ניתוח וידאומורפומטרי של Vasoconstriction ריאתי היפוקסי של עורקים תוך ריאתי באמצעות מוריס דיוק לחתוך פרוסות ריאות

המטרה הכללית של הליך זה היא לנתח כיווץ כלי דם ריאתיים תגובתי להיפוקסיה (hypoxic pulmonary vasoconstriction) של עורקים תוך-ריאתיים מקבילים בעלי קוטר פנימי של 20 עד 100 מיקרון. זאת מושג תחילה על ידי מילוי דרכי הנשימה של הריאות ב-agar בעל נקודת התכה נמוכה. השלב השני הוא שימוש בויברטום כדי לחתוך את הריאות המבודדות לפרוסות בעובי 200 מיקרון.

בשלב הבא, ה-aros מוסר מחתכי הריאה על ידי דגירה במדיום חם בטמפרטורה של 37 degrees Celsius, שבו מבעבע גז נורמוקסי. כך החתכים נעים באיטיות בנוזל. לאחר מכן, חתך ריאה בודד מועבר לתא סופרפוזיה עם זרימה רציפה (flow through superfusion chamber), ולאחריו מבוצע ניתוח וידאו-מורפומטרי של תגובתיות כלי הדם בעורק שנתחך לרוחב.

בסופו של דבר, מוערכים השינויים בשטח הלומן של כלי הדם בתגובה לטיפולים שונים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מיקרוסקופיה אינטרה-ויטלית של מיקרו-כלי דם סוב-פלוראליים ומדידת מתח וסקולרי בעורקים ריאתיים פרוקסימליים מבודדים, הוא שהיא מאפשרת ניתוח כמותי של תגובתיות ה-VA של עורקים אינטרה-פולמונריים בעלי קטרים שבין 20 ל-100 מיקרומטרים. את הפרוצדורה ידגימו אנה גולדנברג ושני טכנאים מהמעבדה זו.

מיד לאחר הריגת עכבר על ידי נקיעה של חוליות הצוואר, פתחו את חלל הבטן, הזיזו את לולאות המעיים הצידה וחתכו את כלי הדם הבטניים הגדולים כדי לאפשר דימום. לאחר מכן, השתמשו במספריים עדינים כדי לנקב את הסרעפת. פעולה זו גורמת לקריסת הריאות כתוצאה מחדירת אוויר לחלל הפלאורה.

המשיכו לחתוך כדי להפריד את הסרעפת מפתח בית החזה התחתון. כעת חתכו את הצלעות ואת השכמה באופן לטרלי. כדי להסיר את החלק הוונטרלי של כלוב הצלעות, הוציאו את הטימוס.

מלאו מזרק בבפרפוזיה בפר (perfusion buffer) חמים. לאחר מכן, חרצו חור קטן בחדר השמאלי של הלב. כווננו את קצב הזרימה של הבפרפוזיה בפר ובצעו פרפוזיה לאטית של כלי הדם הריאתיים דרך החדר הימני, עד שהריאות ייראו לבנות.

בשלב הבא, הסירו את בלוטות הרוק, את השרירים הקטנים ואת הרקמה החיבורית מהקנה. נתקו את הקנה מהרקמה החיבורית הסובבת אותו והחדירו פיסת חוט תפירה מכותנה בין הוושט לקנה לצורך ליגציה מאוחרת. לאחר מכן, השתמשו במספרי מיקרו כדי לחתוך חור קטן בחלק העליון של הקנה, בין שתי סמכונים (טבעות סחוס) סמוכים.

לאחר מילוי מזרק באגרוס (agros) בטמפרטורה של 37 °C, חם ובעל נקודת התכה נמוכה, חברו אותו לקנולה גמישה מפלסטיק ודחפו את הבוכנה באיטיות עד להוצאת האוויר מהקנולה. הכניסו את הקנולה לחור הקטן בקנה הנשימה וקבעו אותה בזהירות במקומה באמצעות חוט תפירה מכותנה. לאחר מכן, מלאו באיטיות את דרכי הנשימה באגרוס ובחנו את הריאות.

בתחילה, הריאה הימנית מתחילה להתרחב, ולאחריה הריאה השמאלית. לאחר 30 עד 40 שניות, המילוי מושלם ושתי הריאות מנופחות לנפח הדומה למצב in vivo, שהוא כ-1.2 עד 2.0 milliliters. בהתאם למגדר, לגיל ולמשקל, חשוב להזריק את תמיסת ה-egg rose במהירות מספקת כדי שלא תהפוך למוצקה מדי במהלך ההליך, אך לא במהירות שתגרום לנזק לריאות.

לאחר מילוי הריאות בו-זמנית, שלוף את הקנולה מפלסטיק וקשור את הקנה באמצעות חוט תפירה מכותנה כדי למנוע דליפה של ה-agros. לאחר מכן, חתוך את הקנה מעל לקשירה, וכדי לנתק את הריאות והלב כבלוק מהבית חזה, העבר את האיברים למסבנקר רינגר (Ringer buffer) קר מאוד כדי להקפיא את ה-agros, תהליך המתרחש תוך מספר דקות של המתנה. השתמש בדבק מהיר (super glue) כדי להדביק חתיכת פקק שמפניה למחזיק הדגימות של הוויברטור, שתשמש כמשענת לרקמת הריאה. לאחר שה-agros קפא, הפרד את אונוני הריאה הבודדים.

בשלב הבא, הדביקו בעזרת דבק מהיר (super glue) אונה אחת למחזיק הדגימות. כדי לקבל חתכים רוחביים של עורקי ה-intra asner הקטנים, קחו את האונה הקרניאלית של הריאה הימנית והדביקו אותה למחזיק כאשר שטח ההילום (hilum) פונה כלפי מטה; בעזרת מיקרוטום (vibratome) המצויד בלהב תער חדש, חתכו את אונת הריאה מהפריףריה לפרוסות בעובי 200 micron. כדי לקבל חתכים רוחביים של עורקי ה-pre aser הגדולים יותר, יישרו את ההילום של הריאה השמאלית עם פקק השמפניה והדביקו את האונה למחזיק באוריינטציה זו, ולאחר מכן חתכו מהפריףריה להסרת ה-aros.

העבירו את חתכי האיברים לכוס כימית מזכוכית הממולאת בכ-200 milliliters של MEM בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. הניחו את הכוס בתוך תנור חימום והזרים גז נורמוקסי, כך שחתכי הריאה יזוזו באיטיות בתוך המצע. לאחר כשעתיים, בועות האוויר שנלכדו ברקמת הריאה יסולקו, והחתכים ישקעו לתחתית הכוס.

לביצוע אנליזה מורפומטרית בווידאו של עורקים תוך-ריאתיים, העבירו נתח ריאה אחד לתא סופוזיציה בזרימה (flow through superfusion chamber), המורכב על מיקרוסקופ וממולא ב-1.2 milliliters של MEM מוחדר גזים תחת תנאי נורמוקסיה. קבעו את נתח הריאה לתחתית התא באמצעות חוטי ניילון המחוברים לטבעת פלטינה. התחילו בפרפוזיה של התא עם תווך מוחדר גזים תחת תנאי נורמוקסיה.

השתמשו במיקרוסקופ ניגודיות פאזה עם עדשה אובייקטיבית 10x כדי לסרוק את חתך הריאה בחיפוש אחר עורקים בחתך רוחב בעלי קטרים פנימיים שבין 20 ל-100 מיקרון. לאחר איתור כלי דם מתאים, השתמשו בעדשה אובייקטיבית 20x כדי לצלם כלי דם טרום-asner או, כפי שמוצג כאן, בעדשה אובייקטיבית 40x כדי לצלם עורק intra asner לצורך מדידת הקוטר הפנימי של כלי הדם. לפני תחילת הניסוי, הגדירו את התוכנה ללקיחת תמונות של העורק בחתך הרוחב בכל דקה לאורך כל הניסוי.

לאחר הפעלת הצילום, המשיכו בפרפוזיה של התא עם מצע גסט נורמוקסי למשך 10 דקות. לאחר מכן, השריו את חתך הריאה ב-U 466 19 למשך 10 דקות ללא זרימה, כדי לנתח את כושר התכווצות העורקי באמצעות כלי דם ששטח הלומן שלהם הצטמצם בלפחות 30% בעקבות ה-U 466 19. שטפו את התרופה באמצעות מצע גסט נורמוקסי למשך 10 דקות.

לאחר מכן, הרחבו את העורק באמצעות יישום של res למשך 10 דקות ללא זרימה. שוב, הסירו את התרופה באמצעות שטיפה של 10 דקות עם מדיום מוגז נורמוקסי (normoxic) בקצב זרימה של six milliliters per minute, ולאחר מכן למשך 10 דקות בזרימה של 0.7 milliliters per minute. לאחר מכן, דגרו את פרוסת הריאה עם מדיום מוגז היפוקסי גבוה למשך 40 דקות.

זרימו תבליט של תערובת גז היפוקסית למרחב האוויר של תא הפרפוזיה באמצעות סט צינורות נוסף. הסירו את המצע ההיפוקסי באמצעות שטיפה של 20 דקות עם מצע המוגז בנורמוקסיה, והעבירו מזרימת גז היפוקסית לזרימת גז נורמוקסי למרחב האוויר של התא כדי לבדוק את חיוניות כלי הדם. בסיום הניסוי, הוסיפו U 466 19 לתא הפרפוזיה והדגירו למשך 20 דקות ללא זרימה כדי להשרות כיווץ כלי דם (vasoconstriction).

חזרו על שלבים אלו עם נתח ריאה טרי כדי למדוד תגובתיות כלי דם (vaso reactivity) של כלי דם אחר. התחילו את הניתוח על ידי טעינת התמונות של העורקים שנחתכו בחתך רוחבי לתוכנה לניתוח תמונות. לאחר מכן, השתמשו בסמן כדי להקיף את שטח הלומן של כלי הדם.

ייבוש הידיים נחוץ כדי למנוע ארטיפקטים הנובעים, למשל, מתאי דם הדבקים לדופן כלי הדם. המשיכו לנתח את תמונות החתך באותו אופן. יש לנתח כל תמונה כאשר תנאי אחד בתא האינקובציה בזרימה משתנה לתנאי אחר, אך ניתוח של כל תמונה שנייה מספיק כאשר התנאים אינם משתנים.

ניתן להבחין בכיווץ כלי דם ריאתי תגובתי להיפוקסיה (Hypoxic pulmonary vasoconstriction) בתמונות ניגוד מופע אלו של חתך רוחבי של עורק pre ASIN, העובר בסמיכות רבה לחתך רוחבי של סימפונית (bronchus). התמונות צולמו בנקודות זמן המסומנות בעיגולים בגרף: בתחילת המדידה, בסוף המדידה עם U 466 19, בסוף החשיפה ל-RAs, לאחר 30 או 40 דקות במצע גזי היפוקסי, לאחר שטיפה עם מצע גזי נורמוקסי, ולאחר היישום הסופי של U 466 19. תגובתיות כלי הדם נרשמה כשינויים יחסיים בשטח הלומן של העורק בחתך הרוחבי לעומת זמן. השטח בתחילת הניסוי הוגדר כ-100%, והכיווץ כלי הדם ניתן כערכים יחסיים לשטח הראשוני.

במקרה זה, חשיפה להיפוקסיה גורמת להפחתה של 60% בשטח הלומן כדי להציג את התגובה ההיפוקסית באופן ברור יותר. השלב הראשוני של הניסוי, שבו נבדקה התגובתיות הכלית, אינו מוצג כאן, והערך שהתקבל מיד לפני החשיפה לרמות חמצן מופחתות נקבע כ-100%. סוג הכלי הדם הנוסף שנבדק במחקרים אלו הוא העורקים בתוך ה-ASIN, הממוקמים בחיבורי מחיצות אלבולריות. במערכת ניסויים זו, נותח למטרה זו השפעת sidal, פותח לא סלקטיבי של ערוצי אשלגן רגישים ל-ATP מיטוכונדריאליים, על כיווץ כלי דם ריאתי היפוקסי של עורקים קטנים בתוך ה-ASIN.

פרוסות מושקעות במצע היפוקסי. בהיעדר או בנוכחות 50 micromolar sidal, מבוצעות הדגמות בקרה במצע gast נורמוקסי להצגה ברורה יותר של התגובה לנורמוקסיה, להיפוקסיה או להיפוקסיה בתוספת sidal. הערכים שהתקבלו רגע לפני החשיפה למצע gast נורמוקסי או היפוקסי נקבעים כ-100%. העורק שנחשף ל-pineal אינו מראה ירידה בשטח, בניגוד לעורק שהושקה במצע היפוקסי ללא תוספים.

במצע נורמוקסי, לא ניתן לזהות שינויים בשטח הלומן. ההקלטות של עורקים קטנים בתוך ה-ASIN שנחשפו למצע גסט היפוקסי עם או בלי 50 µM sidal מוצגות כממוצעים פלוס או מינוס SEM. בגרף זה, מוצגים הנתונים היחסיים ביחס לערך בתחילת האינקובציה ההיפוקסית.

לא ניתן לזהות תגובתיות של כלי דם. בפרוסות ריאה שנחשפו לגז היפוקסי, מדיום המכיל כיווץ כלי דם בבלוטת האצטרובל שנוצר על ידי U 466 19 אינו מושפע מהתרופה. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה כיצד להכין דיוק מראה, לחתוך פרוסות ריאה, וכיצד להשתמש בהן למדידה כמותית של תגובתיות כלי דם בעורקים תוך-אלביולריים קטנים בעלי קטריים שבין 20 ל-40 µm, הממוקמים בבסיס המחיצות האלביולריות, ושל עורקים פרה-אלביולריים גדולים יותר בעלי קטריים שבין 40 ל-100 µm, העוברים בסמוך לסמפונות ולסימפונות.