בידוד של טיפות שומנים נייד: שתי טכניקות טיהור החל מתאי שמרים ושליות אדם

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד טיפות ליפידים מרקמה. הדבר מבוצע תחילה על ידי ניתוח והפרדה של רקמת שליה. לאחר מכן, תאי האוליאין עוברים הומוגניזציה.

לאחר מכן, האורגנלות מופרדות באמצעות מספר שלבי צנטריפוגה. לבסוף, השכבה הצפה המכילה את טיפות הליפידים נאספת וטיפות הליפידים מאופיינות. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ובניתוח western blot כדי להראות את רמת הטוהר של פרקציית טיפות הליפידים.

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא האפשרות לבודד טיפות ליפידים ממרבית תאי האורטה. שימו לב כי ברקמות מסוימות, מספר הטיפות עשוי להיות נמוך יותר, מה שיקטין את שכבת הציפה G ואת מספר הטיפות. שליות נאספו מנשים בריאות עם הריונות של עובר יחיד שעברו ניתוח קיסרי מתוכנן לפני תחילת לידה ספונטנית במועד; הנבדקות נתנו הסכמה מודעת בכתב לאסוף את השליה שלהן.

איסוף השליות והשימוש בהן לאחר מכן בוצעו באישור של אוניברסיטת טנסי ובית הספר לרפואה של אוניברסיטת טנסי בנוקסוויל. ועדת ביקורת מוסדית במכסה ביולוגית בטוחה, העבירו את השליה למכל סטרילי הניתן לעקרה באוטוקלב ושטפו בזהירות דם מהשליה ומהקרומים באמצעות תמיסת סלין סטרילית. השליכו את הסלין המזוהם בדם לכלי קיבול של ליטר אחד כפסולת ביולוגית נוזלית.

הניחו את השילייה על שטח סטרילי כאשר הצד החלק שבו נמצא השפופת הטבורית פונה כלפי מעלה, והשתמשו במספריים בעלות קצה דק וחד ובפינצטה. הסירו את השפופת הטבורית ואת קרומי העובריים. לאחר מכן, הפכו את השילייה כך שהצד האמי (maternal surface) פונה כלפי מעלה.

לאחר מכן, הסר את רקמת לוח הבסיס העליונה בערך שלושה מילימטרים מהפנימה. בצע דיסקציה של וריד מוביל (COTA leadin) אחד בכל פעם, תוך הימנעות מנגיעה בלוח הכוריון, ואסוף את רקמת השלייה לכוס כימית בנפח 250 milliliters עם תמיסת סליין. לאחר מכן, השתמש ב-0.9% sterile saline ובפינצטה כדי לשטוף את הרקמה מספר פעמים בכוס כימית נפרדת על ידי סיבוב, תוך שימוש בכוס כימית בנפח one liter לפסולת נוזלית.

העבירו כל פעם רכיב מוביל אחד לצלח פטרי בקוטר 150 מילימטר. החזיקו את הרכיב בעזרת פינצטה והשתמשו בלהב תער כדי לגרד את הרקמה מהכלי אל תוך צלח הפטרי. העבירו את הרקמה שנגרדה לכלי חשיפה נפרד המכיל 0.9% sterile saline.

חזרו על הפעולה עבור כל חתיכות הרקמה. לאחר שטיפת הרקמה שגורדה ב-cell dissociation cve, נקזו את עודפי הנוזל ושקלו אותה לצורך עיכול רקמת השילייה. לאחר הכנת תערובת עיכול הרקמה, חלקו את הרקמה על ידי העברה של 60 גרם מכלל הרקמה שנאספה לבקבוק Helen Meyer סטרילי בנפח 500 מיליליטר.

הוסיפו את תערובת עיכול הרקמה לבקבוק המכיל את הרקמה והדגירו בטמפרטורה של 37 °C בתוך שייקר למשך 45 דקות. ב-150 RPM כדי לאסוף את התאים המופרדים לאחר ההדגרה, תוך הטיה של הבקבוק כדי לאפשר לרקמה לשקוע. אספו את הנוזל העליון (supernatant).

הקפידו שלא לאסוף רקמה שאינה מפורקת (UND). הוסיפו כמות שווה של HBSS לסביבון לפני ההעברה למבחנות צנטריפוגה סטריליות של 15 מיליליטר. חזרו על תהליך הפירוק ואיסוף הסביבון עבור שאר חלקי הרקמה המקושרת ל-UND עבור כל סדרה, לאחר צנטריפוגה של 1000 פעמים.

סנטריפוגה במשך 15 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס ושאיפה של הנוזל העליון מבלי להפריע למשקע. תאי השעירים של השליה נמצאים בעיקר בחלק הלבן של המשקע שמעל תאי הדם האדומים. העבר את תאי השעירים בחלק הלבן של המשקע למבחנת צנטריפוגה קונית סטרילית בנפח 50 מיליליטר ושמור על קרח.

לאחר איסוף התאים מכל שלושת שלבי העיכול, השתמשו במסנן תאים מניילון של 100 מיקרון, המוחדר לראשו של מבחנה צנטריפוגית קונית סטרילית בנפח 50 מיליליטר, כדי לסנן את התוך תלוי. אם קצב הסינון של תוך התאים מואט, הרימו את המסנן כלפי מעלה כדי ליצור ואקום בתוך המבחנה; צנטריפוגו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס ובעוצמה של 1000 times gravity למשך 10 דקות. הסירו בזהירות את הנוזל העליון מבלי להפריע למשקע כדי להומוגניзировать תאי שליה (placental villus cells) תחת מ 빠르게 מabilis מapay biological safety hood, תוך שימוש במדיום ליזיס היפוטוני שהוכן טרי או HLM; הוסיפו לתאים HLM קר מאוד בנפח של פי ארבעה מנפח משקע התאים.

השתמשו בפיפט של 10 מיליליטר כדי לסספנד את התאים בעדינות וביסודיות. סספנדו את התאים על ידי שאיבה והנפקה חוזרת (pipetting up and down). לאחר הדגרה של התאים על קרח למשך 10 דקות, העבירו אותם להומוגניזר קר על קרח והומוגניזו את התאים באיטיות באמצעות המכתש בעל ההתאמה הרפויה, תוך ביצוע 20 עד 25 תנועות עדינות.

סובבו את הליזאט במהירות של 3000 ×g ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להסיר תאים שלא נפרקו. לאחר מכן, אספו את העילאי למבחנה חדשה לפני סיבוב נוסף במהירות של 25,000 ×g ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. כדי להסיר את המיטוכונדריה ולבודד את טיפות הליפידים באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה, אספו את העילאי למבחנת צנטריפוגה של 50 מיליליטר.

יש להתאים את הריכוז ל-20% sucrose ולהעביר לתחתית של מבחנת אולטרה-צנטריפוגה עבור רוטור S SW 28 או מקביל לו. מעל הנוזל העליון שדנסיטתו הותאמה, יש להוסיף כ-10 milliliters של באפר sodium carbonate בריכוז 100 millimolar קר מאוד, ו-0.5 עד 1 milliliter של HLM קר מאוד כדי למלא את המבחנה. יש לסבב בצנטריפוגה עם רוטור S SW 28 מסוג swinging bucket ב-130,000 ×g ובטמפרטורה של 4 °C למשך 45 דקות. לאחר מכן, יש לאסוף את השכבה הצפה, להתאים את הריכוז ל-10% sucrose ולהעביר אותה לתחתית של מבחנת אולטרה-צנטריפוגה בנפח 13.2 milliliter עבור רוטור SW 41 TI או מקביל לו. מעל הנוזל העליון שדנסיטתו הותאמה, יש להוסיף כ-5 milliliters של באפר sodium carbonate בריכוז 100 millimolar קר מאוד ו-0.5 milliliters של HLM קר מאוד. לאחר סבוב בצנטריפוגה ב-274,000 ×g ובטמפרטורה של 4 °C למשך 60 דקות, יש להשתמש בפיפטה של 1 milliliter ברוטור SW 41 TI כדי לאסוף בזהירות את השכבה הצפה העליונה המכילה טיפות ליפידים.

כווננו את הנפח ל-10% sucrose והעברנו שוב לנבובת אולטרצנטריפוגה בנפח 13.2 milliliter לפני הוספת שכבה עליונה של 5 milliliter של sodium carbonate buffer בריכוז 100 millimolar קר בקרח ו-0.5 milliliter של HLM קר בקרח. לאחר צנטריפוגה למשך 30 דקות, השתמשנו בפיפטת PE כפופה כדי לאסוף בזהירות את השכבה העליונה הלבנה הצפה המכילה את טיפות הליפידים לשלוש נבובות בנפח 1.5 milliliter המכילות 100 microliters של HLM. אפיינו את טיפות הליפידים בהתאם לפרוטוקול הכתוב כפי שמוצג בדמות זו; נוכחותן של טיפות ליפידים שבודדו מתאי של placenta villus אנושיים אוששה על ידי צביעה בצבע פלואורסצנטי ספציפי לליפידים ניטרליים boda P 4 93 5 0 3 והדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

כאן מוצג הערכת טוהרן של פראקציות טיפות השומן המבודדות באמצעות Western blotting עם חלבוני סימון עבור טיפות שומן, שכללו perilipin 2, calnexin עבור ה-ER, הסמן GOI, GM130, COX IV עבור מיטוכונדריה וממברנת הפלזמה, ו-MEK1. לאחר פירוק של טיפות השומן באמצעות אצטון קר והפקת החלבונים, הפראקציות הועברו ל-Western blotting עבור perilipin.

שנית, חלבון טיפות הליפידים זוהה בעל-נתיב של העמלקן הגרעיני (post nuclear supernatant) ובשכבה הצפה הלבנה המבודדת המכילה טיפות ליפידים. חלבונים ספציפיים לממברנות הפלזמה, כגון MK one ו-GM one 30, לא זוהו בפרקציות טיפות הליפידים באף אחת מהשכבות מתחת לשכבה הצפה עבור spin four ו-spin five. כפי שדווח בעבר, החלבון calnexin וצביעה חלשה של חלבון ממברנת המיטוכונדריה CO X four זוהו במקומות אחרים בפרקציית טיפות הליפידים.

תוצאות אלו עקביות עם דיווחים קודמים המראים כי טיפות ליפידים מקיימות אינטראקציה עם מיטוכונדריה בתאי יונקים ועם ה-ER. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון שיטות פרוטאומיות וליפידומיות, כדי לבחון שאלות נוספות, כגון אילו גורמים קשורים לטיפות.