שינויי קונפורמציה Submillisecond בחלבונים נפתר על ידי photothermal Beam הסטה

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לאפיין שינויים קונפורמציוניים הקשורים לקשירת ליגנד למתמירים של סידן בלוח זמנים של תת-מילישנייה. המעבר הקונפורמציוני בין החלבון במצב APO לחלבון קשור לסידן מופעל על ידי פילוט פוטוכימי של תרכובת סידן כלואה, calcium DM nitro, המוביל לשחרור פוטוכימי של סידן חופשי. השינוי הנלווה במקדם השבירה נמדד כהעתקה של קרן הגשש באמצעות גלאי רגיש למיקום בעל ארבעה ערוצים.

בשלב הבא, נמדדים עקומות סטיית קרן פוטו-תרמית כפונקציה של הטמפרטורה עבור הדגימה והביקורת כאחד. ניתוח משולב של עקומות סטיית קרן הפוטו מספק תובנה לגבי המנגנון של שינוי הקונפורמציה המושרה על ידי סידן במונחים של נפח התגובה ושינויים באנתלפיה. היתרון העיקרי של סטיית קרן פוטו-תרמית על פני שיטות קיימות, כגון top flow, הוא שטכניקה זו מאפשרת זיהוי סימולטני של שינויי נפח ואנטרופיה בסולם זמן של תתי-מילישנייה.

ההדגמה החזותית של טכניקה זו נחוצה, שכן יישור מדויק של המכשיר הוא קריטי לשחזור פרמטרים תרמודינמיים. את הפרוצדורה ידגים וולטר גונזאלס, סטודנט לתואר מתקדם מהמעבדה שלי. יש לבצע את הכנת הדגימה ואת כל פעולות הטיפול בדגימה בחדר חשוך כדי למנוע שחרור (uncaging) לא רצוי. בסרטון זה, השלבים מודגמים באור לצורכי צילום.

כדי להתחיל, המיסו DM Nitro בבופר HEPES בריכוז 50 millimolar עם 100 millimolar potassium chloride, pH 7.0, עד לריכוז סופי של 400 micromolar. הוסיפו calcium chloride מתמיסת מלאי 0.1 molar כדי להגיע ליחס הרצוי בין ריכוזי calcium ל-DN nitro. לאחר מכן, המיסו את תרכובת הייחוס potassium cyanide או sodium chromate באותו בופר.

בכל הנוגע לדגימה, עיינו בפרוטוקול הטקסט עבור תרשים של התצורה הניסויית הבסיסית להסטת קרן פוטו-תרמית. בעת הגדרת הניסוי, העבירו את קרן הבדיקה דרך מרכזה של תא, הממוקם במחזיק תאים בעל בקרת טמפרטורה. לאחר מכן, באמצעות חור סיכה (pinhole), כוון את קוטרה של קרן הבדיקה למטר אחד, והשתמשו במראה שנייה מאחורי הדגימה כדי למרכז את קרן הבדיקה במרכז הגלאש הרגיש למיקום (position sensitive detector).

מקדו את קרן התהודה (pro beam) למרכז הגלאי כך שההפרש במתח בין שתי הדיודות העליונות לשתי הדיודות התחתונות, וכן ההפרש במתח בין שתי הדיודות בצד שמאל ובצד ימין של הגלאי, יהיה אפס. לאחר מכן, הגדירו את קוטרה של קרן השאיבה, פלט של 355 ננומטר מלייזר ND YAG. באמצעות חור סיכה (pinhole) בעובי שלושה מילימטרים הממוקם בין שתי מראות לייזר של 355 ננומטר, העבירו את קרן השאיבה במקביל דרך מרכז ה-vete.

חשוב ששני קרני הלייזר יונחו דרך מרכז התא האופטי באופן כמעט קולינארי. כדי להשיג זווית סטייה מדידה, ובכך אמפליטודה גבוהה של אות סטיית קרן פוטו-תרמית (PBD), השתמש בתרכובת ייחוס כדי לכוון את קרני הבדיקה (probe) והדחיסה (pump) עד להשגת אות PBD משביע רצון, המאופיין ביחס אות-רעש טוב ובאמפליטודת PBD יציבה בפרקי זמן ארוכים יותר. לאחר מכן, מקם את קרן הדחיסה ביחס לקרן הבדיקה באמצעות כוונון הדרגתי של מראות הלייזר של 355 nanometer.

מדדו את האמפליטודה של אות הייחוס של ה-PBD כהפרש בין שני פוטודיודות עליונות ותחתונות בגלאי הרגיש למיקום. אות ה-PBD אמור להראות עלייה מהירה באמפליטודה בלוח זמנים מהיר ולהישאר יציב בלוח זמנים של 100 מילישניות. בדקו את הליניאריות באמפליטודה של אות ה-PBD ביחס לאנרגיית החום ששוחררה, על ידי מדידת התלות הליניארית של אות ה-PBD בעוצמת לייזר העירור ובמספר האיינשטיינים שנספגו.

שמרו על הספק הלייזר מתחת לכ-1000 micro joules כדי למנוע בליעה רב-פוטונית. כמו כן, שמרו על בליעות (absorbence) של הדגימה או של תרכובת הייחוס באורך גל העירור נמוכה מ-0.5 כדי למנוע ירידה בהספק קרן המשאבה. שלבים אלו יבטיחו ליניאריות של אות ה-PBD.

התחילו במדידת עקבות ה-PBD. עבור הרפרנס, הכניסו את התמיסה של תרכיב הרפרנס לתא קוורץ ומקמו את התא במחזיק בעל בקרת טמפרטורה. גלו את אות ה-PBD של הרפרנס כפונקציה של הטמפרטורה בטווח טמפרטורות שבין 16 ל-35 מעלות צלזיוס, במרווחי טמפרטורה של שלוש מעלות צלזיוס.

עם כל שינוי בטמפרטורה, יש לבדוק את מיקום קרן הבדיקה על הגלאי הרגיש למיקום ולהתאים מחדש את המיקום למרכז הגלאי. במידת הצורך, יש לבדוק את הליניאריות של אות ה-PBD כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

לאחר מכן, מקם את תמיסת הדגימה באותה תא אופטי שבו נעשה שימוש עבור התרכובת הייחוס, תוך שמירה על אותו כיוון של התא האופטי כפי שהיה במדידת הייחוס. המשך לגילוי עקומות ה-PBD של הדגימה באותו טווח טמפרטורות כפי שבוצע עבור הייחוס, ובדוק את הליניאריות של אמפליטוד ה-PBD של הדגימה. קבע את האמפליטודה של אות ה-PBD של הייחוס כהפרש בין אות ה-PBD שלפני הטריגר (pre-trigger) לאות ה-PBD שאחרי הטריגר (post-trigger).

בדרך דומה, קבעו את האמפליטודה של הפאזה המהירה והאיטית של אות ה-PBD של הדגימה. כדי לבטל את פרמטר התגובה של המכשיר, נרמלו את האמפליטודה של אות ה-PBD של הדגימה לפי האמפליטודה של אות ה-PBD. עבור הרפרנס, היחס בין אות הדגימה לאות הרפרנס מספק משוואה ממנה ניתן לקבוע את שחרור החום לתמיסה ואת השינוי בנפח הבלתי-תרמי הקשור לתגובה שיוותה פוטו-איניציאציה, וזאת על פי השיפוע והנקודה שבה הגרף חותך את הציר (intercept) של יחס האמפליטודות כשהוא מוכפל באנרגיה מול האיבר התלוי בטמפרטורה; כדי לקבוע את נפח התגובה ואת שינוי האנתלפיה עבור התהליך המהיר והאיטי, נרמלו את שינוי הנפח והאנתלפיה שנצפו לפי תבואת הקוונטום המתאימה.

בהתאם למשוואות המופיעות בפרוטוקול הטקסט, האמפליטודות וזמני החיים עבור השלבים הבודדים מנותחים על ידי התאמת הנתונים לפונקציה התלויה בזמן המתארת את השינויים בנפח ובאנתלפיה. האמפליטודה של השלב המהיר תואמת לאמפליטודה של הפאזה המיידית של אות ה-PBD של הדגימה, והאמפליטודה של השלב העוקב תואמת לאמפליטודה של הפאזה האיטית של אות ה-PBD של הדגימה. עבור כל תהליך בודד, ניתן לקבוע בקלות את פרמטרי האנתלפיה והאנטרופיה של ההפעלה באמצעות תרשימי IR, על סמך התלות בטמפרטורה של קבוע הקצב עבור תהליכים בודדים.

דוגמה מייצגת של עקומות PBD לשחרור פוטו-כימי של סידן מ-calcium DM nitro מוצגת כאן. הפאזה המהירה תואמת לפיצול הפוטו-כימי של calcium DM nitro ושחרור הסידן, בעוד שהפאזה האיטית משקפת קישור של סידן לכלוב שאינו פוטו-פעיל. עקומת ה-PBD עבור קישור הסידן לדומיין ה-C terminal של החיישן העצבי לסידן downstream regulatory element antagonist, regulator, or dream מוצגת כאן בעקבות דיסוציאציה פוטו-כימית של סידן.

ליגנד ששוחרר מפוטו נקשר לדומיין הקצה C של dream עם קבוע זמן של 1.3 פלוס או מינוס 0.3 milliseconds ב-20 °C, כפי שנבע מהתלות בטמפרטורה של קבוע הקצב הנצפה. מחסום ההפעלה לקשירת סידן לדומיין הקצה C של dream נקבע כ-9.2 פלוס או מינוס 0.4 kilo calories per mole. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור למדוד עקומות PBD של הדגימה תחת תנאים זהים לאלה של הרפרנס.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן הכנת הדגימה, כיול המכשירים וניתוח הנתונים כדי להשיג פרמטר תרמודינמי הניתן לשחזור.