הערכת myogenic תגובה וVasoactivity בעורקי ההתנגדות mesenteric שימוש Myography לחץ

המטרה הכללית של הליך זה היא לקבוע את ההשפעה של סוכן פרמקולוגי או מצב מחלה על טונוס כלי דם המושרה על ידי לחץ בעורקים מזנטריים קטנים בעלי התנגדות. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד הקשת המזנטרית ממודל עכברי. השלב השני הוא דיסקציה של עורקי התנגדות קטנים מסדר רביעי.

השלבים הבאים הם הקניולציה, ההלחצה וההדגרה של ההכנה העורקית. ב-PSS, השלב הסופי הוא להעריך את השלמות הפיזיולוגית של ההכנה העורקית, המודגמת על ידי התפתחות ספונטנית של טונוס כלי דם ותגובה הפיכה מתאימה למכבץ כלי דם (vasoconstrictor) ולמרחיב כלי דם (vasodilator). לבסוף, ניתן למדוד התכווצות המושפעת מלחץ.

השלכות של טכניקה זו חלה על טיפול או אבחון של יתר לחץ דם, תת לחץ דם או תפקוד לקוי של כלי הדם. זאת מכיוון שטכניקה זו מזהה מנגנונים מרכזיים העומדים בבסיס שינויים בטון כלי הדם המושרים על ידי לחץ, המהווה גורם מכריע להתנגדות כלי דם, פרפוזיה ולחץ דם. הליך זה יודגם על ידי ד"ר Jja, עמית פוסט-דוקטורט במעבדתנו.

התחל את הפרוצדורה על ידי טעינת קנולה מזכוכית לתוך מחזיק מיקרו-פיפט, וחיבור מחזיק המיקרו-פיפט לתא פרפוזיה לצורך הכנת תא הפרפוזיה. שטוף אותו עם מי Milli Q, ולאחר מכן עם תמיסת דיסקציה למשך חמש דקות כל אחת. לאחר מכן, טען את התא עם 2 mL של תמיסת דיסקציה.

בשלב הבא, מלאו בזהירות את כל הקנולה ואת הפיתול המחובר אליה, ללא יצירת בועות. הכינו שתי תפרים, כל אחד עם חצי קשר, באמצעות פינצטה קהה תחת מיקרוסקופ דיסקציה. השתמשו בפינצטת דיסקציה כדי להטעין את שתי הקנולות עם קשרי התפרים הסגורים חלקית, במרחק קצר מהקצה.

בשלב הבא, בצעו לפרוטומיה בקו האמצע בחולדה שהורדמה, מאזור האגן ועד לעצם החזה, על ידי ביצוע חתך בעור ולאחר מכן חתך בשכבת השריר שמתחתיו. יש להקפיד לא לפגוע באיברים התוך-בטניים. קשרו את שני הקצוות בנפרד כדי למנוע דליפה של כימוס וצואה, ובכך להימנע מזיהום של תמיסת הרחצה החוץ-תאית.

לאחר מכן, גזרו את הקצה הפרוקסימלי של המעי קרוב לנקודות הפורים ואת הקצה הדיסטלי, קרוב לחיבור האיליו-צקלי. לאחר מכן, בצעו חתך במזנטריון בבסיסו, סמוך לכלי הדם המזינים. בשלב הבא, העבירו את כל מיטת המזנטריון של המעי הדק לכוס כימית של 50 מיליליטר המכילה תמיסת דיסקציה קרה מאוד (בקרח) והנחיתו לה להשקייה למשך חמש דקות.

לאחר מכן, שטפו את האיבר בתמיסת דיסקציה טרייה כדי להסיר את הדם. כעת, קבעו בעזרת סיכות את הקצה הפרוקסימלי של המעי בצד ימין בתוך צלחת מצופה ב-sard, והוסיטו את שאר המעי במסלול נגד כיוון השעון. קבעו את המקטע בעזרת סיכות כדי לפרוש את המזנטריום ולחשוף את כלי הדם תחת מיקרוסקופ סטריאו עם זום.

בצעו דיסקציה של עורקי המזנטרום הקטנים מסדר שלישי ורביעי המקבילים למעי הדק, תחילה על ידי הסרת כל השומן המכסה בקרבת הענף מסדר שני. לאחר מכן, בצעו דיסקציה של הווריד ובודדו את העורק עם נקודת פיצול בצורת V. יש להיזהר לא לנקב את המקטע שנבחר.

בשלב הבא, בודדו מקטע של ארבעה עד חמישה מילימטרים מהעורק המקביל למעי הדק. חתכו את כל ענפי הסדר החמישי החודרים למעי הדק במרחק קצר ממקור הענפים ושמרו על חלקם. חלקים אלו ישמשו כנקודות אחיזה להעברת מקטעי העורק לתא פרפוזיה ויסייעו לאחר מכן בקנולציה שלהם.

לאחר מכן, חתכו את מקטעי העורקים על ידי ביצוע שני חתכים דיסטלית לענפי סדר חמישי בכל צד של העורק והעבירו אותם לתא הפרפוזיה. קנולו קצה אחד של כלי הדם על מיקרו-פיפטת זכוכית תוך החזקת קצהו של מקטע העורק בעזרת פינצטה לדיסקציה. החליקו את התפר שנטען מראש וחלקית סגור אל הקצה המקנול והדקו אותו.

בשלב הבא, חברו למסגרת של הסטופקוק המחוברת לקנולה זו מזרק בנפח 10 milliliter הטוען תמיסת דיסקציה. הרימו את המזרק בעדינות. כוח הכבידה הפועל על התמיסה יסיר את הדם התוך-כלי מקצהו הפתוח של כלי הדם.

לאחר הוצאת הדם העורקי, סגרו את הברז (stop cock). כעת קשרו את הקצה הדיסטלי של כלי הדם לקנולה מזכוכית שנייה, על ידי הבאת הקנולה השנייה בזהירות קרוב ככל האפשר לקצה הלא קשור של המקטע העורקי. החליקו את התפר שהוטען קודם לכן והיה סגור חלקית אל הקצה המקנול, והדקו אותו.

יש להקפיד שלא למתוח או למשוך את מקטעי העורקים ולוודא שברזי העצירה המחוברים לשתי הקנולות סגורים. העבירו את תא הפרפוזיה לבמה של המיקרוסקופ ההפוך המצויד בהקלטת וידאו חיה. לאחר מכן, חברו את ברז העצירה של הקנולה הקשורה לקצה הפרוקסימלי של מקטע העורק להתקן לוויסות לחץ הנשלט על ידי סרוו.

וודאו שהברז המחובר לקנולה השנייה נשאר סגור כדי לשמור על לחץ תו-לומנלי יציב. לאחר מכן, חברו את צינור הוואקום לצינור הפרפוזיה ואת פתח השאיבה לפתח הפרפוזיה של התא. התחילו בביצוע פרפוזיה לכלי הדם באמצעות PSS חם דרך מחמם התמיסה התור (inline) בקצב של 2 mL לדקה.

בעזרת משאבה פריסטלטית, הפעל את הוואקום כאשר טמפרטורת ה-PSS בתא קרובה ל-37 °C. העלה לאט את הלחץ האינטרלומנלי מ-20 ל-100 mmHg. בדוק אם יש דליפות בכלי באמצעות הגדרת הלחץ האוטומטית של ווסת הלחץ.

לאחר מכן, יש לבחון את מקטע העורקי לאיתור כיפופים תוך שמירה על לחץ של 100 millimeters of mercury. באמצעות מנוף הבורג, הזז את הקנולה כדי ליישר את המקטע העורקי, והימנע ממתיחה יתר של המקטעים העורקיים. לאחר מכן, הפחת את הלחץ ל-70 millimeters of mercury כדי לדמות את הלחץ in vivo בקשת המזנטרלית (mesenteric arcade), ואפשר למקטע העורקי להתייצב ולפתח טונוס מיוגני.

בנוהל זה, יש לבחון את העורק באמצעות עדשה אובייקטיבית 10 x תחת מיקרוסקופ המצויד במצלמת וידאו מונוכרומטית. חברו את המצלמה למכשיר. מדדו את קוטר הלומן באמצעות תוכנת תפיסת פריימים של וידאו (video frame grabber) ומערכת לזיהוי קצוות בזמן אמת.

לאחר מכן, רשמו את קוטר כלי הדם ועקבו אחר התפתחות הטון המיוגני. לאחר זאת, הפחיתו את הלחץ ל-20 millimeters of mercury והמתינו להתייצבות הקוטר. לאחר מכן, הגבירו את הלחץ האינטרלומינלי בצעדים מדורגים כגון 20, 40, 60, 80 ו-100, והמתינו להשגת קוטר יציב של העורק בכל רמת לחץ.

בשלב הבא, חזרו על תגובת הלחץ ב-PSS נטול סידן המכיל 0.39 millimolar EGTA ו-0.1 millimolar sodium nitropress כפי שמוצג ברישום; קוטרם של עורקים מסנטריים קטנים מחולדות קטן באופן ספונטני כאשר הם נמצאים בלחץ של 70 millimeters of mercury, והוספה של one micromolar acetylcholine הגדילה את הקוטר לקוטר קרוב לקוטר ההתחלתי. הוספה של one micromolar phenylephrine לאמבט הרקמה הקטינה את קוטר העורק, ואיור זה מראה כי דגירה של עורקים מסנטריים קטנים ב-PSS נטול סידן מגדילה את קוטר העורק. קוטרו של מקטע עורקי בודד בלחצים שונים מוצג בטבלה זו.

כאן נמדד קוטר העורקי באופן רציף בעוד שהלחץ התוך-לומנלי מועלה באופן הדרגתי בנוכחות PSS ו-PSS נטול סידן. כאן מוצגות העקומות של קוטר העורקי שהושג בכל שלב של הלחץ, והגרף של הטון המיוגני שהושג בכל שלב של הלחץ מוצג כאן. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו מעריכים התנהגות מיוגנית של עורקי התנגדות קטנים.

בעקבות טכניקה זו, ניתן לבצע הליכים נוספים כגון פגיעה באנדותל (endothelial disruption) וחדירות עורקים (arterial permeation). שני הליכים אלו יכולים לספק תשובות לשאלות נוספות בנוגע לתפקידו של האנדותל והסידן בבקרה של טונוס וסקולרי בעורקי התנגדות קטנים.