בידוד של טיפות שומנים נייד: שתי טכניקות טיהור החל מתאי שמרים ושליות אדם

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד טיפות שומנים מהרקמה. זה מושג על ידי ניתוח והפרדה ראשונית של רקמת השליה. לאחר מכן, תאי האולאין הומוגניים.

ואז האברונים מופרדים על ידי מספר שלבי צנטריפוגה. לבסוף, נאספת השכבה הצפה המכילה את טיפות השומנים ומאפיינים את טיפות השומנים. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וניתוח דם מערבי משמשים כדי להראות את טוהר שבר טיפות השומנים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבודד טיפות שומנים מרוב תאי אבי העורקים. שימו לב שברקמות מסוימות, מספר הטיפות יכול להיות נמוך מאלה שמפחיתים את שכבת ה-G הצפה ואת מספר הטיפות. השליות נאספו מנשים בריאות עם הריון יחיד שעברו ניתוח קיסרי אלקטיבי לפני תחילת הלידה הספונטנית במועד, הנבדקים נתנו הסכמה מדעת בכתב לאיסוף השליה שלהם.

האיסוף והשימוש לאחר מכן בשליה בוצעו באישור אוניברסיטת טנסי ובית הספר לרפואה של אוניברסיטת טנסי בנוקסוויל. ועדת ביקורת מוסדית במכסה המנוע הביולוגי, העבירו את השליה למיכל סטרילי הניתן לחיטוי ושטפו בזהירות דם מהשליה והממברנות באמצעות מי מלח סטריליים. השליכו את מי המלח המדממים בכוס של ליטר אחד כפסולת ביולוגית נוזלית.

הנח את השליה על שדה סטרילי כאשר משטח חלק זה הנושא את חבל הטבור פונה כלפי מעלה עם מספריים ומלקחיים חדים ועדינים. הסר את חבל הטבור ואת קרומי העובר. לאחר מכן, הפוך את השליה כך שהמשטח האימהי פונה כלפי מעלה.

לאחר מכן הסר את רקמת צלחת הבסיס המכסה כשלושה מילימטרים מפני השטח. נתח עופרת COTA אחת בכל פעם, הימנע מהצלחת הכוריונית, ואסוף את רקמת הווילוס לכוס של 250 מיליליטר עם מי מלח. לאחר מכן השתמש במי מלח סטריליים של 0.9% ומלקחיים כדי לשטוף את הרקמה מספר פעמים בכוס נפרדת על ידי מערבולת באמצעות ליטר אחד לפסולת נוזלית.

מעבירים עופרת קודי אחת בכל פעם לצלחת פטרי של 150 מילימטר. החזיקו בעזרת מלקחיים והשתמשו בסכין גילוח כדי לגרד את הרקמה מהכלים על צלחת פטרי. מניחים את הרקמה המגורדת בכוס נפרדת המכילה 0.9% מי מלח סטריליים.

חזור על הפעולה עבור כל חלקי הרקמה. לאחר שטיפת הרקמה המגורדת ב-cve דיסוציאציה של תאים, יש לנקז אותה מעודפי נוזלים ומשקל כדי לעכל את רקמת השליה. לאחר הכנת תערובת עיכול הרקמות, חלקו את הרקמה והעבירו 60 גרם מסך הרקמה שנאספה לבקבוק הלן מאייר סטרילי של 500 מיליליטר.

מוסיפים את תערובת עיכול הרקמות לבקבוק המכיל את הרקמה ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס בשייקר למשך 45 דקות. ב-150 סל"ד לאסוף את התאים המנותקים לאחר הדגירה ולהטות את הבקבוק כדי לאפשר לרקמה להתייצב. אוספים את הסופר נאטין.

הקפדה לא לאסוף רקמות מנותקות של UND. הוסף כמות שווה של HBSS לסופרנטנט לפני העברתו לצינורות צנטריפוגה סטריליים של 15 מיליליטר. חזור על איסוף הדיסוציאציה והסופרנטנט עם החלקים הנותרים של הרקמה הקשורה ל-UND עבור כל אצווה לאחר צנטריפוגה פי 1000.

כוח הכבידה למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס שואב את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור. תאי סיסי השליה נמצאים בעיקר בחלק הלבן של הגלולה המכסה את כדוריות הדם האדומות. העבירו את תאי הווילוס בחלק הלבן של הגלולה לצינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי של 50 מיליליטר והמשיכו על קרח.

לאחר איסוף התאים מכל שלושת שלבי העיכול, השתמש במסננת תאי ניילון של 100 מיקרון המוחדרת בחלק העליון של צינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי של 50 מיליליטר כדי לסנן את המתלה. אם הסינון של מתלה התא מאט, הרם כלפי מעלה על המסנן כדי לשאוב ואקום בתוך צנטריפוגת הצינור בארבע מעלות צלזיוס ופי 1000 מכוח הכבידה למשך 10 דקות. הסר בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה כדי להומוגניזציה של תאי סיסי שליה באמצעות מדיום ליזה היפוטוני טרי שהוכן או HLM במכסה בטיחות ביולוגי, הוסף פי ארבעה מנפח כדורי התא של HLM קר כקרח לתאים.

השתמש בפיפטה של 10 מיליליטר כדי להחיות בעדינות וביסודיות. תלו את התאים על ידי פיפטינג שלהם למעלה ולמטה. לאחר דגירה של התאים על קרח במשך 10 דקות, העבירו אותם להומוגניזטור קר כקרח והפכו את התאים לאט לאט להומוגניזציה עם העלי הרופף על ידי מריחת 20 עד 25 משיכות עדינות.

סובב את הליזאט בכוח הכבידה פי 3000 וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להסיר תאים לא שבורים. לאחר מכן אספו את הסופרנטנט לתוך צינור חדש לפני שתסתובבו שוב בכוח הכבידה פי 25,000 וארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. כדי להסיר את המיטוכונדריה כדי לבודד את טיפות השומנים על ידי אולטרה-צנטריפוגה, אספו את הסופר נאטין בצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר.

התאם ל-20% סוכרוז והעביר לתחתית צינור אולטרה-צנטריפוגה עבור רוטור S SW 28 או שווה ערך לכסות את הסופר נאטין המותאם לצפיפות עם כ-10 מיליליטר קר כקרח, מאגר נתרן פחמתי של 100 מילי-מולרי ו-0.5 עד מיליליטר אחד של HLM קר כקרח כדי למלא את הצינור באמצעות צנטריפוגת רוטור דלי מתנדנדת S SW 28 ב-130, פי 000 מכוח הכבידה וארבע מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. לאחר מכן אסוף את השכבה הצפה, התאם ל-10% סוכרוז והעביר אותה לתחתית צינור אולטרה-צנטריפוגה של 13.2 מיליליטר עבור רוטור SW 41 TI או שווה ערך על הסופרנטנט המותאם לצפיפות עם כחמישה מיליליטר של קור קרח, 100 מילי-מולרי נתרן פחמתי מאגר ו-0.5 מיליליטר HLM קר כקרח לאחר צנטריפוגה ב-274, פי 000 כוח משיכה וארבע מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. ברוטור SW 41 TI, השתמש בפיפטה של מיליליטר אחד כדי לאסוף בזהירות את השכבה הצפה העליונה המכילה טיפות שומנים.

כוונן את עוצמת הקול ל-10% סוכרוז והעביר שוב לצינור אולטרה-צנטריפוגה של 13.2 מיליליטר לפני כיסוי של חמישה מיליליטר קר כקרח, מאגר נתרן פחמתי 100 מילי-מולרי ו-0.5 מיליליטר HLM קר כקרח. לאחר צנטריפוגה למשך 30 דקות, השתמש בפיפטה PE כפופה כדי לאסוף בזהירות את השכבה הצפה העליונה בצבע לבן המכילה את טיפות השומנים לשלושה צינורות של 1.5 מיליליטר המכילים 100 מיקרוליטר של HLM. אפיינו את טיפות השומנים על פי פרוטוקול הטקסט כפי שניתן לראות באיור זה, נוכחותן של טיפות שומן מבודדות מתאי סיסי שליה אנושיים אומתה על ידי צביעה בצבע פלואורסצנטי ספציפי לשומן ניטרלי בודה P 4 93 5 0 3 והודגמה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

מוצג כאן, הטוהר של שברי טיפות השומן המבודדים הוערך על ידי כתמים מערביים עם חלבוני סמן לטיפות שומנים שכללו פרה ליפין שני קלנקסין עבור ה-er, סמן ה-goi, GM אחד 30 CO X ארבע עבור המיטוכונדריה וממברנת הפלזמה, MEK אחד. לאחר התפוררות, טיפות השומן עם אצטון קר והחלבונים מופקים. השברים היו נתונים ל-Western Blotting para lipin.

שנית, חלבון טיפת השומן זוהה בסופרנטנט פוסט-גרעיני ובשכבה הצפה הלבנה המבודדת המכילה טיפות שומנים. חלבונים ספציפיים לממברנות פלזמה כגון MK one ו-GM one 30 לא זוהו בשברי טיפות שומן באף אחת מהשכבות מתחת לשכבה הצפה עבור ספין ארבע וספין חמש. כפי שדווח בעבר, החלבון קלנקסין וצביעה חלשה של חלבון הממברנה המיטוכונדריאלית CO X 4 זוהו במקום אחר בשבר טיפות השומן.

תוצאות אלה עולות בקנה אחד עם דיווחים קודמים המראים כי טיפות שומן מקיימות אינטראקציה עם מיטוכונדריה בתאי יונקים ועם ה-ER r. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו שיטות פרוטאומיות וליפידומיות כדי לחקור שאלות נוספות כמו אילו גורמים קשורים לטיפות.