הזרקת בלוטות תוך-לימפתיות של חלקיקי פולימר מתכלים

המטרה הכללית של הליך זה היא להטמיע חלקיקי חיסון מחומר ביולוגי בתוך קשרי לימפה באמצעות טכניקת הזרקה ישירה. ראשית, סנתזו את חלקיקי הפולימר המיוצבים בליפידים באמצעות שיטת אמולסיה כפולה. לאחר מכן, שטפו את החלקיקים ומדדו את תכונות החומר, כגון גודל, מטען, טעינה או יציבות.

בשלב הבא, הזרק צבע מעקב (tracer dye) לבסיס הזנב של העכבר כדי לאפשר ויזואליזציה לאחר ניקוז הצבע אל הקשרית הלימפה. השלב האחרון הוא זיהוי הקשרית הלימפה המסומנת ב-D והזרקת נפח קטן של חלקיקי פולימר במיקום זה. ניתן להשתמש בהיסטולוגיה, אימונופלואורסצנציה ומיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לאשש את נוכחותם ואת פיזורם של החלקיקים בקשריות הלימפה המפשריות (inguinal lymph nodes).

שילוב של הזרקה ישירה לקשריים לימפה יחד עם ביו-חומרים לצורך חיסון מאפשר שליטה הדוקה על השילובים והמנות של רכיבי החיסון במיקרו-סביבה של הקשר הלימפתי, ומאפשר שחרור מבוקר של המטען ברקמות אלו. כל החיסונים חייבים להגיע לקשריים לימפה כדי להיות יעילים. לכן, הגדרה של האופן שבו ביו-חומרים ואותים חיסוניים משולבים משפיעים על השיגנול המקומי בקשר הלימפתי היא חשובה כדי לקשר אירועים אלו לתגובה חיסונית סיסטמית.

ידע זה יעזור לנו להבין טוב יותר כיצד פועלים חיסונים מבוססי חומרים ביומטריים הניתנים בנתיבים המסורתיים. למרות שהגשה של חומרים ביומטריים ישירות אל קשרי הלימפה משמשת ככלי למחקר השפעותיהם של חומרים ביומטריים על ארגון קשרי הלימפה, פלטפורמה זו מספקת גם הזדמנות יישומית לפיתוח חיסונים טיפוליים ואימונותרפיות חדשות המיועדות לסרטן ולהפרעות אוטואימוניות. עבור מיקרו-חלקיקים, יש לבצע סוניקציה לפזה האורגנית המכילה את הפולימר, הליפיד ומטען אחר שאינו ממיס במים, על קרח בהספק של 12 watts.

כדי ליצור את אמולסיית המים והשמן, יש להוסיף 500 µL של H2O מזוקק או H2O המכיל 1 mg של חלבון פפטיד או מטען אחר מסיס במים. המשיכו לערבב במשך 30 שניות. נערו בעדינות את הבקבוקון למעלה ולמטה ומצד לצד סביב קצה הסטירר כדי להבטיח אמולסיפיקציה מלאה.

כעת הכין את ת emulsion של מים ושמן במים על ידי מזיגת ת emulsion של מים ושמן לתוך 40 milliliters של H2O והומוגן במשך שלוש דקות במהירות של 16,000 RPM. לאחר מכן, הוסף מגנט Stir bar וערבב את ת emulsion של המים והשמן במים למשך הלילה כדי להסיר את השאריות של הממס לאחר הסרת הממס במהלך הלילה. מזוג את ת emulsion דרך מסננת רשת ניילון של 40 micron לתוך מבחנה קונית של 50 milliliter בצנטריפוגה למשך חמש דקות, שאף את הנוזל העליון (supernatant), השהה שוב את משקע החלקיקים ב-one milliliter של מים והעבר את החלקיקים המושחים למבחנת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 milliliter.

אסוף את החלקיקים באמצעות צנטריפוגציה למשך חמש דקות. מדוד את גודל החלקיקים באמצעות דיפרקציית לייזר או פיזור אור. ודא שנפח המים שהוספו לתא השברים הוא ברמה מספקת לצורך יישור וכיול (blanking). טפטף 10 µL של תרחיף חלקיקים אל תוך תא השברים.

סגור את דלת תא מנתח גודל החלקיקים. לאחר מכן, מדוד את גודל החלקיקים עבור PLGA. השתמש במקדם שבירה של 1.60.

השתמשו בממשק התוכנה כדי לחשב את קוטר החלקיקים על בסיס מספר יום אחד לפני ההזרקה. הרדימו את העכבר בהתאם לפרוטוקול בעלי חיים מאושר על ידי iacuc. העריכו את עומק ההרדמה באמצעות תגובת בהונות.

בצעו בדיקת רפלקס צביטה ועקבו אחר הנשימה כדי להבטיח קצב נשימה של 100 עד 120 נשימות לדקה. גדלו את הפרווה בבסיס הזנב ובשוק האחורית. הסירו את הפרווה מהצד הבטני של בעל החיים ובצורה לטראלית עד לצד הגבי, מעל למפרק הרגל האחורית.

עבור כל הזרקה של צבע, השתמשו במיקרופיפית כדי להעביר 10 µL של תמיסת צבע לשפרונגת מיקרוצנטריפוגה, ושאבו את כל ה-10 µL דרך מחט במידה 31 לתוך מזרק אינסולין של 1 mL. כעת, הגזירותו 10 µL של תמיסת צבע תת-עורית בכל צד של בסיס הזנב לצורך טעינה בין ההזרקות. מרחו קרם להסרת שיער עדין כדי להסיר את השיער שנותר.

יש לוודא שמרחתם את החומר באזור שבין הרגל האחורית לבטן. לאחר שלוש דקות, השתמשו ביד עטויה בכפפה רטובה עם H₂O חמימה ושפשפו בעדינות את קרם הדיפילציה אל תוך העור. חזרו על הפעולה מיד כדי להסיר את שאריות קרם הדיפילציה.

בשלב הבא, הרטב מטלית רכה או נייר סופג במים חמימים ובבתנועה אחת נגב את חלקו התחתון של העכבר. הנח את העכבר תחת מנורת חימום להתאוששות ולאחר מכן החזר אותו לכלוב למשך 12 שעות לפחות. בדוק את העכבר המורדם כדי לוודא את ניקוז הסימן או הצבע לתוך כל קשרית לימפה מפשעתית.

הבלוטה הלימפטית צריכה להיראות כנקודה כהה ליד הירך האחורית והבטן. כעת יש לתלוש מחדש את החלקיקים במים מזוקקים בריכוז ההזרקה הרצוי עבור כל הזרקה. השתמש במיקרופיפט כדי להעביר 10 µL מתמיסת החלקיקים לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה.

שאבו את כל 10 µL לתוך מחט אינסולין בכישה 31 המחוברת למזרק של 1 mL. מתוחו את העור סביב קשרי הלימפה הצבוע כאשר המחט ניצבת בזווית של 90 מעלות לעור. חדרו את העור לעומק של 1 mm.

הזריקו לאט את כל הנפח תוך מעקב אחר הגדלה נראית לעין של קשרי הלימפה. אפשרו לעכבר להתאושש תחת מנורת חימום ולאחר מכן החזירו אותו לכלוב או בצעו בדיקות נוספות. ראשית, אשרו את סינתזת החלקיקים ואת התפלגות הגודל שלהם.

ניתן להעריך באופן איכותי את פרוטוקול הסינתזה של אידוי ממס באמולסיה באמצעות בדיקה ויזואלית של האמולסיות הסופיות. האמולסיות צריכות להיות תגסה הומוגנית ללא אגרגטים נראים לעין. ניתן לאשר את התפלגות גודל החלקיקים באמצעות דיפרקציית לייזר או פיזור אור דינמי; דגימות החלקיקים צריכות להציג התפלגות מונו-מודאלית.

ניתן לבצע הערכה איכותנית נוספת של סינתזת החלקיקים באמצעות שינוי של הפרוטוקול לשילוב של מטען פלואורסצנטי אחד או יותר, כגון פפטיד פלואורסצנטי או צבע ליפופילי. ניתן להשתמש בצבע כדי לאתר ולטרגט את קשרי הלימפה להזרקת החלקיקים. במהלך ההדרכה, ניתן לבצע למעבדי העכברים המתחה (euthanasia) ונתיחה לאחר הזרקת הצבע כדי להכיר את מיקומי קשרי הלימפה. פיזור החלקיקים בתוך אזורי תאי t ותאי b של קשר הלימפה המודבק מאושר באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של חתכים וצביעות של קשרי הלימפה.

ניתן להבחין בהבדלים במאפייני החלקיקים, כגון גודל, בקשרי לימפה לאחר הזרקה ודימות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן להשלימה בתוך יומיים. סינתזת החלקיקים והכנת בעלי החיים מתבצעות ביום הראשון. שטיפת החלקיקים, אפיון והזרקה לתוך קשר הלימפה מבוצעים ביום השני.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשתמש בחומר מעקב או בצבע כדי להדגים ולהזריק לקשריים הלימפה המפשעיים של עכברים. טכניקה זו מאפשרת הובלה לא-כירורגית של נשאי חיסון מביומטריאל ישירות לקשר הלימפה, ברמת שליטה שלא הייתה אפשרית בעבר. הובלה ישירה של ביומטריאלים לקשרי לימפה תאפשר למדענים, למהנדסים ולחוקרי אימונולוגיה ופיתוח חיסונים לחקור את האינטראקציות הבסיסיות של חיסוני ביומטריאלים ואותים חיסוניים עם קשר הלימפה, ובכך לשפוך אור חדש על המנגנונים שבאמצעותם חומרים אלה מעוררים ומעצבים את החסינות.