הזרקת בלוטות תוך-לימפתיות של חלקיקי פולימר מתכלים

המטרה הכוללת של הליך זה היא להפקיד חלקיקי חיסון ביו-חומריים לבלוטות הלימפה באמצעות טכניקת הזרקה ישירה. ראשית, לסנתז את חלקיקי הפולימר המיוצבים בשומנים בשיטת תחליב כפול. לאחר מכן שטפו את החלקיקים ומדדו את תכונות החומר כגון גודל, מטען, העמסה או יציבות.

לאחר מכן, יש לתת צבע עוקב בבסיס הזנב של העכבר כדי לאפשר הדמיה לאחר ניקוז הצבע לבלוטת הלימפה. השלב האחרון הוא לזהות את בלוטת הלימפה המסומנת D ולהזריק נפח קטן של חלקיקי פולימר במיקום זה. ניתן להשתמש בהיסטולוגיה, אימונופלואורסצנציה ומיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לאשר את נוכחותם והפצתם של חלקיקים בבלוטות הלימפה המפשעתיות.

שילוב הזרקה ישירה של בלוטות הלימפה עם ביו-חומרים לחיסון מאפשר בקרה הדוקה על השילובים והמינונים של רכיבי החיסון במיקרו-סביבה של בלוטות הלימפה, ומאפשר שחרור מבוקר של מטען ברקמות אלו. כל החיסונים חייבים להגיע לבלוטות הלימפה כדי להיות יעילים. לכן חשוב להגדיר כיצד ביו-חומרים ורמזים חיסוניים משולבים משפיעים על איתות בלוטות הלימפה המקומיות כדי לקשר את האירועים הללו לתגובה חיסונית מערכתית.

הידע הזה יסייע לנו להבין טוב יותר כיצד חיסונים ביו-חומריים ניתנים בדרכים מסורתיות. למרות שאספקה תוך-בלוטות הלימפה של ביו-חומרים משמשת ככלי לחקר ההשפעות של ביו-חומרים על ארגון בלוטות הלימפה, פלטפורמה זו מספקת גם הזדמנות יישומית לפתח חיסונים טיפוליים חדשים ואימונותרפיות המיועדות לסרטן והפרעות אוטואימוניות. עבור מיקרו-חלקיקים סוניקט, השלב האורגני המכיל את השומן הפולימרי ומטען בלתי מסיס אחר במים על קרח ב-12 וואט.

כדי ליצור את תחליב המים והשמן, הוסף 500 מיקרוליטר של H2O או H2O מזוקק המכיל מיליגרם אחד של חלבון פפטיד או מטען מסיס אחר במים. המשיכו לזנות במשך 30 שניות. נדנד בעדינות את הבקבוקון למעלה ולמטה מצד לצד סביב קצה הטור כדי להבטיח תחליב מלא.

כעת הכינו את המים והשמן בתחליב מים על ידי שפיכת תחליב שמן המים לתוך 40 מיליליטר של H2O הומוגני למשך שלוש דקות ב-16,000 סל"ד. לאחר מכן, הוסיפו מוט ערבוב מגנטי וערבבו את המים והשמן בתחליב מים למשך הלילה כדי להסיר את עודפי הממס לאחר הסרת הממס למשך הלילה. יוצקים את האמולסיה דרך מסננת תאי רשת ניילון של 40 מיקרון לצנטריפוגה של צינור חרוטי של 50 מיליליטר למשך חמש דקות, שופכים את הסופרנטנט, משהים מחדש את כדור החלקיקים במיליליטר אחד של מים ומעבירים את החלקיקים המרחפים לצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.

אוספים את החלקיקים בצנטריפוגה של חמש דקות. מדוד את גודל החלקיקים על ידי עקיפה של לייזר, או פיזור אור. היא נפח המים שנוסף לתא השבר הוא ברמה מספקת ליישור וריקון פיפטה 10 מיקרוליטר של תרחיף חלקיקים לתא השבר.

סגור את דלת תא מנתח גודל החלקיקים. לאחר מכן מדוד את גודל החלקיקים עבור PLGA. השתמש במקדם שבירה של 1.60.

השתמש בממשק התוכנה כדי לחשב את קוטר החלקיקים באמצעות בסיס מספרי יום אחד לפני ההזרקה. להרדים את העכבר על פי פרוטוקול בעלי חיים שאושר על ידי IACUC. העריכו את עומק ההרדמה בעזרת הבוהן.

בדיקות רפלקס צביטה ומעקב אחר הנשימה כדי להבטיח קצב נשימה של 100 עד 120 נשימות בדקה. גלח את השיער בבסיס הזנב וברבע האחורי. הסר את השיער מהצד הגחוני של החיה ולרוחב לצד הגבי ממש מעל מפרק הרגל האחורית.

עבור כל הזרקת צבע, השתמש במיקרו פיפטה כדי להעביר 10 מיקרוליטר של תמיסת צבע לתוך צינור פוגה מיקרו-מרכזי ולשאוף את כל 10 המיקרוליטרים דרך מחט בגודל 31 לתוך מזרק אינסולין של מיליליטר אחד. כעת יש להזריק 10 מיקרוליטר של תמיסת צבע באופן תת עורי בכל צד של בסיס הזנב להעמסה בין הזריקות. מרחו קרם אפילציה עדין כדי להסיר את שאריות השיער.

הקפידו לצפות את האזור שבין הרגל האחורית לבטן. לאחר שלוש דקות, השתמשי ביד רטובה בכפפה עם H two oh חם ושפשפי בעדינות את קרם האפילציה לתוך העור. חזור מיד כדי להסיר את עודפי האפילציה.

לאחר מכן, הרטיבו מטלית רכה או מגבת נייר במים חמים ובתנועה אחת נגבו את החלק התחתון של העכבר. הנח את העכבר מתחת למנורת חום כדי להתאושש ולאחר מכן חזור לאחיזה למשך 12 שעות לפחות. בדוק את העכבר המורדם כדי לאשר ניקוז של עקבות או צבע לכל בלוטת לימפה מפשעתית.

בלוטת הלימפה צריכה להיות גלויה כנקודה כהה ליד הירך האחורית והבטן. כעת החייאת החלקיקים במים מזוקקים בריכוז ההזרקה הרצוי לכל זריקה. השתמש במיקרו פיפטה כדי להעביר 10 מיקרוליטר של תמיסת חלקיקים לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה.

שאפו את כל 10 המיקרוליטרים למחט אינסולין בגודל 31 המחוברת למזרק מיליליטר אחד. משוך את העור מתוח סביב בלוטת הלימפה הצבועה עם המחט בזווית של 90 מעלות לעור. חודרים לעור לעומק של מילימטר אחד.

הזרקו לאט את כל ניטור הנפח להגדלה גלויה של בלוטות הלימפה. אפשר לעכבר להתאושש מתחת למנורת חום ולאחר מכן חזור להחזיק או לבצע בדיקות נוספות. ראשית, אשר את סינתזת החלקיקים והתפלגות הגודל.

ניתן להעריך באופן איכותי את פרוטוקול סינתזת אידוי ממס האמולסיה על ידי בדיקה ויזואלית של האמולסיות הסופיות. שנוצר. תחליבים צריכים להיות תרחיף הומוגני ללא אגרגטים גלויים. ניתן לאשר את התפלגות גודל חלקיקי החלק על ידי עקיפה בלייזר או פיזור אור דינמי דגימות חלקיקים צריכות להציג התפלגות מונו-מודאלית.

להשיג הערכה איכותית נוספת של סינתזת החלקיקים באמצעות שינוי הפרוטוקול לשילוב מטען פלואורסצנטי אחד או יותר, כגון פפטיד פלואורסצנטי או צבע ליפופיל. ניתן להשתמש בצבע כדי לאתר ולמקד את בלוטת הלימפה להזרקת חלקיקים במהלך האימון, עכברים עשויים לעבור המתת חסד ונתיחה לאחר הזרקת צבע כדי להכיר את מיקומי בלוטות הלימפה. התפלגות החלקיקים באזורי תאי t ו-b של בלוטת הלימפה הנגועה מאושרת על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית של בלוטות לימפה חתוכות ומוכתמות.

ניתן להבחין בהבדלים בתכונות החלקיקים כגון גודל בבלוטות הלימפה לאחר הזרקה והדמיה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו על פני יומיים. סינתזת חלקיקים והכנת בעלי חיים מתרחשים ביום הראשון. אפיון שטיפת חלקיקים והזרקה תוך בלוטות הלימפה מבוצעים ביום השני.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ניתן להשתמש בעקבות או צבע כדי לדמיין ולהזריק את בלוטות הלימפה המפשעתיות של עכברים. טכניקה זו מאפשרת אספקה לא ניתוחית של נשאי חיסון ביו-חומרים ישירות לבלוטת הלימפה ברמת שליטה שלא הייתה אפשרית בעבר. אספקה ישירה של ביו-חומרים מבלוטות הלימפה תאפשר למדענים ומהנדסים ולאימונולוגיה ולפיתוח חיסונים לחקור את האינטראקציות הבסיסיות של ביו-חומרים, חיסונים ואותות חיסוניים, כאשר בלוטת הלימפה שופכת אור חדש על המנגנונים שבאמצעותם חומרים אלה מעוררים ומעצבים חסינות.