שינויי קונפורמציה Submillisecond בחלבונים נפתר על ידי photothermal Beam הסטה

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לאפיין שינויים מאשרים הקשורים לקשירת ליגנד למתמרי סידן בטווח הזמן של תת-אלפית השנייה. המעבר האישורי בין חלבון ה-APO לחלבון הקשור לסידן מופעל על ידי מחשוף צילום של תרכובת סידן בכלוב סידן DM ניטרו שמוביל לשחרור פוטו של סידן חופשי. השינוי הנלווה באינדקס ההשתקפות נמדד כתזוזה של קרן הבדיקה באמצעות גלאי רגיש למיקום מרובע.

לאחר מכן, עקבות הטיית האלומה הפוטותרמית נמדדות כפונקציה של הטמפרטורה הן עבור הדגימה והן עבור הייחוס. ניתוח מורכב של עקבות הסטייה של קרן הצילום מספק תובנה לגבי המנגנון של מתג אישור המושרה על ידי סידן במונחים של נפח התגובה ושינויים באנטלפיה. היתרון העיקרי של הסטת אלומה פוטותרמית על פני התורן הקיים, כגון זרימה עליונה, הוא שטכניקה זו מאפשרת זיהוי בו-זמני של שינויי נפח ואנטרופיה בקנה מידה של תת-אלפית השנייה.

ההדגמה החזותית של טכניקה זו נחוצה מכיוון שהיישור המדויק של המכשיר הוא קריטי לשחזור פרמטרים תרמודינמיים. מדגים את ההליך וולטר גונזלס, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי, יבצע את הכנת הדגימה ואת כל המניפולציות של הדגימה בחדר חשוך כדי למנוע כל פריקה לא רצויה. בסרטון זה מדגימים צעדים באור למטרות צילום.

כדי להתחיל להמיס DM Nitro בערימות של 50 מילי-מולאר יש לחצוץ 100 מילי-מולרי אשלגן כלורי, pH 7.0 לריכוז סופי של 400 מיקרומולר. הוסף סידן כלורי מתמיסת המלאי המולארי של 0.1 כדי להשיג את יחס ריכוז הסידן ל-DN ניטרו הרצוי. לאחר מכן, יש להמיס את תרכובת הייחוס אשלגן ציאניד או נתרן כרומט באותו מאגר.

באשר לדגימה, עיין בפרוטוקול הטקסט לסכימה של התצורה הניסיונית הבסיסית להסטת האלומה הפוטותרמית. בעת הגדרת הניסוי, הפיץ את קרן הבדיקה דרך מרכז התא, המונחת במחזיק תא מבוקר טמפרטורה. לאחר מכן באמצעות חור סיכה, התאם את קוטר קרן הבדיקה למילימטר אחד, השתמש במראה שנייה מאחורי הדגימה כדי למרכז את קרן הבדיקה במרכז הגלאי הרגיש למיקום.

מקד את קרן הפרו במרכז הגלאי כך שההפרש במתח בין שתי הדיודות העליונות לשתי הדיודות התחתונות, כמו גם ההבדל במתח בין שתי הדיודות בצד שמאל וימין של הגלאי הוא אפס. לאחר מכן עצב את קוטר קרן המשאבה, פלט של 355 ננומטר של לייזר ND YAG. באמצעות חור סיכה של שלושה מילימטר הממוקם בין 2 מראות לייזר של 355 ננומטר מפיצים את קרן המשאבה דרך מרכז הבט

חשוב ששתי קרני הלייזר יתפשטו דרך מרכז התא האופטי בצורה כמעט קולינית. כדי להשיג זווית סטייה מדידה ובכך משרעת גבוהה של סטיית אלומה פוטותרמית או אות PBD, השתמש בתרכובת ייחוס כדי ליישר את הגשושית ואת אלומת המשאבה כדי להשיג אות PBD משביע רצון המאופיין ביחס אות לרעש טוב ומשרעת PBD יציבה בטווחי זמן ארוכים יותר. לאחר מכן מקם את קרן המשאבה ביחס לקרן הבדיקה על ידי התאמה מצטברת של מראות הלייזר של 355 ננומטר.

מדוד את המשרעת של אות הייחוס PBD כהבדל בין שתי דיודות צילום עליונות ותחתונות בגלאי הרגיש למיקום. אות ה-PBD אמור להציג עלייה מהירה במשרעת בסולם זמן מהיר ולהישאר יציב בסולם הזמן של 100 אלפיות השנייה. בדוק את הליניאריות במשרעת האות PBD ביחס לאנרגיית החום המשתחררת על ידי מדידת התלות הליניארית של אות PBD בעוצמת לייזר העירור, ובמספר הנספגים של איינשטיין.

שמור על עוצמת הלייזר מתחת לכ-1000 מיקרו ג'אול כדי למנוע ספיגת ריבוי פוטונים. כמו כן, שמור על הספיגה של הדגימה או תרכובת הייחוס באורך גל עירור פחות מ-0.5 כדי למנוע ירידה בעוצמת קרן המשאבה. שלבים אלה יבטיחו ליניאריות של אות ה- PBD.

התחל במדידת עקבות ה-PBD. לצורך ההפניה, הנח את התמיסה של תרכובת הייחוס בתא קוורץ ומקם את התא במחזיק מבוקר הטמפרטורה. זהה את אות ה-PBD הייחוס כפונקציה של הטמפרטורה בטווח הטמפרטורות שבין 16 ל-35 מעלות צלזיוס עם תוספת טמפרטורה של שלוש מעלות צלזיוס.

עם כל שינוי טמפרטורה. בדוק את מיקום קרן הבדיקה בגלאי הרגיש למיקום והתאם מחדש את המיקום למרכז הגלאי. במידת הצורך, בדוק את הליניאריות של אות ה-PBD כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

לאחר מכן הנח את תמיסת הדגימה באותו תא אופטי המשמש לתרכובת הייחוס תוך שמירה על אותו כיוון של התא האופטי למדידת הייחוס. המשך לזהות את עקבות ה-PBD של הדגימה באותו טווח טמפרטורות כמו עבור הייחוס, ובדוק את הליניאריות של משרעת ה-PBD של הדגימה. קח את המשרעת של אות ה-PBD הייחוס כהבדל בין אות ה-pret trigger לאות PBD לאחר ההדק

באופן דומה, קבע את משרעת השלב המהיר והאיטי של אות ה-PBD לדוגמה. כדי לבטל את פרמטר תגובת המכשיר, קנה מידה של משרעת אות ה-PBD לדוגמה במשרעת אות ה-PBD. לצורך ההפניה, היחס בין אות הדגימה לאות הייחוס נותן משוואה שממנה ניתן לקבוע את שחרור החום לתמיסה ושינוי הנפח הלא תרמי הקשור לתגובה יזומה של צילום מהשיפוע והיירוט של העלילה של יחס המשרעת כפול אנרגיה לעומת המונח התלוי בטמפרטורה כדי לקבוע את נפח התגובה ושינוי האנתלפיה עבור סולם התהליך המהיר והאיטי, הנפח והאנטלפיה שנצפו משתנים לתפוקה הקוונטית המתאימה.

על פי המשוואות שנמצאות בפרוטוקול הטקסט, מנותחים המשרעות ואורך החיים של הצעדים הבודדים על ידי התאמת הנתונים לפונקציה תלוית הזמן המתארת את שינויי הנפח והאנטלפיה. המשרעת של הצעד המהיר תואמת את המשרעת של השלב המהיר של אות ה-PBD לדוגמה והמשרעת של השלב הבא תואמת את המשרעת של השלב האיטי של אות ה-PBD לדוגמה. עבור כל תהליך בודד מתלות הטמפרטורה של קבוע הקצב עבור תהליכים בודדים, ניתן לקבוע בקלות את פרמטרי אנטלפיית ההפעלה והאנטרופיה באמצעות עלילות IR.

דוגמה מייצגת של עקבות PBD לשחרור תמונות סידן מסידן DM nitro מוצגת כאן. השלב המהיר תואם את מחשוף הצילום של סידן DM ניטרו ושחרור סידן, ואילו השלב האיטי משקף את קשירת הסידן לכלוב הלא מצולם. עקבות ה- PBD לקשר הסידן לתחום הטרמינל C של חיישן הסידן העצבי במורד הזרם אנטגוניסט האלמנט הרגולטורי, הרגולטור או החלום מוצג כאן על דיסוציאציה של צילום סידן.

ליגנד ששוחרר בתמונה מתקשר לתחום הטרמינל C של החלום עם קבוע הזמן של 1.3 פלוס מינוס 0.3 מילישניות ב-20 מעלות צלזיוס מהתלות בטמפרטורה של קבוע הקצב הנצפה. מחסום ההפעלה לקשירת סידן לתחום הטרמינל C של החלום נקבע כ-9.2 פלוס או מינוס 0.4 קילו קלוריות למול. בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור למדוד עקבות PBD לדוגמה בתנאים זהים לאלה של ההפניה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד להכין דגימה, ליישר מכשור ולנתח נתונים כדי לקבל פרמטר תרמודינמי הניתן לשחזור.