Nucleofection של neuroblasts מכרסמים לחקר הגירת neuroblast במבחנה

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעביר נוירובלסטים ראשוניים של מכרסמים לאחר הלידה על מנת לבחון את ההשפעה של חלבוני מטרה על נדידתם. זה מושג על ידי ניתוח ראשון של נוירובלסט מזרם הנדידה הרוסטרלי של המכרסמים. השלב השני הוא לנתק אותם ולהעביר אותם על ידי חיבה גרעינית עם DNA או S-H-R-N-A.

לאחר מכן, הנוירובלסטים נצברים מחדש בטיפות תלויות ולאחר מכן מתורבתים בתרחיף לזמן מתאים. השלב האחרון הוא להטמיע את אשכולות הנוירובלסטים המצטברים מחדש במטריצה תלת מימדית ולהשאיר אותם לנדוד. בסופו של דבר, מיקרוסקופ אימונופלואורסצנציה או הדמיה של זמן-lapse משמש לניתוח נדידת נוירובלסטים.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת מפתח בתחום הנוירוגנזה, כגון שליטה בנדידת נוירובלסטים שמקורם בתאי גזע במוח שלאחר הלידה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא קלה ומהירה יחסית לשימוש בווקטורים ויראליים, מה שיכול להיות מאתגר וגוזל זמן. לאחר הקרבת חולדה P 6 עד P 7, בצע חתך אחורי בעור לאורך התפר הסגיטלי האמצעי מהאף למוח הקטן עם להב אזמל על כל חולדה.

לאחר מכן, קלף את העור. חזור על אותו חתך לאורך הגולגולת. לאחר מכן הסר בעדינות את דשי הגולגולת בעזרת מלקחיים והסר בזהירות את המוח יחד עם נורות הריח בעזרת מרית.

לאחר מכן, חתכו את השליש הכי מפנק של המוח והשליכו אותו. לאחר מכן, קוצצים את רקמת המוח לפרוסות קורונליות בעובי 1.4 מילימטר באמצעות קוצץ רקמות. מעבירים את הפרוסות לכלי המכיל מדיום חיתוך קר.

לאחר מכן צפו בפרוסות תחת מיקרוסקופ החיתוך. הפרד אותם בזהירות באמצעות מחט. הנחל הנודד הרוסטרלי מופיע כאזור שקוף משולש במרכז קטעי OB וכאזור מעגלי קטן.

בפרוסות מוח מפנקות יותר, חתכו את ה-RMS מכל פרוסה בעזרת סכין מיקרו-כירורגית תוך הקפדה להימנע מהכללת הרקמות שמסביב. לאחר מכן, אספו את שברי ה-RMS בעזרת פיפטה מפלסטיק והניחו אותם בכלי קטן המכיל מדיום חיתוך קר על קרח. לאחר מכן סובב בעדינות את המנה כדי לאסוף את שברי ה- RMS במרכז המנה.

אוספים את השברים בעזרת פיפטה מפלסטיק ומעבירים אותם לצינור של 15 מיליליטר. השאירו את השברים להתיישב בתחתית הצינור. החלף את מדיום הדיסקציה בשני מיליליטר של מדיום דיסוציאציה T tri.

דרג את שברי ה-RMS על ידי פיפטינג עדין של מתלה השבר למעלה ולמטה כ-10 פעמים באמצעות פיפטה P 1000 לאחר מכן. השאירו את הצינור עם שברי הרקמה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. לאחר מכן, פיפטה את התמיסה שוב 10 פעמים וודא שהשברים התנתקו.

לאחר מכן השבת את הטריפסין על ידי הוספת חמישה מיליליטר של DMEM מתולע מראש בתוספת 10% FCS וצנטריפוגה של תרחיף התא ב-433 פעמים G למשך חמש דקות. הסר את המדיום העודף והחייאה. השעו את גלולת התא על ידי פיפטינג בעדינות במיליליטר אחד של DMEM חם מראש בתוספת 10% FCS, ולאחר מכן הוסיפו עוד ארבעה מיליליטר מאותו מדיום.

לאחר מכן בצע ספירת תאים. נדרשים מינימום של 2.5 כפול 10 עד שישי תאים לכל חיבה גרעינית תוך השגת תוצאות מיטביות. שימוש בשלוש עד ארבע פעמים 10 לששת התאים לכל חיבה גרעינית.

צנטריפוגה את מתלה התא ב -433 פעמים G למשך חמש דקות. לאחר מכן, הסר כמה שיותר מדיום בהליך זה. מיד החייאה, השעו את כדור התא בתמיסת החיבה של נוקלאו נוירון החולדה שהודגרה בעבר.

בטמפרטורת החדר, העבירו 100 מיקרוליטר מתרחיף התא לכל צינור EOR המכיל SI R-N-A-D-N-A. לאחר מכן מערבבים אותו בעדינות על ידי פיפטה פעמיים-שלוש עם פיפטה P 200. לאחר מכן, הוסף את הדגימה לתחתית ווט החיבה הגרעינית תוך הקפדה להימנע מיצירת בועות כלשהן.

עבור חיבה גרעינית השתמש בתוכנית G dash 0 1 3 עבור תאי חולדה או O dash 0 0 5 עבור תאי עכבר. לאחר מכן, הוסף במהירות מיליליטר אחד של DMEM לפני המלחמה בתוספת 10% FCS לדגימה המושפעת מהגרעין. העבירו את הדגימה לצינור של 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של DMEM לפני המלחמה בתוספת 10% FCS באמצעות פיפטת הפלסטיק המסופקת על ידי ערכת חיבה גרעינית.

לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימה ב -433 פעמים G למשך חמש דקות. הסר בזהירות את כל המדיום העודף והשהה מחדש את הגלולה ב-25 עד 30 מיקרוליטר של DMEM לפני המלחמה בתוספת 10% FCS באמצעות פיפטה P 20. אל תשתמש ביותר מ -30 מיקרוליטר של מדיום.

לאחר מכן, פיפטה את המתלה כטיפה על הצד הפנימי של מכסה צלחת P 35. לאחר מכן הפוך את המכסה מעל צלחת P 35 המכילה שני מיליליטר של מדיום שלם. השאירו אותו בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך חמש שעות לפחות.

לאחר חמש שעות, העבירו את הטיפות התלויות מהמכסה למדיום השלם במנה. בעזרת פיפטה P 1000 עם קצה חתוך. לאחר מכן דגרו את הדגימות ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות עבור זיהומים גרעיניים של DNA NU, או 48 שעות עבור השפעות גרעין SI A HRA.

כעת הכינו 25 מיליליטר של בינוני שלם ושיווי משקל מראש ב -37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך מספר שעות. בינתיים, הוציאו את הכמויות הקפואות של מטריצת קרום המרתף מהמקפיא השלילי של 80 מעלות צלזיוס והפשירו אותם על קרח בחדר הקירור. לכל חיבה גרעינית, הכינו צלחת של שישה סנטימטרים המכילה עד שמונה פתקי כיסוי סטריליים של 13 מילימטר.

מניחים את הכלים על קופסת קרח מכוסה בניילון נצמד. כדי לשמור על לחות, הניחו רצועה של טישו לח בתוך צלחת של 15 ס"מ שתשמש להחזקת עד שלושה כלים באורך שישה סנטימטרים המכילים אובלסטים משובצים בברך. לאחר מכן, הוסף את המדיום השלם למטריצת האו ביחס של אחד לשלוש, העביר את אשכולות התאים המצטברים מחדש לצינור של 15 מיליליטר וצנטריפוגה אותו 433 פעמים G למשך חמש דקות.

לאחר מכן, הסר את המדיום העודף והשהה מחדש את המזרן ב -10 מיקרוליטר של מדיום שלם. לאחר מכן הנח שני מיקרוליטר של תרחיף מצטבר תאים על כל החלקת כיסוי סטרילית. מוסיפים 18 מיקרוליטר של תערובת בינונית שלמה של מטריצה ומשתמשים בקצה הפיפטה כדי לפזר את המטריצה על כל הכיסוי.

החלק מיד לאחר הנחת צלחת שישה סנטימטרים המכילה את החלקות הכיסוי בצלחת 15 סנטימטר. מעבירים את המנה לחממה בחום של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 15 עד 20 דקות. לאחר שהמטריצה התמצקה, הוסיפו בעדינות חמישה מיליליטר של מדיום שלם לכל צלחת של שישה סנטימטרים ודחפו כלפי מטה את כל החלקות הכיסוי הצף עם קצה הפיפטה ואז דגרו למשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% קרבוגן כדי לאפשר לנוירובלסט לנדוד החוצה מצברי התא.

באיור זה, תאי RMS של חולדות מבודדים הוכחו כחיוביים חיסוניים לסמני הנוירובלסטים הנודדים DCX ובטא שלוש טובולין. והאיור הזה מראה שסמני הנוירובלסטים הנודדים DCX ו-PSA NCA באים לידי ביטוי בתאים הנודדים החוצה מהעכבר. RMS Explan עבור עכבר Neuroblast Nu חיבה גרעינית, עכבר מנותק RMS Neuroblast הושפעו מהגרעין עם GFP מחדש שנצבר במטריצה תלת מימדית ואפשר לנדוד במשך שש שעות.

הנוירובלסט הנודד מתוך אשכול תאים מצטבר מחדש מראה יעילות טרנספקציה גבוהה. כאן, נוירובלסטים של חולדות הושפעו מהגרעין עם שני פלסמידים שונים המקודדים GFP מחדש שנצברו במטריצה והושארו לנדוד למשך 24 שעות. לאחר מכן התקבעו התאים וקיבלו חיסון עבור GFP ובטא שלוש טובולין כדי למדוד את מרחק הנדידה.

אשכול התאים המצטבר מחולק לשישה מגזרים שווים והמרחק בין קצה האשכול לתא הנודד הרחוק ביותר נמדד עבור כל מגזר. איור זה מציג את כימות המרחק היחסי שהועבר על ידי התאים המושפעים מ-GFP חיובי ל-NUCLE ולשלוט בתאים שליליים שאינם מושפעים מ-GFP כדי לנטר את נדידת הנוירובלסטים. לאחר S-H-R-N-A נוירובלסטים של חולדות עם חיבה גרעינית הושפעו מהגרעין עם וקטור ביקורת S-H-R-N-A או אותו וקטור המכיל תאי חלבון מהדקים ואקטין של מטרת HRNA נצברו מחדש במשך 48 שעות הוטמעו במטריצה והושארו לנדוד למשך 24 שעות.

לאחר מכן תוקנו אגרגטים וכתם חיסוני עבור GFP ובטא שלוש טובולין. ניתן לזהות דלדול הידוק יעיל 50 שעות לאחר חיבה של גרעיני S-H-R-N-A על ידי Western Blood Analysis ו-Acton מוצגת כאן כבקרת העמסה. להלן הניתוח הכמותי של מרחק הנדידה היחסי המראה כי דלדול מהודק פוגע באופן משמעותי בנדידת נוירובלסטים.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אלקטרופורציה לאחר הלידה כדי לאמת in vivo את התוצאות המתקבלות עם מבחן ההגירה של NU Nuclear Affection.