Nucleofection של neuroblasts מכרסמים לחקר הגירת neuroblast

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע טרנספקציה של נוירובלסטים פוסט-נטאליים ראשוניים ממכרסמים, וזאת כדי לבחון את השפעתם של חלבוני מטרה על נדידתם. דבר זה מושג תחילה על ידי דיסקציה של נוירובלסטים מהזרם הנדיד הרוסטרלי (rostral migratory stream) של גורי מכרסמים. השלב השני כולל את דיסוציאציית התאים וביצוע טרנספקציה באמצעות נוקלאפקציה של DNA או shRNA.

בשלב הבא, הנוירובלסטים מאוגדים מחדש בטיפות תלויות ולאחר מכן גודלים בתרבית סוספנסיות למשך זמן מתאים. השלב הסופי הוא הטמעת מקבצי הנוירובלסטים המאוגדים מחדש במטריצה תלת-ממדית והשארתם לנדידה. לבסוף, נעשה שימוש באימונופלואורסצנציה או במיקרוסקופיית דימוי במרווחי זמן (time-lapse imaging microscopy) כדי לנתח את נדידת הנוירובלסטים.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלה מרכזית בתחום הנוירוגנזה, כגון הבקרה על נדידה של נוירובלסטים המופקים מתאי גזע במוח לאחר הלידה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא קלה ומהירה יחסית בהשוואה לשימוש בווקטורים ויראליים, שעלולים להיות מאתגרים וגוזלי זמן. לאחר הקרבת שגרת חולדות בגילי P6 עד P7, בצע בכל חולדה חתך אחורי בעור לאורך התפר הסגיטלי המרכזי, מהאף ועד למסד, באמצעות להב סכין מנתחים.

בשלב הבא, קלפו את העור. חזרו על אותה חתך לאורך הגולגולת. לאחר מכן, הסירו בעדינות את מעטי הגולגולת באמצעות פינצטה והוציאו בזהירות את המוח יחד עם הבצולות הריחיות בעזרת שפכטל.

לאחר מכן, חתכו את השליש הקודמלי ביותר של המוח והשליכו אותו. לאחר מכן, חתכו את רקמת המוח לפרוסות קורונליות בעובי 1.4 מילימטר באמצעות קוצץ רקמות. העבירו את הפרוסות לצלחית המכילה תמיסת דיסקציה קרה.

לאחר מכן, בחינו את הפרוסות תחת מיקרוסקופ דיסקציה. הפרידו ביניהן בזהירות באמצעות מחט. הזרם הנדיד הרוסטרלי (rostral migratory stream) נראה כאזור שקוף משולש במרכז חתכי ה-OB וכאזור מעגלי קטן.

בפרוסות מוח נוספות, חתכו את ה-RMS מכל פרוסה באמצעות סכין מיקרו-כירורגית, תוך הקפדה להימנע מכלול של רקמה היקפית. לאחר מכן, אספו את רגמני ה-RMS באמצעות פיפטת פלסטיק והניחו אותם בצלחת קטנה המכילה תמיסת דיסקציה קרה על קרח. לאחר מכן, סובבו בעדינות את הצלחת כדי לרכז את רגמני ה-RMS במרכז הצלחת.

אספו את השברים באמצעות פיפטה מפלסטיק והעבירו אותם למבחנה של 15 מיליליטר. השאירו את השברים לשקוע לתחתית המבחנה. החליפו את תמיסת הדיסקציה בשני מיליליטר של תמיסת דיסוציאציה T tri.

העבירו את מקטעי ה-RMS לריסוף על ידי פיפוט עדין של תרחיף המקטעים למעלה ולמטה כ-10 פעמים באמצעות פיפט P 1000. השאירו את המבחנה עם מקטעי הרקמה במקלח מים בטמפרטורה של 37 °C למשך שתי דקות. לאחר מכן, פפטו את התמיסה שוב 10 פעמים וודאו שהמקטעים התפרקו.

לאחר מכן, בטלו את פעילות ה-trypsin על ידי הוספת חמישה מיליליטר של DMEM מחומם מראש עם 10% FCS, וסבבו את תגלי התאים בצנטריפוגה ב-433 ×g למשך חמש דקות. הסירו את עודפי המצע ותלו את משקע התאים על ידי פיפוט עדין בתוך מיליליטר אחד של DMEM מחומם מראש עם 10% FCS, ולאחר מכן הוסיפו ארבעה מיליליטר נוספים מאותו מצע.

לאחר מכן, בצעו ספירת תאים. דרושים לפחות 2.5 times 10 to the sixth תאים עבור כל נוקלאופקציה, בעוד שתוצאות אופטימליות מושגות באמצעות 3 to 4 times 10 to the six תאים לנוקלאופקציה.

סבב את תרחיף התאים בצנטריפוגה במהירות של 433 ×g למשך חמש דקות. לאחר מכן, הסר כמה שיותר מדיום בהליך זה. מיד לאחר מכן, השהה מחדש את משקע התאים בתמיסת nucleo affection לנוירונים של חולדה שהודגרה מראש.

בטמפרטורת החדר, העבירו 100 µL מהסספנסיון התאים לכל מבחנת EOR המכילה SI R-N-A-D-N-A. לאחר מכן, ערבבו בעדינות על ידי פיפטא 2-3 פעמים באמצעות פיפט P 200. לאחר מכן, הוסיפו את הדגימה לתחתית ה-nucle affection vete תוך הקפדה על מניעת היווצרות בועות.

עבור נוקלאפקציה (nucleofection), השתמש בתוכנית G-013 עבור תאי חולדה או O-005 עבור תאי עכבר. לאחר מכן, הוסף במהירות 1 mL של DMEM מקורר עם 10% FCS לדגימה שעברה נוקלאפקציה. העבר את הדגימה למבחנה של 15 mL המכילה 5 mL של DMEM מקורר עם 10% FCS, באמצעות הפיפטה הפלסטית המצורפת לערכת הנוקלאפקציה.

לאחר מכן, סבב את הדגימה בצנטריפוגה ב-433 ×g למשך חמש דקות. הסר בזהירות את כל עודפי המצע והשבה את המשקע לתליה ב-25 עד 30 µL של DMEM שחומם מראש בתוספת 10% FCS באמצעות פיפט P20. אין להשתמש ביותר מ-30 µL של מצע.

לאחר מכן, טפטפו בעזרת פיפט את התו suspension כטיפה על הצד הפנימי של מכסה צלחת P 35. לאחר מכן, הפכו את המכסה מעל צלחת P 35 המכילה two milliliters של מצע גידול מלא. השאירו אותה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide למשך חמש שעות לפחות.

לאחר חמש שעות, העבירו את הטיפות התלויות מהמכסה אל המצע המלא שבצלחת. השתמשו בפיפט P 1000 עם קצה גזוז. לאחר מכן, דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide למשך 24 שעות עבור זיהומי DNA NU nuclear, או למשך 48 שעות עבור זיהומי SI A HRA nucle.

כעת הכינו 25 milliliters של מצע גידול מלא והביאו אותו לשיווי משקל מראש בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide למשך מספר שעות. בינתיים, הוציאו את המנות הקפואות של מטריצת קרום הבסיס מהמקפיא בטמפרטורה של 80- °C והמיסו אותן על קרח בחדר הקירור. עבור כל הטרנספקציה של הגרעין, הכינו צלחת של שישה סנטימטרים המכילה עד שמונה לביבות סטריליות של 13 millimeter.

הניחו את הצלחות על קופסת קרח מכוסה בניילון נצמד. כדי לשמור על הלחות, הניחו רצועת נייר סופג לחה בתוך צלחת של 15 סנטימטר, שתשמש להחזקת עד שלוש צלחות של שישה סנטימטר המכילות oblasts מוטמעים בברכיים. לאחר מכן, הוסיפו את המדיום המלא למטריצת ה-haw ביחס של 1:3, העבירו את מקבצי התאים שעברו ר-אגרגציה למבחנה של 15 מיליליטר וסבבו אותה בצנטריפוגה במהירות של 433 ×g למשך חמש דקות.

לאחר מכן, הסיר את עודפי המצע והשהה מחדש את המשקע ב-10 µL של מצע מלא. לאחר מכן, הנח 2 µL של תרחיף אגרגטי תאים על כל לבישת כיסוי סטרילית. הוסף 18 µL של תערובת מצע מטריקס מלא והשתמש בקצה הפ pipette כדי לפרוס את המטריקס על פני כל הלבישה.

החליקו מיד את הצלחת בקוטר 6 ס"מ המכילה את לביבות הזכוכית (cover slips) לתוך הצלחת בקוטר 15 ס"מ. העבירו את הצלחת לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide למשך 15 עד 20 דקות. לאחר שהמטריקס התגבש, הוסיפו בעדינות 5 mL של מצע גידול מלא לכל צלחת בקוטר 6 ס"מ, ודחפו כל לביבת זכוכית צפה בעזרת קצה הפיפטה; לאחר מכן דגרו למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbogen כדי לאפשר לנוירובלסטים לנדוד החוצה מאגרגטי התאים.

באיור זה, תאי RMS מבודדים של חולדה מוצגים כחיוביים אימונולוגית לסמני נוירובלסטים נדדים DCX ו-beta three tubulin. ואיור זה מראה כי סמני נוירובלסטים נדדים DCX ו-PSA NCA באים לידי ביטוי בתאים הנודדים החוצה מ-RMS של עכבר. להסבר על טרנספקציה גרעינית של נוירובלסטים של עכבר: נוירובלסטים מפוזזים מ-RMS של עכבר עברו טרנספקציה גרעינית עם GFP, אגרגו מחדש, הוטמעו במטריקס תלת-ממדי והושארו לנדוד למשך שש שעות.

נוירובלסטים הנודדים החוצה מצביר תאים שעבר ר-אגרגציה מראים יעילות טרנספקציה גבוהה. כאן, נוירובלסטים של חולדה הוטרנספקטו בשני פלסמידים שונים המקודדים ל-GFP, עברו ר-אגרגציה בתוך מטריקס והושארו לנדוד למשך 24 שעות. לאחר מכן, התאים קובעו ועברו צביעה אימונוהיסטוכימית ל-GFP ול-beta three tubulin כדי למדוד את מרחק הנדוד.

צביר התאים המרוכז מחולק לשישה מגזרים שווים, והמרחק בין קצה הצביר לתא שהגרה למרחק הרחוק ביותר נמדד עבור כל מגזר. איור זה מציג את הכימות של המרחק היחסי שנדדו תאי NUCLE מושפעים חיוביים ל-GFP ותאי ביקורת שאינם מושפעים מ-NUCLE ושליליים ל-GFP, כדי לנטר את נדירת הנוירובלסטים. לאחר השפעת S-H-R-N-A Nucle, נוירובלסטים של חולדה הושפעו על ידי וקטור S-H-R-N-A ביקורת או על ידי אותו וקטור המכיל רצף מטרה ל-HRNA עבור חלבון actin bundling; התאים הורכבו מחדש במשך 48 שעות בתוך מטריקס והושארו לנדוד במשך 24 שעות.

לאחר מכן, הצבירים קובעו ונצבעו אימונו-היסטוכימית עבור GFP ו-beta three tubulin. ניתן לזהות דלטור (depletion) יעיל של fasten כ-50 שעות לאחר הדבקת גרעיני S-H-R-N-A באמצעות ניתוח Western Blot, כאשר Actin מוצג כאן כבקרת טעינה. להלן הניתוח הכמותי של מרחק הנדידה היחסי, המראה כי דלטור של fastened פוגע באופן משמעותי בנדידת נוירובלסטים.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון אלקטרופורציה פוסט-נטלית, כדי לתקף in vivo את התוצאות שהתקבלו באמצעות בדיקת הנדידה NU Nuclear Affection.