /> <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq3.jpg" alt="משוואה 3" /> אות PBD עומד ביחס ישר לפרמטר תגובת מכשיר (K) ומספר אינשטיין נספג (E). הקדנציה הראשונה במשוואה 2, (dn / dt) (עמ &#39;1/ρC) Q, תואמת את שינוי האות עקב החום המשתחרר לממס. Dn / dt הטווח מייצג את שינוי הטמפרטורה תלויה באינדקס שבירה, ρ הוא הצפיפות של הממס, עמ &#39;C הוא קיבול החום. כל הפרמטרים ידועים למים מזוקקים וניתן לקבוע לפתרון חיץ על ידי השוואת אותות PBD למתחם ההתייחסות במים מזוקקים ובמאגר מתאים. Q הוא כמות returne החוםד לממס. טווח ρ (DN / ד ρ) הוא יחידה קבועה פחות שהוא טמפרטורה עצמאית בטווח טמפרטורות 10-40 ° C 10. טווח רירי בטן Δn מתאים לשינוי באינדקס השבירה בשל נוכחותם של מיני קליטה בפתרון וזה זניח אם אורך הגל של קרן הבדיקה מוסט ביחס לספקטרום הספיגה של מינים כלשהו בפתרון. האות הנובעת ממתחם ההתייחסות (r) באה לידי ביטוי על ידי משוואה 3 בי ν h E הוא אנרגיית הפוטון באורך גל העירור, ν h E = 80.5 קלוריות / mol ל355 עירור ננומטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את המשרעת של אות PBD ההתייחסות כהפרש בין pretrigger ואות PBD הודעה הדק כפי שמודגם באיור 3. באופן דומה, לקבוע את המשרעת של הצום (s מהירה) ושלב איטי (s איטית) של אות PBD המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסל את פרמטר תגובת המכשיר, K, בהיקף של המשרעת של אות PBD המדגם על ידי משרעת של אות PBD להתייחסות. היחס של אות הדגימה לאות ההתייחסות נותן משוואה 4 ויכול להיות כפי שנכתב: <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq4.jpg" alt="משוואה 4" /> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במשוואה זו, לקבוע את החום המשתחרר לפתרון (Q) והשינוי בנפח nonthermal (nonth ΔV) הקשורים לתגובה ביוזמת תמונה מהמדרון וליירט, בהתאמה, של חלקה [(s / R) E ν h] טווח לעומת [טווח תלוי טמפרטורה (dn / dt) (1/ρCp)]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע את עוצמת תגובה ושינוי באנתלפיה למהירה ותהליך האיטי, קנה מידה של הנפח שנצפה ושינוי באנתלפיה לתשואת הקוונטים המתאים בהתאם למשוואות 5-7. <img src = &quot;/ files/ftp_upload/50969/50969eq5.jpg&quot; alt = /&gt; &quot;משוואה 5&quot; <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq6.jpg" alt="משוואה 6" /> <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq7.jpg" alt="משוואה 7" /> לתהליך רב שלבי עם קינטיקה המתרחשת בזמן בקנה המידה בין 10 μsec ~ 200 אלפיות שני, ניתן לקבוע את עוצמת הקול ושינויי אנתלפיה הקשורים לשלביה השונים של התגובה. אמפליטודות והגלגולים לצעדים הבודדים מנותחים על ידי התאמת הנתונים לפונקצית F (t) שמתאר את הפרופיל של הנפח ושינויי אנתלפיה הזמן. <img alt="משוואה 8" src="/files/ftp_upload/50969/50969eq8.jpg" /> שבו α 0 מתאים לים מהיר וα i מתאימה לים איטי לכל תהליך אישי וτ אני נמצא בחיים של צעדי תגובה הבודדים. מטמפרטורת התלות של קבוע קצב עבורr תהליכים בודדים (k i = 1 / τ) i הפרמטרים אנתלפיה ההפעלה ואנטרופיה ניתן בקלות לקבוע באמצעות עלילות איירינג. </li></ol>

<ol><li>Gensch, T., Viappiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+photothermal+methods%3A+accessing+time-resolved+thermodynamics+of+photoinduced+processes+in+chemistry+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).</li>
<li>Larsen, R. W., Mikšovská, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+resolved+thermodynamics+of+ligand+binding+to+heme+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Coord.+Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins.</a> Coord. Chem. Rev. 251 (9-10), 1101-1127 (2007).</li>
<li>Westrick, J. A., Peters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoacoustic+calorimetric+study+of+horse+myoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Bioph.+Chem%22%5BJournal%5D)">A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin.</a> Bioph. Chem. 37 (1-3), 73-79 (1990).</li>
<li>Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+heme+propionate+groups+to+the+conformational+dynamics+associated+with+CO+photodissociation+from+horse+heart+myoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Inorg.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin.</a> J. Inorg. Biochem. 101 (7), 977-986 (2007).</li>
<li>Mikšovská, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Conformational+Changes+Coupled+to+Ligand+Photodissociation+from+the+Heme+Binding+Domain+of+FixL%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of Conformational Changes Coupled to Ligand Photodissociation from the Heme Binding Domain of FixL.</a> Biochemistry. 44 (30), 10028-10036 (2005).</li>
<li>Miksovska, J., Gennis, R. B., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photothermal+studies+of+CO+photodissociation+from+mixed+valence+Escherichia+coli+cytochrome+bo3%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Photothermal studies of CO photodissociation from mixed valence Escherichia coli cytochrome bo3.</a> FEBS Lett. 579 (14), 3014-3018 (2005).</li>
<li>Losi, A., Michler, I., Gärtner, W., Braslavsky, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+Thermodynamic+Changes+Photoinduced+in+5%2C12-trans-locked+Bacteriorhodopsin.+Evidence+that+Retinal+Isomerization+is+Required+for+Protein+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Time-resolved Thermodynamic Changes Photoinduced in 5,12-trans-locked Bacteriorhodopsin. Evidence that Retinal Isomerization is Required for Protein Activation.</a> Photochem. Photobiol. 72, 590-597 (2000).</li>
<li>Kondoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Induced+Conformational+Changes+in+Full-Length+Arabidopsis+thaliana+Cryptochrome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Light-Induced Conformational Changes in Full-Length Arabidopsis thaliana Cryptochrome.</a> J. Mol. Biol. 413 (1), 128-137 (2011).</li>
<li>Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolabile+chelators+for+the+rapid+photorelease+of+divalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (17), 6571-6575 (1988).</li>
<li>Eisenberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equation+for+the+Refractive+Index+of+Water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Equation for the Refractive Index of Water.</a> J. Chem. Phys. 43 (11), 3887-3892 (1965).</li>
<li>Ellis-Davies, G. C., Kaplan, J. H., Barsotti, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+photolysis+of+caged+calcium%3A+rates+of+calcium+release+by+nitrophenyl-EGTA+and+DM-nitrophen%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen.</a> Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).</li>
<li>Miksovska, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+relationships+in+metalloproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Structure-function relationships in metalloproteins.</a> Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).</li>
<li>Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+profiles+for+CO+photodissociation+from+heme+model+compounds%3A+effect+of+proximal+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Inorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands.</a> Inorg. Chem. 44 (4), 1006-1014 (2005).</li>
<li>Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+profile+for+urea+photo-release+from+a+N-%282-nitrobenzyl%29+caged+urea+compound%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

העיקרון הפיזי מאחורי שיטות photothermal הוא שמולקולת צילום מתרגש מתפוגגת אנרגיה עודפת באמצעות הרפיה רטט למצב הקרקע, וכתוצאה מחימום תרמית של 1,12 ממס שמסביב. לממסים, כגון מים, זה מייצר התרחבות מהירה נפח (ΔV ה). מולקולות נרגשת מדינה עשויות גם לעבור תהליכי פוטו כי תוצאת שינויי nonthermal נפח (nonth ΔV) בשל אג&quot;ח מחשוף / היווצרות ו / או שינויים במבנה מולקולרי שיכול לשנות את הממדים המולקולריים של המולקולה (ים) (כלומר שינויים באן דר ואלס נפח...

שיטות צילום תרמי כגון calorimetry photoacoustic, סטיה קרן photothermal (PDB), וצורם חולפים בשילוב עם עירור לייזר שבריר שנייה מייצגות חלופה רבת עוצמה ל חולפת spectroscopies האופטי ללימודים של ביניים קצרים 1,2 זמן נפתר. בניגוד לשיטות אופטיות, כגון קליטה חולפת וספקטרוסקופיה IR, העוקב אחר הפרופיל של שינויי קליטה בכרומופור שמסביב הזמן; טכניקות photothermal לזהות בזמן התלות של שינויי חום / נפח ולכן הם כלים רבי ערך לחקר פרופילים של אופטי זמן תהליכים &quot;שקטים&quot;. עד כה, calorimetry photoacoustic והצורם חולפים כבר מיושמים בהצלחה ללמוד דינמיקה קונפורמציה של תהליכים הנגרם תמונה כוללים הגירת יגנד דו אטומית בglobins 3,4, אינטראקציות יגנד עם חלבון חיישן חמצן FixL 5, אלקטרון ופרוטון בתחבורת heme-נחושת oxidases 6nd photosystem השני, כמו גם צילום isomerization ברודופסין 7 ודינמיקת קונפורמציה בCryptochrome 8. כדי להרחיב את היישום של טכניקות photothermal למערכות ביולוגיות שחסרות chromophore ו / או fluorophore פנימי, טכניקת PBD הייתה בשילוב עם השימוש במתחם בכלוב לצילום הדק עלייה בריכוז ליגנד / מצע בתוך כמה מיקרו או מהיר יותר, בהתאם במתחם בכלוב. גישה זו מאפשרת ניטור של דינמיקה ואנרגטיקה של שינויים מבניים הקשורים ליגנד / המצע מחייב את חלבונים שחסרים fluorophore או כרומופור פנימי ובזמן בקנה מידה שאינם נגישים על ידי עצירת זרימת מכשירים מסחריים. הנה יישום של PBD כדי לפקח על התרמודינאמיקה של מתחם הכלוב, Ca 2 + DM-nitrophen, צילום מחשוף כמו גם קינטיקה לCa 2 + עמותה לתחום בטרמינל C-של חיישן סידן העצבי דאוןזרם התקינה האלמנט אנטגוניסט מודולטור (חלום) מוצג. Ca 2 + הוא מCa-שוחררה תמונה 2 + DM-nitrophen בתוך 10 μsec וrebinds לכלוב unphotolysed עם קבוע של ~ 300 μsec זמן. מצד השני, בנוכחות apoDREAM הקינטית נוספת המתרחש בזמן בקנה המידה אלפית השנייה הוא ציין ומשקף את יגנד מחייב את החלבון. היישום של PBD לחקור מעברי קונפורמציה במערכות ביולוגיות היה מוגבל בדרך כלשהי בשל קשיי אינסטרומנטלי; יישור למשל מפרך של החללית וקרן משאבה כדי להשיג אות PBD חזקה ושחזור. עם זאת, עיצוב מוקפד של הגדרת מכשור, שליטה מדויקת של הטמפרטורה, ויישור זהיר של קרן הבדיקה ומשאבה מספקים אות PBD עקבית ויציבה, המאפשרת ניטור של זמן נפתר שינויי אנתלפיה ועוצמת קול ברחב זמן בקנה מידה מ10 μsec כ 200 לאלפיות שניים. בנוסף, modifications של ההליך ניסיוני כדי להבטיח זיהוי של עקבות מדגם והתייחסות בטמפרטורה זהה, הרכב חיץ, אורינטצית תא אופטי, כוח הלייזר, וכו &#39;מפחית באופן משמעותי את השגיאה הניסיונית בכמויות תגובה נמדדו וenthalpies.

<table><tbody><tr><td>1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N&#039;,N&#039; -חומצה טטראצטית</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>D-6814</td><td>DM-ניטרופן, תרכובת סידן בכלוב, שומרים על תמיסות מלאי בחושך כדי למנוע פוטו-דיסוציאציה</td></tr><tr><td>4-(2-הידרוקסיאתיל)פיפרזין-1-חומצה אתנסולפונית, N-(2-הידרוקסיאתיל)פיפרזין-N&prime; -(2-ethanesulfonic acid)</td><td>Sigma Adrich</td><td>0909C</td><td>HEPES buffer</td></tr><tr><td>אשלגן פריציאניד (III)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>702587</td><td>תרכובת ייחוס למדידות PBD</td></tr><tr><td>נתרן כרומט</td><td>Sigma Aldrich</td><td>307831</td><td>תרכובת ייחוס למדידות PBD</td></tr><tr><td>דיודת לייזר He-Ne 5 mW 635 ננומטר</td><td>אופטיקה אדמונד</td><td>54-179</td><td>משמשת כקרן בדיקה למדידות PBD</td></tr><tr><td>אוסצילוסקופ,&nbsp;</td><td>LeCroy</td><td>Wave Surfer 42Xs</td><td>400 MHz bandwith</td></tr><tr><td>Nd:YAG לייזר</td><td>Continuum</td><td>ML II</td><td>קרן משאבה למדידות PBD</td></tr><tr><td>M355; מראה לייזר Nd:YAG</td><td>Edmund Optics</td><td>47-324</td><td>מראה לייזר לקו לייזר 355 ננומטר</td></tr><tr><td>M1 ו-M2; מראה דיודות לייזר</td><td>Edmund Optics</td><td>43-532</td><td>visilbe מראה לייזר שטוחה, טווח אורכי גל 300-700 ננומטר</td></tr><tr><td>P1 ו-P2; איריס דיאפרגמה</td><td>אופטיקה אדמונד</td><td>62-649</td><td>חור פינים לעיצוב הגשושית וקרני הפום</td></tr><tr><td>L1; עדשה דו-קמורה</td><td>Thorlabs</td><td>LB1844</td><td>עדשה למיקוד קרן הבדיקה בגלאי, EFL 50 מ"מ, טווח אורכי גל 350-2,000 ננומטר</td></tr><tr><td>DM, מראה דיכרואית</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP505</td><td>מראה דיכרואית ארוכת טווח עם אורך גל חתך של 505 ננומטר</td></tr><tr><td>F1; מסנן קצה</td><td>Andower</td><td>500FH90-25</td><td>מסנן מעבר ארוך באורך גל חיתוך של 500 ננומטר</td></tr><tr><td>מחזיק קובטה מבוקר טמפרטורה</td><td>Quantum Northwest</td><td>FLASH 300</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

שינויי קונפורמציה submillisecond בחלבונים נפתר על ידי photothermal beam הסטה

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

סטיה קרן photothermal יחד עם calorimetry תמונה אקוסטי ותרמי צורמת שייכת למשפחה של שיטות photothermal שלפקח בזמן פרופיל הנפח ואנתלפיה שינויי אור הנגרמים שינויי קונפורמציה בחלבונים במייקרו לאלפית שני בזמן קשקשים שאינם נגישים באמצעות מסורתית תחנה תזרים מכשירים. בנוסף, מאז שינויים הכוללים בנפח ו / או אנתלפיה הם חקרו, ניתן ליישם את הטכניקות הללו לחלבונים וBiomacromolecules האחרים שחסרים fluorophore ואו תווית chromophore. כדי לעקוב אחר דינמיקה ואנרגטיקה של שינויים מבניים הקשורים Ca 2 + מחייב מתמרים סידן, סידן חיישנים עצביים כגון, תרכובת סידן בכלוב, DM-nitrophen, הוא מועסק צילום הדק עלייה מהיר (τ &lt;20 μsec) בסידן חופשי שינויי ריכוז והנפח הקשורים ואנתלפיה הם חקרו באמצעות טכניקת סטיה קרן photothermal.

דוגמא מייצגת של PBD עקבות לCa 2 + תמונה שחרור מCa 2 + DM-nitrophen מוצגת באיור 3. השלב המהיר מתאים לצילום המחשוף של Ca 2 + DM-nitrophen וCa 2 + שחרור, ואילו השלב האיטי משקף Ca 2 + מחייבים לכלוב nonphotolysed. העלילה של המדגם משרעת PBD לשלב המהיר ואיטי בקנה מידה למשרעת של מתחם ההתייחסות כפונקציה של גורם הטמפרטורה תלוי [ρ p C / (dn / dt)] גורם בהתאם למשוואת 4 ומדרוג את הסכום שנצפה חום...

כאן אנו מדווחים יישום של טכניקת הסטת קרן photothermal בשילוב עם תרכובת בכלוב סידן, DM-nitrophen, לעקוב אחר דינמיקת המיקרו והאלפית שנייה והאנרגטיקה של שינויים מבניים הקשורים לעמותת סידן לחיישן סידן עצבי, אלמנט רגולטורים במורד אנטגוניסט מודולטור .

שינויי קונפורמציה Submillisecond בחלבונים נפתר על ידי photothermal Beam הסטה

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לאפיין שינויים קונפורמציוניים הקשורים לקשירת ליגנד למתמירים של סידן בלוח זמנים של תת-מילישנייה. המעבר הקונפורמציוני בין החלבון במצב APO לחלבון קשור לסידן מופעל על ידי פילוט פוטוכימי של תרכובת סידן כלואה, calcium DM nitro, המוביל לשחרור פוטוכימי של סידן חופשי. השינוי הנלווה במקדם השבירה נמדד כהעתקה של קרן הגשש באמצעות גלאי רגיש למיקום בעל ארבעה ערוצים.בשלב הבא, נמדדים עקומות סטיית קרן פוטו-תרמית כפונקציה של הטמפרטורה עבור הדגימה והביקורת כאחד. ניתוח משולב של עקומות סטיית קרן הפוטו מספק תובנה לגבי המנגנון של שינוי הקונפורמציה המושרה על ידי סידן במונחים של נפח התגובה ושינויים באנתלפיה. היתרון העיקרי של סטיית קרן פוטו-תרמית על פני שיטות קיימות, כגון top flow, הוא שטכניקה זו מאפשרת זיהוי סימולטני של שינויי נפח ואנטרופיה בסולם זמן של תתי-מילישנייה.ההדגמה החזותית של טכניקה זו נחוצה, שכן יישור מדויק של המכשיר הוא קריטי לשחזור פרמטרים תרמודינמיים. את הפרוצדורה ידגים וולטר גונזאלס, סטודנט לתואר מתקדם מהמעבדה שלי. יש לבצע את הכנת הדגימה ואת כל פעולות הטיפול בדגימה בחדר חשוך כדי למנוע שחרור (uncaging) לא רצוי. בסרטון זה, השלבים מודגמים באור לצורכי צילום.כדי להתחיל, המיסו DM Nitro בבופר HEPES בריכוז 50 millimolar עם 100 millimolar potassium chloride, pH 7.0, עד לר

submillisecond-conformational-changes-proteins-resolved-photothermal

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

אנו מציגים טכניקה המאפשרת הפרדה מרחבית של קונפורמרים או אשכולות שונים הנמצאים בקרן מולקולרית. דפלקטור אלקטרוסטטי משמש להפרדת מינים על ידי יחס רגע מסה לדיפול שלהם, המוביל לייצור הרכבים שלב גז של קונפורמר יחיד או stoichiometry אשכול.

הפרדה מרחבית של קונפורמרים מולקולריים ואשכולות

שלבי מפתח בתפקוד החלבון, בפרט שינויים בקונפורמציה של עמוד השדרה ותגובות העברת פרוטונים, מתרחשים לעתים קרובות בסולם הזמן של מיקרו-שנייה עד אלפית השנייה. ניתן לחקור תהליכים דינמיים אלה על ידי ספקטרוסקופיה אינפרא אדום של טרנספורמציה פורייה, במיוחד עבור חלבונים שתפקודם מופעל על ידי אור.

העברת פרוטון והחלבון Dynamics קונפורמציה בחלבונים רגישים לאור בזמן נפתר-Step-לסרוק פורייה-להפוך ספקטרוסקופית אינפרא אדום

אנו מציגים פרוטוקול ליצירת סרט בזמן אמת של חבילת גל סיבוב מולקולרי באמצעות מערך הדמיית פיצוץ קולומב ברזולוציה גבוהה.

הדמיה ישירה של סיבוב מולקולרי מהיר ליזר מונחה

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים של ניתוחים דיפרנציאלית-זיהוי של זמן לפתור אינפרא-אדום הרטט ספקטרוסקופיה ו אלקטרון עקיפה המאפשרים אבחנת העיוותים של מבנים מקומיים סביב photoexcited מולקולות ב טורי גביש נוזלי, נותן מבט אטומית על הקשר בין המבנה את הדינמיקה של החומר photoactive.

טכניקות הרומן להתבוננות מבניים הדינמיקה של גביש נוזלי Photoresponsive

ההצלחה של ניסוי קריסטלוגרפיה הפמטו-זמן לפתור שנייה טורי תלויה משלוח הדגימה היעילה. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים כדי למטב את ההבלטה של bacteriorhodopsin microcrystals של מזרק מיקרו-הבלטה צמיגות גבוהה. המתודולוגיה מתבססת על מדגם המגון עם מצמד-כיוונית הרומן והדמיה עם מצלמה במהירות גבוהה.

שיפור ההבלטה צמיגות גבוהה של Microcrystals עבור זמן לפתור את טורי קריסטלוגרפיה הפמטו-שנייה-רנטגן לייזרים

אנו מציגים פרוטוקול לשתק קרו יחיד במכשירים מיקרופלואידים וכביכמת שינויים בקונמציות שלהם תחת זרימת הטיה. פרוטוקול זה שימושי לאפיון המאפיינים הביומכאני והפונקציונלי של biomolecules כגון חלבונים ו-DNA בסביבת זרימה.

אפיון מולקולה חד-מולקולות באמצעות זרימת הטיה במיקרוסקופיה פלואורסצנטית

אנו מציגים מדריך מקיף להכנת מדגם יעד קבוע, איסוף נתונים ועיבוד נתונים עבור קריסטלוגרפיה סינכרוטרון סדרתית בקו קרן יהלום I24.

איסוף נתונים טוריים של יעד קבוע במקור אור יהלום

שיפור פלואורסצנטיות המושרה בחלבון המושרה בחלבון בזמן הוא חיישן קרבה פלואורסצנטי שימושי רגיש לשינויים מבניים מקומיים בחלבונים. כאן אנו מראים שניתן להשתמש בו כדי לחשוף קונפורמציות מקומיות יציבות α-Synuclein, אשר ידוע גם בשם globulared ולא יציב כאשר נמדד באמצעות סרגל FRET לטווח ארוך יותר.

ניצול שיפור פלואורסצנטיות הנגרמת על-ידי חלבון בזמן כדי לזהות קונפורמציות מקומיות יציבות אחת α-Synuclein Monomer בכל פעם

ספקטרוסקופיית פיזור אחורי של נייטרונים מציעה גישה לא הרסנית ונטולת תוויות לדינמיקה של ps-ns של חלבונים ומי ההידרציה שלהם. תהליך העבודה מוצג עם שני מחקרים על חלבוני עמילואיד: על הדינמיקה שנפתרה בזמן של ליזוזים במהלך צבירה ועל דינמיקת מי ההידרציה של טאו על היווצרות סיבים.

ספקטרוסקופיית נייטרונים ברזולוציה גבוהה לחקר דינמיקה של פיקו-שנייה-ננו-שנייה של חלבונים ומי לחות

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקול לחקר הגמישות והדינמיקה המקומית של ביומולקולות באמצעות אניזוטרופיה פלואורסצנטית שנפתרה בזמן ברמת מולקולה בודדת במצב מיקרוסקופיה קונפוקלית.

אניזוטרופיה פלואורסצנטית שנפתרה בזמן ממולקולות בודדות לאפיון גמישות מקומית בביו-מולקולות

פינצטה פלזמונית משתמשת בתהודה פלזמונית מקומית על פני השטח בננו-מבני זהב כדי ללכוד ננו-חלקיקים בודדים, כולל חלבונים, בתוך שדה אופטי בקנה מידה ננומטרי. שינויים באות המפוזר חושפים נוכחות חלבון ודינמיקה קונפורמטיבית, ומאפשרים ניטור ללא שינויים בפלואורופור או קשירת פני השטח.

ניטור דינמיקת קונפורמציה של חלבונים בודדים לא מותאמים באמצעות פינצטה פלזמונית

חקור שינויי קונפורמציה תת-מילישניות בחלבוני קלציום עצביים באמצעות טכניקת היסט הקרן הפוטותרמית עם תרכובת DM-nitrophen. שיטה זו מאפשרת מדידה סימולטנית של שינויי נפח ואנטרופיה בקנה מידה זמן מהיר.

שינויי קונפורמציה Submillisecond בחלבונים נפתר על ידי photothermal Beam הסטה

גלה סרטונים נוספים